„Eine molekulargenetische Technik, die zur direkten Manipulation, Veränderung oder Modifikation von Genen oder des Genoms von Organismen eingesetzt wird, um den Phänotyp zu manipulieren, wird Gentechnik genannt.“

Oder anders ausgedrückt:

„Gentechnik ist eine Technik, mit der die genetische Zusammensetzung eines Organismus verändert werden kann.“

Die Technik wird oft als genetische Manipulation, genetische Modifikation oder genetische Veränderung bezeichnet, im weiteren Sinne wird sie als Gentechnik kategorisiert.

Bei dieser Technik wird eine rekombinante DNA konstruiert und mithilfe eines Vektors in das Wirtsgenom eingefügt. Oder man löscht einige mutierte Sequenzen aus einem Genom. Die erste rekombinante DNA wurde von Paul Berg im Jahr 1972 konstruiert.

Mit Hilfe der Gentechnik können gentechnisch veränderte Organismen konstruiert werden, die für uns wirtschaftlich sehr wichtig sind.

Sie wird zur Herstellung von verbesserten Pflanzenarten, therapeutischen Medikamenten oder Proteinen, zur Vorbeugung von Erbkrankheiten und zur Konstruktion eines gentechnisch veränderten Organismus eingesetzt.

In dem vorliegenden Artikel werden wir uns hauptsächlich mit der Gentechnik und ihren Anwendungen beschäftigen. Der Inhalt des Artikels ist,

• Was ist Gentechnik
  • Definition
  • Geschichte
  • Typen
  • Verfahren
• Anwendung der Gentechnik
• Grenzen der Gentechnik
• Abschluss

Der Mensch manipuliert seit langem das Erbgut vieler Organismen. Durch selektive Züchtung und Kreuzung wurden von uns wirtschaftlich wichtige Pflanzenarten geschaffen.

Der Zweck der Entwicklung der Gentechnik oder der genetischen Manipulationstechnik ist es, Organismen oder Phänotypen zu erzeugen, die für uns nützlich sind. Gentechnische Verfahren werden zur

• Konstruktion von gentechnisch veränderten Pflanzenarten eingesetzt.
• Abiotische und biotische Stressresistenz von Pflanzenarten.
• Wirtschaftlich wichtige Pflanzenarten
• Kommerziell wertvoller Organismus
• Zur Herstellung von therapeutischen Arzneimitteln
• Vorbeugung von genetischen Anomalien.

„Bei der Gentechnik wird die DNA von zwei verschiedenen Zellen kombiniert und über einen Vektor in das Wirtsgenom eingefügt.“ Wichtige Bestandteile der Genmanipulationsversuche werden hier erklärt.

Gen von Interesse: Eine DNA-Sequenz, die wir in unsere Zielzellen einfügen wollen.

Vektor: Mit Hilfe von Plasmid-DNA-ähnlichen Vektoren wird das Gen von Interesse in das Wirtsgenom eingebaut. Vektoren sind eine Art Vehikel, die das genetische Material übertragen.

Zielzellen: Zielzellen sind die Population von Zellen, deren Genom wir manipulieren oder verändern wollen.

Definitionen:

„Eine Technik, die verwendet wird, um ein mutiertes Gen einzufügen oder zu löschen oder um das Genom eines Organismus zu manipulieren, wird als Gentechnik bezeichnet.“

Geschichte der Gentechnik:

Der Begriff Gentechnik wurde erstmals von einem Science-Fiction-Autor und nicht von einem Wissenschaftler verwendet. Im Jahr 1951 verwendete Jack Williamson in seinem Roman „Dracheninsel“ zum ersten Mal den Begriff „Gentechnik“.

Kurz darauf wurde die molekulare Struktur der DNS von Watson und Crick entdeckt, obwohl die genetischen Experimente schon seit der Zeit Mendels bekannt waren.

Die erste rekombinante DNA wurde 1972 von Paul Berg konstruiert. Im selben Jahr führten Herbert Boyer und Stanley Cohen Gentransfer-Experimente durch. 1974 hatte Rudolf Jaenisch zum ersten Mal in der Geschichte der Genetik genetisch veränderte Mäuse geschaffen.

Nach dem Erfolg von Rudolf wurde 1976 die gentechnisch veränderte oder gentechnisch manipulierte Tabakpflanzenart entwickelt.

In dieser Zeit (zwischen 1960 und 1990) wurden Restriktionsverdauungs-, Ligations- und PCR-ähnliche Techniken entdeckt, die die Gentechnologie beflügelten.

Verwandter Artikel: Was ist ein Genom?

Art der gentechnischen Verfahren:

Rekombinante DNA- Eine rekombinante DNA-Technologie ist eine Art der Gentechnik, bei der ein künstliches DNA-Molekül durch Ligatur zweier verschiedener DNAs mit physikalischen Methoden konstruiert wird. Dazu wird das gewünschte Gen in den Plasmid-Vektor eingefügt und für Gentransfer-Experimente verwendet.

Gen-Delivering- Die Gen-Delivering-Technik wird für die Einfügung eines Gens von Interesse in das Wirtsgenom verwendet.

Elektrophorierung, durch virale Vektoren vermittelter Gentransfer, Liposomen-vermittelter Gentransfer, Transposon-vermittelter Gentransfer sind einige der dafür verwendeten Methoden.

Gen-Editierung – Eine Gen-Editierungstechnik wird verwendet, um das Genom zu bearbeiten, indem eine unerwünschte DNA-Sequenz entfernt wird oder ein neues Gen in das Wirtsgenom eingefügt werden kann. CRISPR-CAS9, TALEN und ZFN sind einige bekannte Gen-Editing-Tools, die bei Gentherapieversuchen eingesetzt werden.

Weiterlesen: Was ist Gene Editing und CRISPR-CAS9?

Prozess der Gentechnik:

Die Gentechnik wird zu vielen verschiedenen Zwecken eingesetzt, daher muss man zunächst den Zweck des Experiments festlegen. Der gesamte Prozess der Gentechnik kann in 5 grobe Schritte unterteilt werden:

• Auswahl und Isolierung des Kandidatengens
• Auswahl und Konstruktion des Plasmids
• Gentransformation
• Insertion der DNA in das Wirtsgenom
• Bestätigung des Inserts

Auswahl und Isolierung des Kandidatengens:

Das Gen muss eine DNA-Sequenz enthalten, die wir untersuchen wollen, und dafür hat ein Gen einige besondere Eigenschaften. Ein Kandidatengen sollte einen hohen GC-Gehalt und eine wenig repetitive DNA-Sequenz haben.

Darüber hinaus darf das interessierende Gen nicht zu lang sein, nur wenige kb lange Gene können erfolgreich eingefügt werden. Je länger das Gen ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit eines Fehlschlags. Das Kandidatengen muss ein Start- und Stoppcodon enthalten. Ähnlicher Artikel: Was ist der genetische Code?

Das gewünschte Gen kann nun entweder durch Restriktionsverdau oder durch Polymerase-Kettenreaktion vom Rest der DNA isoliert werden.

Die Restriktionsendonukleasen sind bakterielle Enzyme, die in der Lage sind, die DNA-Sequenz an einer bestimmten Stelle zu verdauen. Mit einer bestimmten Art von Restriktionsendonuklease können wir unser gewünschtes Gen schneiden und isolieren.

Die Methode des Restriktionsverdaus wird in unserem vorherigen Artikel erklärt: Was ist ein Restriktionsverdau?

In der Polymerase-Kettenreaktion wird das Gen von Interesse oder das Kandidatengen mit Hilfe der Gensequenzinformation im Thermocycler amplifiziert.

Das Gerät stellt mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion Millionen von Kopien des Gens her, das uns interessiert. Durch den Prozess der Agarosegel-Elektrophorese wird das amplifizierte Gen isoliert.

Wenn das Gen, das uns interessiert, vorher gut untersucht wurde, dann ist die Information des Gens in der genetischen Bibliothek zugänglich und wir können sie für die künstliche Synthese des Gens, das uns interessiert, verwenden. (mit Hilfe der Informationen aus der genetischen Bibliothek kann das Gen auch künstlich synthetisiert werden)

Im nächsten Schritt führen wir, falls erforderlich, eine DNA-Reinigung durch. Jetzt ist unsere DNA bereit, in ein Plasmid eingesetzt zu werden.

Auswahl und Konstruktion des Plasmids:

Die Auswahl des Plasmids für das gentechnische Experiment ist einer der entscheidenden Schritte im gesamten Experiment. Bevor man das Plasmid auswählt, muss man verstehen, warum das Plasmid in den Gentransferversuchen verwendet wird.

Die Plasmid-DNA ist eine zirkuläre, doppelsträngige zytoplasmatische DNA der Bakterien, die sich unabhängig voneinander repliziert.

Wissenschaftler nutzen sie als Vehikel für den Transfer des gewünschten Gens an die Zielstelle im Genom. Es kann das Gen effizient an den Zielort übertragen. Die Struktur des Plasmids wird in der folgenden Abbildung erklärt,

Verwandter Artikel: Was ist ein Plasmid?

Zubereitung von Plasmiden:

Wählen Sie das Plasmid aus, das für Ihr Experiment geeignet ist.

Das Plasmid muss den Replikationsursprung, die Promotorregion, das Antibiotikaresistenzgen und andere wichtige Sequenzen enthalten. Mit Hilfe der Restriktionsverdauungsmethode wird eine Insertionsstelle in das Plasmid eingeführt, an die unser gewünschtes Gen ligiert wird.

Mit Hilfe der T4-DNA-Ligase wird die DNA, die uns interessiert, in das Plasmid eingefügt und ligiert. Zusammen mit dem Plasmid wird auch ein selektierbarer Marker in die Plasmid-DNA eingeführt, um die rekombinante DNA zu identifizieren.

Darüber hinaus sind in das Plasmid auch eine Promotorregion und Terminatorsequenzen für die effektive Expression eines Gens unseres Interesses aufgenommen. Ein Plasmid, das unser gewünschtes Gen und einige andere wichtige Sequenzen enthält, wird nun als rekombinantes DNA-Molekül bezeichnet.

Nun ist unsere rekombinante DNA bereit für die Expression.

Wenn wir das Klonen von Genen durchführen, wird das Plasmid in den bakteriellen Wirt eingesetzt, wofür im Allgemeinen E. Coli verwendet wird. Sobald das Bakterium anfängt, sich zu teilen, wird auch unsere rekombinante Plasmid-DNA mit repliziert.

Jetzt haben wir die Mehrfachkopien unserer Plasmid-DNA, die mit dem Plasmid-DNA-Extraktionskit extrahiert und für die Transformationsexperimente verwendet werden.

Transformation in das Wirtsgenom:

Der Transport der rekombinanten DNA in die Empfängerzelle oder das Wirtsgenom ist eine weitere langwierige und schwierige Aufgabe. Verschiedene Methoden zum Einbringen rekombinanter DNA werden für verschiedene Zelltypen verwendet, da eine einzige Methode nicht für alle Zelltypen verwendet werden kann.

Verschiedene Methoden zur Transformation:

Nutzung von Stress – Bakterien nehmen die Plasmid-DNA leicht auf, wenn sie einige Stressfaktoren wie Hitze oder elektrische Strümpfe nutzen.

Mikroinjektion- mit einer scharfen Nadel wird die DNA direkt in den Zellkern eingebracht, allerdings ist diese Methode weniger effektiv und erfordert ein höheres Maß an Fachwissen.

Elektroporation- eine der besten Methoden mit einer hohen Erfolgsquote ist die Elektrophorationsmethode, bei der die rekombinante DNA durch Permeabilisierung der Zelle mit elektrischem Strom in das Wirtsgenom eingebracht wird.

Wir haben einen ganzen Artikel darüber geschrieben. Lesen Sie ihn hier: Elektroporation- Eine moderne Gentransfertechnik.

Sonikation- Die Sonikation ist eine weitere gute Methode, die manchmal im Gentransfer-Experiment verwendet wird, bei der die rekombinante DNA mit Hilfe von Ultraschallwellen in die Zielzelle eingebracht wird. Die Ultraschallwellen erhöhen auch die Durchlässigkeit der Zellen.

Liposomen-vermittelter Gentransfer- Mit Hilfe einer künstlichen zellähnlichen Außenhülle, dem Liposom, kann rekombinante DNA in das Wirtsgenom eingebracht werden.

Gentransfer durch bakterielle Infektion- Diese Methode ist eine der beliebtesten und wird routinemäßig bei gentechnischen Experimenten an Pflanzen eingesetzt. Hier wird die Pflanzenart mit den transformierten Bakterien infiziert, um ein gewünschtes Gen einzufügen.

Agrobacterium tumifecian wird verwendet, um rekombinante DNA in die Pflanzenzelle einzufügen. Ein Gen von Interesse wird in das Ti-Plasmid des Agrobacteriums eingefügt. Die Pflanzenzellen werden von dieser Bakterienzellkultur infiziert und die transformierten Zellen werden mit Hilfe von Pflanzengewebekulturmethoden regeneriert.

Chemischer Gentransfer- Einige Metallionen, Chemikalien und Lösungen verschiedener Chemikalien werden auch bei den Gentransferversuchen eingesetzt, jedoch ist die Erfolgsrate im Vergleich zu den anderen Methoden zu gering.

Bestätigung des Inserts:

Unsere Arbeit ist noch nicht abgeschlossen.

Jetzt müssen wir uns vergewissern, ob die rekombinante DNA in unserer Zielzelle eingebaut ist oder nicht. Dazu werden verschiedene molekulargenetische Techniken eingesetzt. Bei der traditionellen Kultivierungsmethode wird das Vorhandensein oder Fehlen eines selektierbaren Markers verwendet, um transformierte Zellen von den nicht transformierten Zellen zu unterscheiden.

Bei der PCR-basierten Nachweismethode ist dies jedoch nicht notwendig. Die auf der Polymerase-Kettenreaktion basierende Nachweismethode ist weithin anerkannt und vertrauenswürdiger als andere Methoden.

Die DNA wird aus der transformierten Zelle extrahiert und mit Primern amplifiziert, die komplementär zu unserem Gen von Interesse oder unserer rekombinanten DNA sind.

Wenn die rekombinante DNA vorhanden ist, wird sie sicher amplifiziert, ansonsten wird keine Amplifikation erzielt. Für die Zwei-Faktor-Konformation wird ein Primer-Set, das spezifisch zur rekombinanten DNA komplementär ist, und ein Primer-Set, das komplementär zur Sequenz des selektierbaren Markers ist, genommen und eine Multiplex-PCR durchgeführt.

Für die Validierung der Ergebnisse muss die Amplifikation in beiden Reaktionen erhalten werden.

Aber Moment mal!

Was passiert, wenn während des Experiments eine Mutation in unserem Gen von Interesse auftritt? Denn die PCR kann nur die DNA vervielfältigen. Wir brauchen Sequenzinformationen, um die Mutation nachzuweisen.

Dazu wird die Methode der DNA-Sequenzierung verwendet.

Die DNA wird aus den transformierten Zellen extrahiert und das interessierende Gen mit der PCR amplifiziert. Die PCR-Amplikons werden nun für die DNA-Sequenzierung verwendet, bei der mit Hilfe der Fluoreszenzchemie die Sequenz unseres interessierenden Gens geordnet bestimmt wird.

Wenn alle Parameter für die Bestimmung des Gens von Interesse erfüllt sind, sind unsere Zellen nun bereit für die Injektion in den Wirtsorganismus oder für Gewebekulturversuche.

Anwendungen der Gentechnologie:

Jetzt kommen wir zum wichtigsten Punkt dieses Themas: „Wofür wird die Gentechnik eingesetzt?“

Die Gentechnik hat einen großen industriellen und landwirtschaftlichen Wert. Sie wird in der Medizin, in der Genforschung, in der Landwirtschaft, bei der Verbesserung von Nutzpflanzen und bei der Herstellung von therapeutischen Medikamenten eingesetzt.

Sie wird auch bei der Entwicklung von gentechnisch veränderten Organismen eingesetzt. Hier werden einige der wichtigsten Anwendungen der Gentechnik besprochen.

Die rekombinante DNA-Technologie wird bei der Verbesserung von Kulturpflanzen und der Entwicklung neuer wirtschaftlich wichtiger Eigenschaften eingesetzt. Einige von ihnen sind:

• Herbizidresistenz
• Virusresistenz
• Verzögerte Fruchtreife
• Veränderter Ölgehalt
• Pollenbekämpfung
• Entwicklung von kälte- und trockenheitstoleranten Pflanzenarten.

Ein klassisches Beispiel dafür ist die BT-Baumwolle – eine der Arten gentechnisch veränderter Arten verleiht der Pflanze Resistenz gegen Bacillus thuringiensis.

Prozess der Entwicklung gentechnisch veränderter Pflanzenarten:

Ein Gen von Interesse wird aus dem Organismus durch Restriktionsverdau isoliert oder durch die Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Rekombinante DNA wird konstruiert, indem ein Gen von Interesse in das Plasmid eingefügt wird, hier wird das T-Plasmid verwendet.

Im nächsten Schritt wird das T- Plasmid in das Agrobakterium eingebracht. Im letzten Schritt wird die Pflanzenart mit den transformierten Bakterienzellen infiziert und kultiviert. Der gesamte Prozess ist in der folgenden Abbildung dargestellt:

GMF- gentechnisch veränderte Lebensmittel sind eine weitere gute Anwendung der Gentechnik, bei der wirtschaftlich wichtige Lebensmittel mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden.

Das klassische Beispiel dafür ist die Flavr Savr-Tomate, eine gentechnisch veränderte Tomatensorte, die mit der Antisense-RNA-Technologie hergestellt wurde. Sie hat große wirtschaftliche Vorteile, da die gentechnisch veränderte Tomate leicht von einem Ort zum anderen transportiert werden kann.

Eine weitere wichtige Anwendung der Gentechnik sind gentechnisch veränderte oder gentechnisch hergestellte Lebensmittel.

Die Qualität einiger Lebensmittel wie Baumwolle, Mais und Sojabohnen wird durch die heutige rekombinante DNA-Technologie verbessert. Das Ziel der Entwicklung gentechnisch veränderter Nutzpflanzen oder Pflanzenarten ist es, sie wirtschaftlich wichtig, nahrhaft, proteinreich, krankheits- und stressresistent zu machen.

Mit Hilfe von Gentechnik und Gewebekulturtechniken werden sogar insektizidresistente Pflanzenarten in Tabak, Kartoffel, Mais und Baumwolle entwickelt.

Darüber hinaus können mit der vorliegenden gentechnischen Veränderungstechnik auch einige veränderte Pflanzen geschaffen werden, die in der Lage sind, ihren eigenen Dünger zu erzeugen.

Transgene Modellorganismen werden entwickelt, um verschiedene Parameter zu testen – die Funktion bestimmter Gene kann durch das Design der transgenen Mikroorganismen und Tiermodelle bestimmt werden.

Schädliche Krankheitserreger und insektizide Pasten können mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen, die in der Lage sind, Giftstoffe abzubauen, vernichtet werden.

Medizinische Anwendungen:

Mit gentechnischen Mitteln werden kostengünstige Medikamente, Hormone, Enzyme und Impfstoffe hergestellt.

Der Anti-Blutgerinnungsfaktor ist das beste Beispiel dafür, bei dem das plasminogenaktivierende Enzym, das in der Lage ist, das Blutgerinnsel aufzulösen, künstlich hergestellt und bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit oder Herzinfarkt eingesetzt wird.

Weitere Beispiele sind zwei andere therapeutische Proteine, Somatostatin und Lymphokine, die gegen verschiedene Krankheiten wirken und künstlich hergestellt werden können. Insulin ist wiederum ein klassisches Beispiel für ein therapeutisches Protein, das mit Hilfe der Gentechnik entwickelt wurde.

Ein Gen für Insulin wird durch Restriktionsverdau oder durch PCR isoliert und in ein Plasmid eingefügt. Die rekombinante Plasmid-DNA wird sofort in die Bakterien- oder Hefezelle eingebaut, in der sich das Plasmid vermehrt. Sobald sich der Mikroorganismus teilt, beginnt er mit der Herstellung von künstlichem Insulin.

Eine große Menge Insulin wird mit der gleichen Technik im industriellen Maßstab hergestellt. Ein detaillierter Überblick über die Insulinproduktion ist in der folgenden Abbildung dargestellt:

Die kommerzielle Produktion von Insulin begann nach der FDA-Zulassung im Jahr 1982.

Rekombinante Impfstoffe:

Impfstoffe gegen Pocken, Herpes-Simplex-Virus und Hepatitis werden mit Hilfe der Gentechnik hergestellt. Bei den Impfstoffen handelt es sich um inaktivierte Viruspartikel, die eine Immunreaktion gegen den jeweiligen Erreger hervorrufen sollen, allerdings ist die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination dabei hoch.

Mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie haben Wissenschaftler eine einzigartige Art von Impfstoffen entwickelt, die nur die DNA für das virale Hüllprotein enthalten, so dass der Erreger nie wieder aktiviert werden kann. Der Hauptvorteil ist, dass er sicherer, kontaminationsfrei und reaktionsfähiger ist.

Gentechnik in der Gentherapie:

Mit Hilfe der Gentherapie oder der Gentransfertechnik können vererbte genetische Störungen geheilt werden. Gentherapien für Mukoviszidose, Duchenne-Muskeldystrophie und Sichelzellenanämie befinden sich jetzt in der letzten Phase der klinischen Erprobung und sind bereit für den Einsatz am Patienten.

Bei der Gentherapie wird ein fehlerhaftes, nicht funktionierendes oder mutiertes Gen mit der gleichen Technik wie oben beschrieben durch ein Wildtyp-Gen ersetzt.

Wir haben erstaunliche Artikel zur Gentherapie veröffentlicht, lesen Sie sie hier:

1. Gentherapie: Arten, Vektoren, Verfahren, Anwendungen und Grenzen.
2. Was ist Gentherapie? und wie funktioniert sie?
3. Nackte DNA-vermittelte Gentherapie
4. Sleeping Beauty Transposon System: Die Zukunft der Gentherapie

Darüber hinaus wird die Gentechnik auch bei der Herstellung von Biokraftstoff, Krankheiten, Bioalkohol und anderen wichtigen Produkten eingesetzt.

Grenzen der Gentechnologie:

Es gibt ethische Fragen im Zusammenhang mit dem Einsatz von Gentherapie und gentechnisch hergestellten Produkten.

Um den Lebensmitteln oder anderen gentechnisch veränderten Produkten einen wirtschaftlichen Wert zu verleihen, werden auch die Nährwerte beeinträchtigt.

Aufgrund der nachteiligen Auswirkungen werden neue resistente pathogene Stämme schneller entwickelt.

Außerdem sind die Nebenwirkungen der Gentherapie und die Verwendung von Viren dabei schädlich für den Zielorganismus.

Die Technologie ist teurer, da die Gentherapie bis zu 50.000 USD kostet.

Fazit:

Das Spiel mit dem Embryo oder Fötus ist gegen das Naturgesetz, die Menschen glauben fest daran, daher werden gentechnisch veränderte Lebensmittel und Pflanzenprodukte immer wieder zum Mittelpunkt von Kontroversen.

Mit Hilfe gentechnischer Verfahren wie der Gentherapie und dem Gentransfer können jedoch Erbkrankheiten und Krebs sowie tödliche Krankheiten verhindert werden. Der positive Einsatz gentechnischer Verfahren kann das Schicksal der Menschheit verändern.

Quellen:

1. National Research Council (US) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health. Safety of Genetically Engineered Foods: Approaches to Assessing Unintended Health Effects. Washington (DC): National Academies Press (US); 2004. 2, Methods and Mechanisms for Genetic Manipulation of Plants, Animals, and Microorganisms.
2. Wallace RB. Principles of gene manipulation. Eine Einführung in die Gentechnik. Studies in Microbiology. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.