Wirkungen von Modafinil auf das Verhalten und die Parameter der oxidativen Schädigung im Gehirn von Wistar-Ratten
Abstract
Die Auswirkungen von Modafinil (MD) auf das Verhalten und die oxidative Schädigung von Proteinen und Lipiden im Gehirn von Ratten wurden untersucht. Wistar-Ratten erhielten eine einmalige Verabreichung von Wasser oder MD (75, 150 oder 300 mg/kg) mit der Schlundsonde. Die Verhaltensparameter wurden 1, 2 und 3 Stunden nach der Verabreichung des Medikaments in einem Freilandapparat untersucht. Die reaktiven Substanzen der Thiobarbitursäure (TBARS) und die Bildung von Proteincarbonyl wurden im Gehirn gemessen. MD steigerte die Bewegungsaktivität in der höchsten Dosis 1 und 3 Stunden nach der Verabreichung. Die Verabreichung von MD in einer Dosis von 300 mg/kg erhöhte 1 Stunde nach der Verabreichung die Besuche im Zentrum des offenen Feldes; 3 Stunden nach der Verabreichung erhöhten jedoch alle verabreichten MD-Dosen die Besuche im Zentrum des offenen Feldes. MD 300 mg/kg erhöhte die Lipidschäden in der Amygdala, dem Hippocampus und dem Striatum. Außerdem erhöhte MD die Proteinschädigung im präfrontalen Kortex, in der Amygdala und im Hippocampus; dieser Effekt variiert jedoch in Abhängigkeit von der verabreichten Dosis. Im Gegensatz dazu verringerte die Verabreichung von MD 75 und 300 mg/kg die Proteinschädigung im Striatum. Diese Studie zeigte, dass die Verabreichung von MD zu Verhaltensänderungen führt, die von der verwendeten Dosis abhängen. Darüber hinaus schienen die Wirkungen von MD auf die Parameter der oxidativen Schädigung in bestimmten Hirnregionen und Dosen aufzutreten.
1. Einleitung
Modafinil (MD) ist ein nicht-amphetaminerges Psychopharmakon, das häufig zur Behandlung von Schlafstörungen wie Narkolepsie, obstruktivem Schlafapnoe-Syndrom und Schlafstörungen bei Schichtarbeit verschrieben wird. Außerdem ist in der Literatur gut beschrieben, dass MD die Funktion in einer Reihe von kognitiven Bereichen sowie das Arbeitsgedächtnis und das episodische Gedächtnis verbessert. Diese Auswirkungen von MD auf das Gedächtnis wurden auch bei psychiatrischen Patienten beschrieben, was darauf hindeutet, dass dieses Medikament ein hervorragender Kandidat für die Behandlung kognitiver Funktionsstörungen bei psychiatrischen Erkrankungen ist. Darüber hinaus hat die klinische Forschung gezeigt, dass MD die Symptome bei Patienten mit schweren Depressionen, bipolarer Störung, Schizophrenie und Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) verbessert.
Der Wirkmechanismus von MD ist nur unzureichend bekannt; es ist jedoch bekannt, dass dieses Medikament eine wichtige Wirkung auf Katecholamine, Serotonin, Glutamat, Gamma-Aminobuttersäure, Orexin und Histamin-Systeme im Gehirn hat. Außerdem zeigen Studien, dass MD den Dopamintransporter hemmt und so die dopaminerge Neurotransmission in den Vigilanzkreisläufen erhöht. Psychostimulanzien wie Amphetamin, die ebenfalls auf verschiedene Neurotransmittersysteme wirken, haben nachweislich eine ausgeprägte Wirkung auf das Verhalten, einschließlich der Erzeugung von Angst, Unruhe und Hyperaktivität. MD ist jedoch weniger mit Nebenwirkungen wie Hyperaktivität, Ängstlichkeit, Nervosität oder Rebound-Effekten verbunden als die herkömmlichen Stimulanzien.
Verschiedene Studien legten nahe, dass die Verabreichung von Psychostimulanzien zu oxidativem Stress im Rattenhirn führen kann. Das Gehirn ist besonders anfällig für die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), da es 20 % des gesamten Körpersauerstoffs verstoffwechselt und nur über eine begrenzte antioxidative Kapazität verfügt. Die chronische Verabreichung von Psychostimulanzien wie Methylphenidat, m-Amphetamin und d-Amphetamin bei Ratten induzierte eine erhöhte Superoxidproduktion, oxidative Schäden an Proteinen, Lipiden und DNA sowie Veränderungen der antioxidativen Enzyme und der Komplexe der mitochondrialen Atmungskette .
Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Wirkung von MD auf das Verhalten und die Parameter des oxidativen Stresses im Hippocampus, präfrontalen Kortex, in der Amygdala und im Striatum von Ratten zu untersuchen.
2. Experimentelle Methoden
2.1. Tiere
Die Probanden waren erwachsene männliche Wistar-Ratten (Gewicht 250-350 g) aus unserer Zuchtkolonie. Die Tiere wurden zu fünft in einem Käfig untergebracht, wobei Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung standen. Sie wurden in einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus (Licht an um 7:00 Uhr morgens) bei einer Temperatur von °C gehalten. Alle Versuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit der Genehmigung der örtlichen Ethikkommission für die Verwendung von Tieren an der Universidade do Extremo Sul Catarinense durchgeführt. Alle Experimente wurden zur gleichen Tageszeit durchgeführt, um zirkadiane Schwankungen zu vermeiden.
2.2. Medikamente und pharmakologische Verfahren
Das MD (Libbs Farmacêutica Ltda) wurde in dem Vehikel suspendiert: 1% Methylcellulose in Wasser. Die Lösungen wurden unmittelbar vor der Verwendung zubereitet und während der Versuchsdurchführung vor Licht geschützt. Die suspendierte Lösung wurde während des gesamten Injektionszeitraums geschüttelt. Die Kontrollgruppe erhielt das Vehikel.
2.3. Versuchsaufbau
Die Gesamtzahl der in diesem Versuch verwendeten Ratten betrug 40 (Tiere pro Gruppe). Die Tiere erhielten eine Einzeldosis von MD (75, 100 oder 300 mg/kg Körpergewicht) in einem Volumen von 1 ml/kg, verabreicht durch Schlundsonde. Die Kontrollgruppe erhielt Vehikel in einem Volumen von 1 mL/kg. Die lokomotorische Aktivität wurde 1, 2 und 3 Stunden nach der Injektion gemessen, und die Ratten wurden unmittelbar nach der Freilandaufgabe durch Enthauptung getötet.
2.4. Lokomotorische Aktivität
Die lokomotorische Aktivität wurde anhand der Aufgabe im offenen Feld wie zuvor beschrieben bewertet. Diese Aufgabe wurde in einem 40 × 60 cm großen, von 50 cm hohen Wänden umgebenen offenen Feld aus braunem Sperrholz durchgeführt, wobei der Boden durch schwarze Linien in 9 gleiche Quadrate unterteilt war. Die Tiere wurden sanft auf das linke hintere Rechteck gesetzt und durften die Arena 5 Minuten lang frei erkunden. Beim Test im offenen Feld wurden die folgenden Verhaltensparameter bewertet.
Überquerungen (Bewegungsaktivität/horizontale Aktivität): die Gesamtzahl der Quadrate, die von den Ratten während des gesamten Testzeitraums überquert wurden, wurde gezählt.
Aufrichtungen (Erkundungsaktivität/vertikale Aktivität): die gesamte aufrechte Haltung der Ratten während des gesamten Testzeitraums wurde gezählt.
Besuche in der Mitte des offenen Feldes: die Gesamtzahl der Besuche in der Mitte des offenen Feldes wurde gezählt. Ein zentrales Quadrat von cm wurde als der „zentrale“ Bereich des Feldes definiert.
2.5. Messung der Marker für oxidative Schäden
Ratten wurden wie oben beschrieben mit MD oder Wasser behandelt und 3 Stunden nach der letzten Injektion durch Enthauptung getötet, und ihre Gehirne wurden zur Bewertung der oxidativen Schäden im präfrontalen Kortex, in der Amygdala, im Hippocampus und im Striatum entfernt und seziert. TBARS und die Bildung von Proteincarbonyl wurden wie zuvor beschrieben gemessen.
2.6. Reaktive Thiobarbitursäure-Substanzen (TBARS)
Die Bildung von TBARS während einer sauren Erhitzungsreaktion wurde als Index der ROS-Produktion gemessen, die als empfindliche Methode zur Messung der Lipidperoxidation weit verbreitet ist, wie zuvor beschrieben. Kurz gesagt wurden die Proben mit 1 ml Trichloressigsäure 10 % (TCA) und 1 ml Thiobarbitursäure 0,67 % (TBA) vermischt und dann 15 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erhitzt. Die TBARS wurden durch die Absorption bei 535 nm bestimmt. Die Ergebnisse werden als MDA (Malondialdehyd)-Äquivalente (nmol/mg Protein) angegeben.
2.7. Messung der Protein-Carbonylgruppen
Die oxidative Schädigung der Proteine wurde durch die Bestimmung der Carbonylgruppen auf der Grundlage der Reaktion mit Dinitrophenylhydrazin (DNPH) wie zuvor beschrieben bewertet. Kurz gesagt wurden die Proteine durch Zugabe von 20%iger Trichloressigsäure ausgefällt und in DNPH wieder aufgelöst und die Absorption bei 370 nm gemessen.
2.8. Statistische Analyse
Alle Analysen wurden mit dem Statistikpaket für Sozialwissenschaften Version 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) durchgeführt. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben. Die Unterschiede zwischen den Gruppen in der Verhaltensanalyse wurden mit Hilfe der Varianzanalyse mit wiederholten Messungen überprüft, um die Zeit-Antwort-Kurve abzurufen, gefolgt von Tukey’s Post-Hoc-Tests. Um die Unterschiede zwischen den Gruppen in der biochemischen Analyse zu prüfen, wurde die ANOVA verwendet, gefolgt von Tukey-Post-Hoc-Tests. In allen Experimenten wurden Werte < 0,05 als statistische Signifikanz angesehen.
3. Ergebnisse
3.1. Verhaltensanalyse
Für die Analyse der Lokomotion (Überquerungen) (Abbildung 1(a)) ergab die Varianzanalyse mit wiederholten Messungen signifikante Unterschiede für die MD-Verabreichung (F(3.35) = 7.91, ) und für die Verhaltenswiederholungen (F(2.7) = 54.82, ). Eine weitere Analyse mit Tukey’s post hoc Test zeigte, dass MD in einer Dosis von 300 mg/kg die spontane Lokomotion der Ratten im Vergleich zur Kontrollgruppe 1 Stunde nach der Verabreichung erhöhte. Darüber hinaus zeigten die Kontrollgruppe, die MD-Gruppe mit 75 mg/kg und die MD-Gruppe mit 150 mg/kg eine geringere Anzahl von Überquerungen, wenn sie 3 Stunden später erneut dem offenen Feld ausgesetzt wurden, was auf eine Gewöhnung an die Umgebung hinweist. Die mit 300 mg/kg behandelten Ratten zeigten jedoch eine geringere Anzahl von Übergängen, wenn sie 2 und 3 Stunden später erneut dem offenen Feld ausgesetzt wurden. Dieser Unterschied lässt sich möglicherweise durch die motorische Hyperaktivität erklären, die 1 Stunde nach der Verabreichung von MD in einer Dosis von 300 mg/kg ausgelöst wurde.
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Für die Analyse der Exploration (Rearings) (Abbildung 1(b)) ergab die Varianzanalyse mit wiederholten Maßen signifikante Unterschiede für die Verhaltenswiederholungen (F(2.7) = 32.7, ). Eine weitere Analyse mit Tukey’s post hoc Test zeigte, dass die Kontrollgruppe, MD in einer Dosierung von 75 mg/kg und MD in einer Dosierung von 150 mg/kg eine geringere Anzahl von Aufmüpfigkeiten zeigten, wenn sie 3 Stunden später erneut dem offenen Feld ausgesetzt wurden. MD in einer Dosierung von 300 mg/kg verringerte die Anzahl der Aufstiege, wenn sie 2 und 3 Stunden später erneut dem offenen Feld ausgesetzt wurden.
Für die Analyse der Besuche in der Mitte des offenen Feldes (Abbildung 1(c)) ergab die Varianzanalyse mit wiederholten Messungen signifikante Unterschiede für die MD-Verabreichung (F(3.34) = 15.70, ). Eine weitere Analyse mit Tukey’s post hoc Test zeigte, dass MD in einer Dosierung von 300 mg/kg die Besuche in der Mitte des offenen Feldes im Vergleich zur Kontrolle 1 Stunde nach der Verabreichung erhöhte. Darüber hinaus erhöhte MD in allen verabreichten Dosen die Besuche im Zentrum des offenen Feldes 3 Stunden nach der Verabreichung.
3.2. Biochemische Analyse
Wie in Abbildung 2(a) gezeigt, waren die TBARS-Werte in der Amygdala (F(3) = 4,18, ), im Hippocampus (F(3) = 44,9, ) und im Striatum (F(3) = 7,07, ) von Ratten, die mit 300 mg/kg MD behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht.
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Wie in Abbildung 2(b) zu sehen ist, wurde ein signifikanter Anstieg der Carbonylbildung nach Verabreichung von MD im präfrontalen Kortex (F(3) = 29,9, ) bei einer Dosis von 300 mg/kg und in der Amygdala (F(3) = 9,74, ) und im Hippocampus (F(3) = 17,99, ) bei 75 mg/kg festgestellt. Umgekehrt reduzierte die Behandlung mit MD bei 75 und 300 mg/kg signifikant die Carbonylbildung im Striatum (F(3) = 21,93, ) im Vergleich zur Kontrollgruppe.
4. Diskussion
In der vorliegenden Studie beobachteten wir, dass eine einmalige Injektion von MD in einer hohen Dosis (300 mg/kg) Hyperlokomotion bei Ratten auslöst, die 2 und 3 Stunden nach der Verabreichung nicht anhält. Unseren Ergebnissen zufolge steigerte MD bei Rhesusaffen die Bewegungsaktivität signifikant und erhöhte den extrazellulären Dopaminspiegel im Striatum. Young und Kollegen zeigten, dass MD bei C57BL/6J- und 129/SJ-Mäusen die Aktivität, das Aufbäumen und die Geschmeidigkeit der Bewegungsabläufe erhöhte. Diese MD-induzierten Verhaltensänderungen standen im Zusammenhang mit erhöhtem synaptischem Dopamin und sekundären Wirkungen, die durch die Dopaminrezeptoren drd1 und drd4 vermittelt werden. Im Gegensatz zu der oben genannten Studie konnten wir trotz eines Trends keine signifikante Zunahme des Erkundungsverhaltens nach MD-Verabreichung beobachten. Diese Diskrepanz lässt sich durch Unterschiede in der Methodik, der Tierart und der Behandlungsdauer erklären.
Hier beobachteten wir, dass die Kontrollgruppe und MD in niedriger Dosierung (75 und 150 mg/kg) die Anzahl der Überquerungen und Aufstiege verringerten, wenn sie drei Stunden später erneut dem offenen Feld ausgesetzt wurden, was auf eine Gewöhnung an die Umgebung hindeutet. MD in der hohen Dosis (300 mg/kg) verringerte die Anzahl der Übertritte und Aufstiege, wenn sie 2 und 3 Stunden später erneut dem offenen Feld ausgesetzt wurden. Diese Diskrepanz lässt sich durch die Tatsache erklären, dass 1 Stunde nach der Verabreichung von MD (300 mg/kg) die Anzahl der Überquerungen signifikant anstieg und eine Tendenz zur Erhöhung der Anzahl der Aufstiege bestand. Die Gewöhnung an eine neue Umgebung gilt als eine der elementarsten Formen des nicht-assoziativen Lernens. Die wiederholte Exposition gegenüber der gleichen Umgebung führt zu einer Verringerung des Erkundungsverhaltens, was als Index der Gewöhnung angesehen werden kann.
Ein interessantes Ergebnis der aktuellen Studie war, dass MD angstbezogenes Verhalten modulierte. Im Test mit offenem Feld waren die mit MD behandelten Ratten weniger ängstlich und neigten sogar dazu, den aversiven zentralen Bereich mehr zu erkunden als die Kontrollpersonen. MD in einer Dosis von 300 mg/kg erhöhte 1 Stunde nach der Verabreichung die Anzahl der Besuche in der Mitte des offenen Feldes. Darüber hinaus erhöhte MD in allen verabreichten Dosen die Besuche im Zentrum des offenen Feldes 3 Stunden nach der Verabreichung. In der Literatur gibt es kontroverse Studien über die Wirkung von MD auf die Angstzustände. Präklinische Studien haben entweder keine Auswirkungen von Modafinil auf Angstzustände oder eine anxiolytische Wirkung gezeigt. In ähnlicher Weise zeigt MD in klinischen Studien entweder eine anxiolytische oder keine angstlösende Wirkung, während andere Studien eine anxiogene Wirkung belegen. Diese Unterschiede zwischen den Studien lassen sich durch unterschiedliche Dosierungen (100 mg, 200 mg oder 400 mg) und Dosierungsschemata (einmalige oder chronische Einnahme über eine Woche oder länger) erklären. Die angstlösenden Wirkungen von MD lassen sich durch ihre Auswirkungen auf die Amygdala erklären, eine Hirnregion, die an der Angst vor bedrohlichen Reizen beteiligt ist. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass MD die Reaktivität der Amygdala auf ängstliche Reize verringert. Es ist bekannt, dass die Amygdala reich an katecholaminergen und serotonergen Projektionen ist, so dass MD wahrscheinlich die Reaktivität der Amygdala durch Veränderungen in der intra-amygdala Signalisierung reduziert, die aus Veränderungen im Noradrenalin-, Dopamin-, Serotonin- oder GABA-System oder aus einer Kombination dieser Effekte resultieren.
Zusätzlich zu den Verhaltensänderungen ist in der Literatur gut beschrieben, dass Psychostimulanzien sowohl in Tiermodellen als auch beim Menschen oxidative Schäden verursachen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass MD die oxidativen Schäden an Lipiden und Proteinen im Gehirn von Ratten erhöht. Die TBARS-Werte waren in der Amygdala, im Hippocampus und im Striatum von Ratten, die mit MD in hoher Dosis (300 mg/kg) behandelt wurden, erhöht. Darüber hinaus beobachteten wir nach der Verabreichung von MD im präfrontalen Kortex bei einer Dosis von 300 mg/kg und in der Amygdala und im Hippocampus bei 75 mg/kg einen Anstieg der Carbonylbildung. Studien zeigen, dass MD den Dopamintransporter hemmt und dadurch die dopaminerge Neurotransmission erhöht. Der durch MD induzierte Anstieg der extrazellulären Dopaminkonzentration kann eine Überproduktion des toxischen Metaboliten der Dopaminoxidation auslösen, was zu oxidativen Schäden an Proteinen und Lipiden im Gehirn von Ratten führt. In der Literatur gibt es keine Studien zur Bewertung von Hirnschäden nach der Verabreichung von MD; diese Studien sind jedoch sehr wichtig, da die Zugänglichkeit von MD, z. B. als wachheitsförderndes, gedächtnisförderndes und ermüdungshemmendes Medikament, für gesunde Menschen zunimmt.
Umgekehrt verringerte die Behandlung mit MD (75 und 300 mg/kg) die Carbonylbildung im Striatum im Vergleich zur Kontrollgruppe. Einige Studien haben das neuroprotektive Potenzial von MD im Striatum gezeigt. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Überleben von mit 1-Methyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin vergifteten dopaminergen Neuronen im Striatum nach einer MD-Behandlung im Tiermodell der Parkinson-Krankheit verbessert wurde. Raineri und Kollegen haben gezeigt, dass die Verabreichung von MD die Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität im Striatum von Mäusen abschwächt, was auf eine mögliche schützende Rolle von MD in dieser Gehirnregion hindeutet. MD verbessert nachweislich die Lernfähigkeit von Methamphetamin-abhängigen Patienten. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verabreichung von MD antioxidative Eigenschaften im Striatum haben könnte; die schützende Wirkung von MD auf das Striatum ist jedoch noch unbekannt. Das Striatum integriert glutamaterge Eingänge aus Kortex und Thalamus mit dopaminergen Afferenzen aus dem Mittelhirn. Die Dopamin-Signalübertragung spielt eine herausragende Rolle beim abhängigen Lernen im Striatum und bei der synaptischen Plastizität der mittelstacheligen Projektionsneuronen. Rossato und Kollegen zeigten, dass die Infusion des D1-Rezeptor-Agonisten die Konzentration des neurotrophen Faktors (BDNF) und folglich die synaptische Plastizität erhöht. Somit kann MD die synaptische Plastizität durch die Aktivierung des dopaminergen Systems fördern und folglich das Striatum vor oxidativen Schäden schützen.
Zusammenfassend können wir zeigen, dass (1) MD bei hoher Dosis (300 mg/kg) 1 Stunde nach Verabreichung Hyperaktivität induziert, die 2 und 3 Stunden nach Verabreichung nicht mehr besteht. (2) MD zeigte bei Ratten anxiolytische Wirkungen und erhöhte die Anzahl der Besuche in der Mitte des offenen Feldes. (3) MD induzierte oxidative Schäden an Lipiden und Proteinen im Rattenhirn; die oxidativen Schäden hängen jedoch von der analysierten Hirnregion und der verabreichten MD-Dosis ab. (4) Schließlich könnte MD das Striatum vor oxidativen Proteinschäden schützen. Bei der Interpretation der Ergebnisse ist jedoch Vorsicht geboten. Erstens wurden die antioxidativen Abwehrkräfte nicht gemessen; da dies die erste Studie ist, die die Auswirkungen von MD auf oxidativen Stress untersucht, räumen wir ein, dass dies bei der Interpretation der Ergebnisse hilfreich gewesen wäre. Zweitens wurde MD jedoch gesunden Ratten verabreicht; die Auswirkungen von MD auf den oxidativen Schaden in Tiermodellen psychischer Erkrankungen könnten andere Ergebnisse zeigen.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit der Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.
Danksagungen
Das Labor für Neurowissenschaften (Brasilien) ist eines der Zentren des Nationalen Instituts für Translationale Medizin (INCT-TM) und eines der Mitglieder des Exzellenzzentrums für angewandte Neurowissenschaften von Santa Catarina (NENASC). Diese Forschung wurde durch Zuschüsse von CNPq, FAPESC, Instituto Cérebro e Mente und UNESC unterstützt. João Quevedo ist CNPq-Forschungsstipendiat und Roger B. Varela, Wilson R. Resende und Amanda V. Steckert sind Inhaber eines CAPES-Stipendiums; Samira S. Valvassori ist Inhaberin eines CNPq-Stipendiums.