Co je to genové inženýrství?- definice, typy, proces a použití
„Molekulárně genetická technika používaná k přímé manipulaci, změně nebo modifikaci genů nebo genomu organismů za účelem manipulace s fenotypy se nazývá genové inženýrství.“
Nebo jinými slovy můžeme říci:
„Genové inženýrství je technika, pomocí které lze měnit genetické složení organismu.“
Tato technika se často označuje jako genetická manipulace, genetická modifikace nebo genetické úpravy, obecně se řadí do kategorie genetického inženýrství.
Při této technice se konstruuje rekombinantní DNA, která se pomocí vektoru vloží do genomu hostitele. Nebo můžeme z genomu odstranit některé mutantní sekvence. První rekombinantní DNA zkonstruoval Paul Berg v roce 1972.
Pomocí techniky genového inženýrství lze konstruovat geneticky modifikované organismy, které jsou pro nás ekonomicky velmi důležité.
Používá se k produkci vylepšených druhů rostlin, terapeutických léčiv nebo proteinů, k prevenci dědičných genetických poruch a ke konstrukci geneticky modifikovaného organismu.
V tomto článku bude naším hlavním pojednáním genetické inženýrství a jeho aplikace. Obsahem článku je,
- Co je to genové inženýrství
- Definice
- Historie
- Typy
- Proces
- Použití genového inženýrství
- Omezení genového inženýrství
- Závěr
.
Klíčová témata:
Lidé již dlouho manipulují s genetickým materiálem mnoha organismů. Pomocí selektivního šlechtění a křížové hybridizace u nás vznikly hospodářsky významné druhy rostlin.
Účelem rozvoje genového inženýrství neboli techniky genetické manipulace je vytvořit organismy nebo fenotypy, které jsou pro nás užitečné. Techniky genového inženýrství se používají pro,
- Konstrukci geneticky modifikovaných druhů rostlin.
- Vytváření rostlinných druhů odolných vůči antibiotickým a biotickým stresům.
- Hospodářsky významné druhy rostlin
- Komerčně cenný organismus
- Pro výrobu terapeutických léčiv
- Pro prevenci genetických abnormalit.
„Při genetickém inženýrství se kombinuje DNA dvou různých buněk a vkládá se do genomu hostitele prostřednictvím vektoru.“ Zde jsou vysvětleny důležité součásti pokusů s genovou manipulací.
Gen zájmu: Sekvence DNA, kterou chceme vložit do cílových buněk.
Vektor: Pomocí plazmidové DNA podobné vektorům se gen zájmu vloží do genomu hostitele. Vektory jsou jakési vehikuly, které přenášejí genetický materiál.
Cílové buňky: cílové buňky jsou populace buněk, jejichž genom chceme manipulovat nebo změnit.
Obecný proces genové terapie.
Definice:
Cíle genové terapie:
„Technika používaná k vložení nebo odstranění mutantního genu nebo k manipulaci s genomem organismu se nazývá genové inženýrství.“
Historie genového inženýrství:
Termín genetické inženýrství poprvé použil spisovatel vědeckofantastických románů, nikoliv nějaký vědec. V roce 1951 Jack Williamson poprvé použil termín „genetické inženýrství“ ve svém románu „Dračí ostrov“.
Brzy poté byla molekulární struktura DNA objevena Watsonem a Crickem, ačkoli genetické pokusy byly populární již od dob Mendela.
První rekombinantní DNA sestrojil Paul Berg v roce 1972. V témže roce provedli Herbert Boyer a Stanley Cohen pokusy s přenosem genů. V roce 1974 vytvořil Rudolf Jaenisch poprvé v historii genetiky geneticky modifikované myši.
Po Rudolfově úspěchu byl v roce 1976 vyvinut geneticky modifikovaný neboli geneticky upravený druh rostliny tabák.
V tomto období (mezi lety 1960 a 1990) byly objeveny techniky podobné restrikčnímu štěpení, ligaci a PCR, které daly křídla technologii genového inženýrství.
Související článek:
Typ technik genového inženýrství:
Rekombinantní DNA- Technologie rekombinantní DNA je typem technologie genového inženýrství, při níž je umělá molekula DNA vytvořena ligací dvou různých DNA pomocí fyzikálních metod. Za tímto účelem se do plazmidového vektoru vloží gen, který je předmětem zájmu, a použije se pro experimenty s přenosem genů.
Přenos genu – technika přenosu genu se používá pro vložení zájmového genu do genomu hostitele.
Elektroforace, solicitační a virovým vektorem zprostředkovaný přenos genu, lipozomem zprostředkovaný přenos genu, transpozonem zprostředkovaný přenos genu jsou některé z metod, které se k tomu používají.
Editace genů – technika editace genů se používá k úpravě genomu, při níž se odstraní nežádoucí sekvence DNA nebo se do genomu hostitele může vložit nový gen. CRISPR-CAS9, TALEN a ZFN jsou některé známé nástroje pro úpravu genů používané při experimentech s genovou terapií.
Přečtěte si více: Co je to editace genů a CRISPR-CAS9?
Proces genového inženýrství:
Technika genového inženýrství se používá k mnoha různým účelům, proto se musíme nejprve rozhodnout, jaký je účel experimentu. Celý proces genového inženýrství lze rozdělit do 5 širších kroků:
- Výběr a izolace kandidátního genu
- Výběr a konstrukce plazmidu
- Transformace genu
- Vložení DNA do genomu hostitele
- Potvrzení vložení
Výběr a izolace kandidátního genu:
Gen musí obsahovat sekvenci DNA, kterou chceme studovat, a k tomu má gen některé zvláštní vlastnosti. Kandidátský gen by měl mít vysoký obsah GC a nižší repetitivní sekvenci DNA.
Kromě toho nesmí být gen, který nás zajímá, příliš dlouhý – lze úspěšně vložit pouze geny o velikosti několika kb. Delší gen má vyšší šanci na neúspěch. Kandidátský gen musí mít v sobě start a stop kodon. Související článek: Co je to genetický kód?
Nyní lze gen zájmu izolovat od zbytku DNA buď restrikčním štěpením, nebo polymerázovou řetězovou reakcí.
Restrikční endonukleázy jsou bakteriální enzymy, které mají schopnost trávit sekvenci DNA na určitém místě. Pomocí specifického typu restrikční endonukleázy můžeme vystřihnout a izolovat náš zájmový gen.
Metoda restrikčního trávení je vysvětlena v našem předchozím článku: Co je restrikční štěpení?
Při polymerázové řetězové reakci se na základě informace o sekvenci genu amplifikuje v termocykleru gen, který nás zajímá, nebo kandidátní gen.
Zařízení pomocí polymerázové řetězové reakce vytvoří miliony kopií genu našeho zájmu. Procesem elektroforézy v agarózovém gelu se amplifikovaný gen izoluje.
Pokud je gen našeho zájmu dobře prozkoumán, dříve, pak je informace o genu přístupná v genetické knihovně a můžeme ji použít pro umělou syntézu genu našeho zájmu. (pomocí informace z genetické knihovny lze gen také uměle syntetizovat)
V dalším kroku proveďte purifikaci DNA, pokud je to nutné. Nyní je naše DNA připravena k vložení do plazmidu.
Selekce a konstrukce plazmidu:
Výběr plazmidu pro experiment genového inženýrství je jedním z klíčových kroků celého experimentu. Před výběrem plazmidu musíme pochopit, proč se plazmid při pokusech s přenosem genů používá.
Plasmidová DNA je kruhová, dvouřetězcová cytoplazmatická DNA bakterií, která se nezávisle replikuje.
Vědci ji používají jako prostředek pro přenos genu, který je předmětem zájmu, na cílové místo v genomu. Dokáže účinně přenést gen na cílové místo. Struktura plazmidu je vysvětlena na obrázku níže,
Obecná struktura plazmidové DNA používané v technologii rekombinantní DNA.
Související článek: Co je to plazmid?
Příprava plazmidu:
Vyberte si plazmid, který je vhodný pro váš experiment.
Plasmid musí mít původ replikace, promotorovou oblast, gen rezistence k antibiotikům a další důležité sekvence. Pomocí metody restrikčního štěpení se do plazmidu zavede místo pro vložení, na které se liguje náš zájmový gen.
Pomocí ligázy T4 DNA, která se podobá silovému tmelu, se do plazmidu vloží a podváže DNA našeho zájmu. Spolu s plazmidem je do plazmidové DNA zaveden také selekční marker, který slouží k identifikaci rekombinantní DNA.
Kromě toho je do plazmidu vložena také promotorová oblast a terminátorové sekvence pro účinnou expresi genu našeho zájmu. Plazmid s naším zájmovým genem a některými dalšími důležitými sekvencemi se nyní označuje jako molekula rekombinantní DNA.
Nyní je naše rekombinantní DNA připravena k expresi.
Pokud provádíme klonování genu, než se plazmid vloží do bakteriálního hostitele, k čemuž se obecně běžně používají E.Coli. Jakmile se bakterie začne dělit, replikuje se spolu s ní i naše rekombinantní plazmidová DNA.
Nyní máme několik kopií naší plazmidové DNA, které jsou extrahovány pomocí soupravy pro extrakci plazmidové DNA a použity pro transformační experimenty.
Proces genového inženýrství.
Transformace do genomu hostitele:
Přenos rekombinantní DNA do přijímající buňky nebo hostitelského genomu je dalším zdlouhavým a obtížným úkolem. Pro různé typy buněk se používají různé metody pro vložení rekombinantní DNA, protože jedinou metodu nelze použít pro všechny typy buněk.
Různé metody transformace:
Použití stresu – bakterie snadno přijmou plazmidovou DNA pomocí některých stresových faktorů, jako je teplo nebo elektrická ponožka.
Mikroinjekce- pro vložení DNA přímo do jádra buňky se používá ostrá jehla, tato metoda je však méně účinná a vyžaduje k tomu vyšší úroveň odborných znalostí.
Elektroporace- jednou z nejlepších metod, která má velkou úspěšnost, je metoda elektroforace, při níž je rekombinantní DNA vložena do genomu hostitele prostoupením buňky elektrickým proudem.
Podrobně jsme se jí věnovali v celém článku. Přečtěte si ho zde:
Sonikace – sonikace je další dobrou metodou, která se někdy používá v experimentu s přenosem genů a při níž se rekombinantní DNA vkládá do cílové buňky pomocí ultrazvukových vln. Ultrazvukové vlny rovněž zvyšují propustnost buněk.
Přenos genů zprostředkovaný liposomy – pomocí umělého vnějšího obalu podobného buňce, známého jako liposom, lze do genomu hostitele vložit rekombinantní DNA.
Přenos genu pomocí bakteriální infekce- Tato metoda je jednou z oblíbených metod a běžně se používá při experimentech s genovým inženýrstvím rostlin. Zde je rostlinný druh infikován transformovanou bakterií pro vložení zájmového genu.
K vložení rekombinantní DNA do rostlinné buňky se využívá bakterie Agrobacterium tumifecian. Do Ti-plazmidu bakterie Agrobacterium se vloží zájmový gen. Rostlinné buňky jsou infikovány touto bakteriální kulturou a transformované buňky jsou regenerovány metodami rostlinných tkáňových kultur.
Chemický přenos genů – při pokusech s přenosem genů se používají také některé ionty kovů, chemikálie a roztoky různých chemických látek, avšak úspěšnost je ve srovnání s ostatními metodami příliš nízká.
Potvrzení vložení:
Naše práce stále není dokončena.
Nyní se musíme shodnout, zda je rekombinantní DNA vložena do naší cílové buňky, nebo ne. K tomu se používají různé molekulárně genetické technologie. Při tradiční metodě kultivace se k odlišení transformovaných buněk od buněk netransformovaných používá přítomnost nebo nepřítomnost selekčního markeru.
Ačkoli u metody detekce založené na PCR to není nutné. Metoda detekce založená na polymerázové řetězové reakci je všeobecně uznávána jako důvěryhodnější než jiné metody.
DNA se extrahuje z transformované buňky a amplifikuje se pomocí primerů komplementárních k našemu zájmovému genu nebo naší rekombinantní DNA.
Je-li rekombinantní DNA přítomna, jistě se amplifikuje, jinak se amplifikace nedosáhne. Pro dvoufaktorovou konformaci se vezme jedna sada primerů komplementárních ke specifické rekombinantní DNA a jedna sada primerů komplementárních k sekvenci selekčního markeru a provede se multiplexní PCR.
Pro validaci výsledků musí být dosaženo amplifikace v obou reakcích.
Ale počkejte chvíli!“
Co se stane, pokud během experimentu dojde k nějaké mutaci v našem zájmovém genu? Protože PCR může amplifikovat pouze DNA. K odhalení mutace musíme potřebovat sekvenční informaci.
Pro to se používá metoda sekvenování DNA.
DNA se získá z transformovaných buněk a gen zájmu se amplifikuje pomocí PCR. Nyní se amplikony PCR použijí pro sekvenování DNA, při kterém se pomocí fluorescenční chemie řádově určí sekvence našeho zájmového genu.
Po splnění všech parametrů pro určení zájmového genu jsou nyní naše buňky připraveny k injektáži do hostitelského organismu nebo k pokusům na tkáňových kulturách.
Aplikace genového inženýrství:
Nyní se dostáváme k důležitému bodu tohoto tématu: „K čemu se genetické inženýrství používá?“
Genetické inženýrství má velký průmyslový a zemědělský význam. Používá se v medicíně, genetickém výzkumu, zemědělství, při zkvalitňování plodin a pro výrobu terapeutických léčiv.
Používá se také při vývoji geneticky modifikovaných organismů. Zde se zabýváme některými důležitými aplikacemi genového inženýrství.
Technologie rekombinantní DNA se používá při zlepšování plodin a vývoji nových ekonomicky významných vlastností. Některé z nich jsou např:
- Odolnost vůči herbicidům
- Odolnost vůči virům
- Zpožděné dozrávání plodů
- Změněný obsah oleje
- Kontrola pylu
- Vývoj druhů rostlin odolných vůči chladu a suchu.
Klasickým příkladem je BT bavlník – jeden z typů geneticky modifikovaných druhů poskytuje rostlině odolnost vůči bakterii Bacillus thuringiensis.
Proces vývoje geneticky modifikovaných druhů rostlin:
Z organismu je izolován zájmový gen pomocí restrikčního štěpení nebo amplifikován polymerázovou řetězovou reakcí. Rekombinantní DNA se konstruuje vložením zájmového genu do plazmidu, zde se používá T-plazmid.
V dalším kroku se T- plazmid vloží do agrobakterie. V posledním kroku je rostlinný druh infikován transformovanými bakteriálními buňkami a kultivován. Celý proces je znázorněn na obrázku níže:
Agrobakteriem zprostředkovaný přenos genů u rostlinných druhů.
GMF- geneticky modifikované potraviny jsou další nejlepší aplikací genového inženýrství, při níž se pomocí technologie rekombinantní DNA konstruují ekonomicky významné potravinářské produkty.
Klasickým příkladem je rajče Flavr Savr, geneticky modifikovaný druh rajčete tvořený technologií antisense RNA. Má velký ekonomický význam, protože GM rajče lze snadno přepravovat z jednoho místa na druhé.
Další významnou aplikací genového inženýrství jsou geneticky modifikované neboli geneticky upravené potraviny.
Kvalita některých potravinářských produktů, jako je bavlna, kukuřice a sója, se zlepšuje pomocí současné technologie rekombinantní DNA. Cílem vývoje geneticky modifikovaných plodin nebo druhů rostlin je, aby byly ekonomicky významné, výživné, bohaté na bílkoviny, odolné vůči chorobám a stresu.
S využitím technik genového inženýrství a tkáňových kultur jsou vyvíjeny i rostlinné druhy tabáku, brambor, kukuřice a bavlny odolné vůči insekticidům.
Kromě toho lze současnou technikou genetické modifikace vytvořit i některé modifikované rostliny schopné vytvářet vlastní hnojiva.
Transgenní modelové organismy jsou vyvíjeny za účelem testování různých parametrů – funkci určitých genů lze určit pomocí konstrukce transgenních mikroorganismů a zvířecích modelů.
Škodlivé patogeny a insekticidní pasti lze ničit pomocí geneticky modifikovaných mikroorganismů, které jsou schopny rozkládat toxické látky.
Medicínské aplikace:
Nízkonákladové léky, hormony, enzymy a vakcíny se vytvářejí pomocí nástrojů genového inženýrství.
Nejlepším příkladem je faktor proti srážení krve, kdy je uměle vytvořen enzym aktivující plazminogen, který je schopen rozpouštět krevní sraženinu, a používá se u pacientů s ischemickou chorobou srdeční nebo infarktem.
Dalšími příklady jsou dva další terapeutické proteiny somatostatin a lymfokiny, které působí proti několika chorobným stavům a mohou být syntetizovány uměle. Inzulín je zatím klasickým příkladem terapeutického proteinu navrženého pomocí technologie genového inženýrství.
Gen pro inzulin je izolován restrikčním štěpením nebo pomocí PCR a vložen do plazmidu. Rekombinantní DNA plazmidu je okamžitě vložena do bakteriální nebo kvasinkové buňky, ve které se plazmid množí. Jakmile se mikroorganismus začne dělit, začne vyrábět umělý inzulin.
Stejnou technikou se v průmyslovém měřítku vyrábí velké množství inzulínu. Podrobný nástin výroby inzulínu je znázorněn na následujícím obrázku:
Výroba inzulínu pomocí technologie genového inženýrství.
Komerční výroba inzulínu začala po schválení FDA v roce 1982.
Rekombinantní vakcíny:
Vakcíny proti pravým neštovicím, viru herpes simplex a hepatitidě se vyrábějí technikou genového inženýrství. Vakcíny jsou inaktivované virové částice, které se používají k vyvolání imunitní odpovědi proti danému patogenu, avšak je u nich vysoká pravděpodobnost kontaminace.
Pomocí technologie rekombinantní DNA vědci vytvořili jedinečný typ vakcín, které obsahují pouze DNA pro bílkovinu virového pláště, takže patogen již nikdy nemůže být aktivován. Její hlavní výhodou je, že je bezpečnější, bez kontaminace a reaktivnější.
Genetické inženýrství v genové terapii:
Pomocí genové terapie nebo techniky přenosu genů lze léčit dědičné genetické poruchy. Cystická fibróza, Duchennova svalová dystrofie a srpkovitá anémie jako genové terapie jsou nyní v závěrečné fázi klinických zkoušek a připraveny k použití na pacientech.
Při genové terapii je vadný, nefunkční nebo zmutovaný gen nahrazen genem divokého typu stejnou technikou, jak bylo vysvětleno výše.
O genové terapii jsme psali úžasné články, přečtěte si je zde:
- Genová terapie:
- Co je genová terapie a jak funguje?
- Genová terapie zprostředkovaná nahou DNA
- Transpozonový systém Spící krasavice: Kromě toho se technologie genového inženýrství podobně využívá při výrobě biopaliv, nemocí, biolihu a dalších nezbytných produktů.
Omezení genového inženýrství:
S používáním genové terapie a produktů genetického inženýrství jsou spojeny etické problémy.
V zájmu zajištění ekonomické hodnoty potravinářského výrobku nebo jakéhokoli geneticky modifikovaného výrobku jsou také ohroženy jeho nutriční hodnoty.
V důsledku nepříznivého účinku se rychleji vyvíjejí nové rezistentní patogenní kmeny.
Také vedlejší účinky genové terapie a použití virů v ní jsou pro cílový organismus škodlivé.
Technologie je nákladnější, protože genová terapie stojí až 50 000 USD.
Závěr:
Hrátky s embryem nebo plodem jsou v rozporu s přírodními zákony, lidé v ně silně věří, a proto se geneticky modifikované potraviny a rostlinné produkty stávají stále středem kontroverzí.
Pomocí nástrojů genového inženýrství, jako je genová terapie a technika přenosu genů, lze však zabránit dědičným poruchám a smrtelným onemocněním typu rakoviny. Pozitivní využití technik genového inženýrství může změnit osud lidstva.
Zdroje:
- Výbor Národní rady pro výzkum (USA) pro identifikaci a hodnocení nezamýšlených účinků geneticky modifikovaných potravin na lidské zdraví. Bezpečnost geneticky modifikovaných potravin: Approaches to Assessing Unintended Health Effects (Přístupy k hodnocení nezamýšlených účinků na zdraví). Washington (DC): National Academies Press (USA); 2004. 2, Metody a mechanismy genetické manipulace s rostlinami, živočichy a mikroorganismy.
- Wallace RB. Principy genové manipulace. Úvod do genového inženýrství. Studie z mikrobiologie. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.
Cíle genové terapie:
„Technika používaná k vložení nebo odstranění mutantního genu nebo k manipulaci s genomem organismu se nazývá genové inženýrství.“
Historie genového inženýrství:
Termín genetické inženýrství poprvé použil spisovatel vědeckofantastických románů, nikoliv nějaký vědec. V roce 1951 Jack Williamson poprvé použil termín „genetické inženýrství“ ve svém románu „Dračí ostrov“.
Brzy poté byla molekulární struktura DNA objevena Watsonem a Crickem, ačkoli genetické pokusy byly populární již od dob Mendela.
První rekombinantní DNA sestrojil Paul Berg v roce 1972. V témže roce provedli Herbert Boyer a Stanley Cohen pokusy s přenosem genů. V roce 1974 vytvořil Rudolf Jaenisch poprvé v historii genetiky geneticky modifikované myši.
Po Rudolfově úspěchu byl v roce 1976 vyvinut geneticky modifikovaný neboli geneticky upravený druh rostliny tabák.
V tomto období (mezi lety 1960 a 1990) byly objeveny techniky podobné restrikčnímu štěpení, ligaci a PCR, které daly křídla technologii genového inženýrství.
Související článek:
Typ technik genového inženýrství:
Rekombinantní DNA- Technologie rekombinantní DNA je typem technologie genového inženýrství, při níž je umělá molekula DNA vytvořena ligací dvou různých DNA pomocí fyzikálních metod. Za tímto účelem se do plazmidového vektoru vloží gen, který je předmětem zájmu, a použije se pro experimenty s přenosem genů.
Přenos genu – technika přenosu genu se používá pro vložení zájmového genu do genomu hostitele.
Elektroforace, solicitační a virovým vektorem zprostředkovaný přenos genu, lipozomem zprostředkovaný přenos genu, transpozonem zprostředkovaný přenos genu jsou některé z metod, které se k tomu používají.
Editace genů – technika editace genů se používá k úpravě genomu, při níž se odstraní nežádoucí sekvence DNA nebo se do genomu hostitele může vložit nový gen. CRISPR-CAS9, TALEN a ZFN jsou některé známé nástroje pro úpravu genů používané při experimentech s genovou terapií.
Přečtěte si více: Co je to editace genů a CRISPR-CAS9?
Proces genového inženýrství:
Technika genového inženýrství se používá k mnoha různým účelům, proto se musíme nejprve rozhodnout, jaký je účel experimentu. Celý proces genového inženýrství lze rozdělit do 5 širších kroků:
- Výběr a izolace kandidátního genu
- Výběr a konstrukce plazmidu
- Transformace genu
- Vložení DNA do genomu hostitele
- Potvrzení vložení
Výběr a izolace kandidátního genu:
Gen musí obsahovat sekvenci DNA, kterou chceme studovat, a k tomu má gen některé zvláštní vlastnosti. Kandidátský gen by měl mít vysoký obsah GC a nižší repetitivní sekvenci DNA.
Kromě toho nesmí být gen, který nás zajímá, příliš dlouhý – lze úspěšně vložit pouze geny o velikosti několika kb. Delší gen má vyšší šanci na neúspěch. Kandidátský gen musí mít v sobě start a stop kodon. Související článek: Co je to genetický kód?
Nyní lze gen zájmu izolovat od zbytku DNA buď restrikčním štěpením, nebo polymerázovou řetězovou reakcí.
Restrikční endonukleázy jsou bakteriální enzymy, které mají schopnost trávit sekvenci DNA na určitém místě. Pomocí specifického typu restrikční endonukleázy můžeme vystřihnout a izolovat náš zájmový gen.
Metoda restrikčního trávení je vysvětlena v našem předchozím článku: Co je restrikční štěpení?
Při polymerázové řetězové reakci se na základě informace o sekvenci genu amplifikuje v termocykleru gen, který nás zajímá, nebo kandidátní gen.
Zařízení pomocí polymerázové řetězové reakce vytvoří miliony kopií genu našeho zájmu. Procesem elektroforézy v agarózovém gelu se amplifikovaný gen izoluje.
Pokud je gen našeho zájmu dobře prozkoumán, dříve, pak je informace o genu přístupná v genetické knihovně a můžeme ji použít pro umělou syntézu genu našeho zájmu. (pomocí informace z genetické knihovny lze gen také uměle syntetizovat)
V dalším kroku proveďte purifikaci DNA, pokud je to nutné. Nyní je naše DNA připravena k vložení do plazmidu.
Selekce a konstrukce plazmidu:
Výběr plazmidu pro experiment genového inženýrství je jedním z klíčových kroků celého experimentu. Před výběrem plazmidu musíme pochopit, proč se plazmid při pokusech s přenosem genů používá.
Plasmidová DNA je kruhová, dvouřetězcová cytoplazmatická DNA bakterií, která se nezávisle replikuje.
Vědci ji používají jako prostředek pro přenos genu, který je předmětem zájmu, na cílové místo v genomu. Dokáže účinně přenést gen na cílové místo. Struktura plazmidu je vysvětlena na obrázku níže,
Obecná struktura plazmidové DNA používané v technologii rekombinantní DNA.
Související článek: Co je to plazmid?
Příprava plazmidu:
Vyberte si plazmid, který je vhodný pro váš experiment.
Plasmid musí mít původ replikace, promotorovou oblast, gen rezistence k antibiotikům a další důležité sekvence. Pomocí metody restrikčního štěpení se do plazmidu zavede místo pro vložení, na které se liguje náš zájmový gen.
Pomocí ligázy T4 DNA, která se podobá silovému tmelu, se do plazmidu vloží a podváže DNA našeho zájmu. Spolu s plazmidem je do plazmidové DNA zaveden také selekční marker, který slouží k identifikaci rekombinantní DNA.
Kromě toho je do plazmidu vložena také promotorová oblast a terminátorové sekvence pro účinnou expresi genu našeho zájmu. Plazmid s naším zájmovým genem a některými dalšími důležitými sekvencemi se nyní označuje jako molekula rekombinantní DNA.
Nyní je naše rekombinantní DNA připravena k expresi.
Pokud provádíme klonování genu, než se plazmid vloží do bakteriálního hostitele, k čemuž se obecně běžně používají E.Coli. Jakmile se bakterie začne dělit, replikuje se spolu s ní i naše rekombinantní plazmidová DNA.
Nyní máme několik kopií naší plazmidové DNA, které jsou extrahovány pomocí soupravy pro extrakci plazmidové DNA a použity pro transformační experimenty.
Proces genového inženýrství.
Transformace do genomu hostitele:
Přenos rekombinantní DNA do přijímající buňky nebo hostitelského genomu je dalším zdlouhavým a obtížným úkolem. Pro různé typy buněk se používají různé metody pro vložení rekombinantní DNA, protože jedinou metodu nelze použít pro všechny typy buněk.
Různé metody transformace:
Použití stresu – bakterie snadno přijmou plazmidovou DNA pomocí některých stresových faktorů, jako je teplo nebo elektrická ponožka.
Mikroinjekce- pro vložení DNA přímo do jádra buňky se používá ostrá jehla, tato metoda je však méně účinná a vyžaduje k tomu vyšší úroveň odborných znalostí.
Elektroporace- jednou z nejlepších metod, která má velkou úspěšnost, je metoda elektroforace, při níž je rekombinantní DNA vložena do genomu hostitele prostoupením buňky elektrickým proudem.
Podrobně jsme se jí věnovali v celém článku. Přečtěte si ho zde:
Sonikace – sonikace je další dobrou metodou, která se někdy používá v experimentu s přenosem genů a při níž se rekombinantní DNA vkládá do cílové buňky pomocí ultrazvukových vln. Ultrazvukové vlny rovněž zvyšují propustnost buněk.
Přenos genů zprostředkovaný liposomy – pomocí umělého vnějšího obalu podobného buňce, známého jako liposom, lze do genomu hostitele vložit rekombinantní DNA.
Přenos genu pomocí bakteriální infekce- Tato metoda je jednou z oblíbených metod a běžně se používá při experimentech s genovým inženýrstvím rostlin. Zde je rostlinný druh infikován transformovanou bakterií pro vložení zájmového genu.
K vložení rekombinantní DNA do rostlinné buňky se využívá bakterie Agrobacterium tumifecian. Do Ti-plazmidu bakterie Agrobacterium se vloží zájmový gen. Rostlinné buňky jsou infikovány touto bakteriální kulturou a transformované buňky jsou regenerovány metodami rostlinných tkáňových kultur.
Chemický přenos genů – při pokusech s přenosem genů se používají také některé ionty kovů, chemikálie a roztoky různých chemických látek, avšak úspěšnost je ve srovnání s ostatními metodami příliš nízká.
Potvrzení vložení:
Naše práce stále není dokončena.
Nyní se musíme shodnout, zda je rekombinantní DNA vložena do naší cílové buňky, nebo ne. K tomu se používají různé molekulárně genetické technologie. Při tradiční metodě kultivace se k odlišení transformovaných buněk od buněk netransformovaných používá přítomnost nebo nepřítomnost selekčního markeru.
Ačkoli u metody detekce založené na PCR to není nutné. Metoda detekce založená na polymerázové řetězové reakci je všeobecně uznávána jako důvěryhodnější než jiné metody.
DNA se extrahuje z transformované buňky a amplifikuje se pomocí primerů komplementárních k našemu zájmovému genu nebo naší rekombinantní DNA.
Je-li rekombinantní DNA přítomna, jistě se amplifikuje, jinak se amplifikace nedosáhne. Pro dvoufaktorovou konformaci se vezme jedna sada primerů komplementárních ke specifické rekombinantní DNA a jedna sada primerů komplementárních k sekvenci selekčního markeru a provede se multiplexní PCR.
Pro validaci výsledků musí být dosaženo amplifikace v obou reakcích.
Ale počkejte chvíli!“
Co se stane, pokud během experimentu dojde k nějaké mutaci v našem zájmovém genu? Protože PCR může amplifikovat pouze DNA. K odhalení mutace musíme potřebovat sekvenční informaci.
Pro to se používá metoda sekvenování DNA.
DNA se získá z transformovaných buněk a gen zájmu se amplifikuje pomocí PCR. Nyní se amplikony PCR použijí pro sekvenování DNA, při kterém se pomocí fluorescenční chemie řádově určí sekvence našeho zájmového genu.
Po splnění všech parametrů pro určení zájmového genu jsou nyní naše buňky připraveny k injektáži do hostitelského organismu nebo k pokusům na tkáňových kulturách.
Aplikace genového inženýrství:
Nyní se dostáváme k důležitému bodu tohoto tématu: „K čemu se genetické inženýrství používá?“
Genetické inženýrství má velký průmyslový a zemědělský význam. Používá se v medicíně, genetickém výzkumu, zemědělství, při zkvalitňování plodin a pro výrobu terapeutických léčiv.
Používá se také při vývoji geneticky modifikovaných organismů. Zde se zabýváme některými důležitými aplikacemi genového inženýrství.
Technologie rekombinantní DNA se používá při zlepšování plodin a vývoji nových ekonomicky významných vlastností. Některé z nich jsou např:
- Odolnost vůči herbicidům
- Odolnost vůči virům
- Zpožděné dozrávání plodů
- Změněný obsah oleje
- Kontrola pylu
- Vývoj druhů rostlin odolných vůči chladu a suchu.
Klasickým příkladem je BT bavlník – jeden z typů geneticky modifikovaných druhů poskytuje rostlině odolnost vůči bakterii Bacillus thuringiensis.
Proces vývoje geneticky modifikovaných druhů rostlin:
Z organismu je izolován zájmový gen pomocí restrikčního štěpení nebo amplifikován polymerázovou řetězovou reakcí. Rekombinantní DNA se konstruuje vložením zájmového genu do plazmidu, zde se používá T-plazmid.
V dalším kroku se T- plazmid vloží do agrobakterie. V posledním kroku je rostlinný druh infikován transformovanými bakteriálními buňkami a kultivován. Celý proces je znázorněn na obrázku níže:
Agrobakteriem zprostředkovaný přenos genů u rostlinných druhů.
GMF- geneticky modifikované potraviny jsou další nejlepší aplikací genového inženýrství, při níž se pomocí technologie rekombinantní DNA konstruují ekonomicky významné potravinářské produkty.
Klasickým příkladem je rajče Flavr Savr, geneticky modifikovaný druh rajčete tvořený technologií antisense RNA. Má velký ekonomický význam, protože GM rajče lze snadno přepravovat z jednoho místa na druhé.
Další významnou aplikací genového inženýrství jsou geneticky modifikované neboli geneticky upravené potraviny.
Kvalita některých potravinářských produktů, jako je bavlna, kukuřice a sója, se zlepšuje pomocí současné technologie rekombinantní DNA. Cílem vývoje geneticky modifikovaných plodin nebo druhů rostlin je, aby byly ekonomicky významné, výživné, bohaté na bílkoviny, odolné vůči chorobám a stresu.
S využitím technik genového inženýrství a tkáňových kultur jsou vyvíjeny i rostlinné druhy tabáku, brambor, kukuřice a bavlny odolné vůči insekticidům.
Kromě toho lze současnou technikou genetické modifikace vytvořit i některé modifikované rostliny schopné vytvářet vlastní hnojiva.
Transgenní modelové organismy jsou vyvíjeny za účelem testování různých parametrů – funkci určitých genů lze určit pomocí konstrukce transgenních mikroorganismů a zvířecích modelů.
Škodlivé patogeny a insekticidní pasti lze ničit pomocí geneticky modifikovaných mikroorganismů, které jsou schopny rozkládat toxické látky.
Medicínské aplikace:
Nízkonákladové léky, hormony, enzymy a vakcíny se vytvářejí pomocí nástrojů genového inženýrství.
Nejlepším příkladem je faktor proti srážení krve, kdy je uměle vytvořen enzym aktivující plazminogen, který je schopen rozpouštět krevní sraženinu, a používá se u pacientů s ischemickou chorobou srdeční nebo infarktem.
Dalšími příklady jsou dva další terapeutické proteiny somatostatin a lymfokiny, které působí proti několika chorobným stavům a mohou být syntetizovány uměle. Inzulín je zatím klasickým příkladem terapeutického proteinu navrženého pomocí technologie genového inženýrství.
Gen pro inzulin je izolován restrikčním štěpením nebo pomocí PCR a vložen do plazmidu. Rekombinantní DNA plazmidu je okamžitě vložena do bakteriální nebo kvasinkové buňky, ve které se plazmid množí. Jakmile se mikroorganismus začne dělit, začne vyrábět umělý inzulin.
Stejnou technikou se v průmyslovém měřítku vyrábí velké množství inzulínu. Podrobný nástin výroby inzulínu je znázorněn na následujícím obrázku:
Výroba inzulínu pomocí technologie genového inženýrství.
Komerční výroba inzulínu začala po schválení FDA v roce 1982.
Rekombinantní vakcíny:
Vakcíny proti pravým neštovicím, viru herpes simplex a hepatitidě se vyrábějí technikou genového inženýrství. Vakcíny jsou inaktivované virové částice, které se používají k vyvolání imunitní odpovědi proti danému patogenu, avšak je u nich vysoká pravděpodobnost kontaminace.
Pomocí technologie rekombinantní DNA vědci vytvořili jedinečný typ vakcín, které obsahují pouze DNA pro bílkovinu virového pláště, takže patogen již nikdy nemůže být aktivován. Její hlavní výhodou je, že je bezpečnější, bez kontaminace a reaktivnější.
Genetické inženýrství v genové terapii:
Pomocí genové terapie nebo techniky přenosu genů lze léčit dědičné genetické poruchy. Cystická fibróza, Duchennova svalová dystrofie a srpkovitá anémie jako genové terapie jsou nyní v závěrečné fázi klinických zkoušek a připraveny k použití na pacientech.
Při genové terapii je vadný, nefunkční nebo zmutovaný gen nahrazen genem divokého typu stejnou technikou, jak bylo vysvětleno výše.
O genové terapii jsme psali úžasné články, přečtěte si je zde:
- Genová terapie:
- Co je genová terapie a jak funguje?
- Genová terapie zprostředkovaná nahou DNA
- Transpozonový systém Spící krasavice: Kromě toho se technologie genového inženýrství podobně využívá při výrobě biopaliv, nemocí, biolihu a dalších nezbytných produktů.
Omezení genového inženýrství:
S používáním genové terapie a produktů genetického inženýrství jsou spojeny etické problémy.
V zájmu zajištění ekonomické hodnoty potravinářského výrobku nebo jakéhokoli geneticky modifikovaného výrobku jsou také ohroženy jeho nutriční hodnoty.
V důsledku nepříznivého účinku se rychleji vyvíjejí nové rezistentní patogenní kmeny.
Také vedlejší účinky genové terapie a použití virů v ní jsou pro cílový organismus škodlivé.
Technologie je nákladnější, protože genová terapie stojí až 50 000 USD.
Závěr:
Hrátky s embryem nebo plodem jsou v rozporu s přírodními zákony, lidé v ně silně věří, a proto se geneticky modifikované potraviny a rostlinné produkty stávají stále středem kontroverzí.
Pomocí nástrojů genového inženýrství, jako je genová terapie a technika přenosu genů, lze však zabránit dědičným poruchám a smrtelným onemocněním typu rakoviny. Pozitivní využití technik genového inženýrství může změnit osud lidstva.
Zdroje:
- Výbor Národní rady pro výzkum (USA) pro identifikaci a hodnocení nezamýšlených účinků geneticky modifikovaných potravin na lidské zdraví. Bezpečnost geneticky modifikovaných potravin: Approaches to Assessing Unintended Health Effects (Přístupy k hodnocení nezamýšlených účinků na zdraví). Washington (DC): National Academies Press (USA); 2004. 2, Metody a mechanismy genetické manipulace s rostlinami, živočichy a mikroorganismy.
- Wallace RB. Principy genové manipulace. Úvod do genového inženýrství. Studie z mikrobiologie. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.