Ergebnisse und Diskussion

Caspase-3 und Caspase-7 zeigen eine unterschiedliche Aktivität gegenüber synthetischen Substraten.

Caspase-3 und Caspase-7 werden beide universell während der Apoptose aktiviert, unabhängig vom spezifischen todauslösenden Stimulus, und es wird allgemein angenommen, dass beide Proteasen die Zerstörungsphase der Apoptose koordinieren, indem sie eine Vielzahl von Proteinsubstraten spalten (1, 2). Der relative Beitrag dieser Proteasen zum zellulären Abbruch bleibt jedoch weitgehend spekulativ. Caspase-3 und Caspase-7 sind im Vergleich zu anderen Säugetier-Caspasen am engsten miteinander verwandt, weisen aber dennoch erhebliche Sequenzdivergenzen auf, mit einer Gesamt-Sequenzidentität von 56 % und einer Sequenzähnlichkeit von 73 % (Abb. 1A). Um die Substratpräferenzen dieser Caspasen genauer zu untersuchen, exprimierten wir beide Enzyme als His-markierte Proteine in Bakterien und reinigten sie bis zur Homogenität (Abb. 1B). Beide Caspasen wurden gegen DEVD-AFC in Kombination mit dem Polycaspaseinhibitor zVAD-fmk titriert (Abb. 1C). Auf der Grundlage der Daten der Aktivstellen-Titration wurde die aktive Konzentration jedes Enzyms normalisiert, um in nachfolgenden Experimenten direkte Vergleiche zwischen diesen Enzymen zu ermöglichen (Abb. 1D). Anschließend verglichen wir diese Caspasen im Hinblick auf ihre Fähigkeit, eine Reihe synthetischer Tetrapeptidsubstrate zu hydrolysieren. Wie Abb. 1E zeigt, spalteten beide Caspasen bevorzugt DEVD-AFC mit im Wesentlichen gleicher Effizienz. Im Gegensatz dazu spaltete Caspase-3 LEHD-AFC effizienter als Caspase-7, was darauf hindeutet, dass diese Proteasen unterschiedliche Aktivitäten gegenüber bestimmten synthetischen Substraten besitzen (Abb. 1E).