Abstract

Hyperviskosität im Sperma beeinträchtigt die Spermienmotilität und kann zu männlicher Unfruchtbarkeit führen. Ziel dieser prospektiven Studie war es, die Fähigkeit exogener DNase zur Verbesserung der Spermienqualität zu bewerten, wobei berücksichtigt wurde, dass DNase im Samenplasma verschiedener Spezies gefunden wurde und dass Neutrophile Chromatin freisetzen, um Bakterien abzufangen. In dieser Analyse wurden insgesamt siebenundsiebzig Spermaproben mit hoher Samenviskosität (HSV) als Studiengruppe und zweiundsechzig Spermaproben mit normaler Samenviskosität (NSV) als Kontrollgruppe verglichen. Diese Spermaproben wurden in drei Gruppen eingeteilt, die (a) mit DNase I bei 37°C für 15 Minuten, (b) durch Dichtegradientenzentrifugation und (c) mit einer Kombination der beiden oben genannten Methoden behandelt wurden. Nach einer fünfzehnminütigen Behandlung von hyperviskosem Sperma stieg die Beweglichkeit der Spermien in 83 % der Spermaproben in statistisch signifikantem Ausmaß an. Im Gegensatz dazu hatte die DNase-Behandlung von Sperma mit normaler Viskosität keine derartigen Auswirkungen. Die oben genannte Behandlung ging auch mit einer signifikanten Erhöhung des Prozentsatzes normaler Spermien einher, was zu einer deutlichen Verringerung des Teratozoospermie-Indexes führte. Der Vergleich zwischen den Spermaproben, die einer Dichtegradientenzentrifugation mit anschließender DNase I-Behandlung unterzogen wurden, und denjenigen, die nur mit dem Dichtegradienten behandelt wurden, zeigte, dass die Ergebnisse im ersten Fall spektakulärer waren. Die Bewertung der einzelnen Präparate im Hinblick auf die Ausbeute (prozentuale Gesamtzahl progressiv beweglicher Spermien nach der Behandlung im Verhältnis zur ursprünglichen Gesamtzahl der Spermien) ergab, dass der kombinierte Ansatz zu 29,8 % gegenüber 18,5 % bei alleiniger Dichtebehandlung führte (p=0,0121). Die Behandlung mit DNase I führt zu einer Verbesserung der Spermienmotilität und -morphologie und könnte für Männer mit hyperviskosem Sperma bei Protokollen zur assistierten Reproduktion von Vorteil sein.

1. Einleitung

Studien haben gezeigt, dass hyperviskoses Sperma (SHV) in 12-29 % der Ejakulate auftritt. SHV kann zu männlicher Unfruchtbarkeit führen, da sie die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Samenflüssigkeit stark beeinträchtigen kann. Sie wird mit einer verminderten Beweglichkeit der Spermien sowie einem schlechten Ergebnis bei der In-vitro-Fertilisation und einer erhöhten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wurde bei unfruchtbaren Männern ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Gehalt an Produkten oxidativer Schäden in der Samenflüssigkeit und der Viskosität der Samenflüssigkeit festgestellt.

Es gibt starke Hinweise auf das Vorhandensein von Hemmstoffen, die die Qualität der Spermien durch die Produktion von ROS während des Transports der Spermien durch den männlichen Genitaltrakt beeinträchtigen, Hinweise auf eine Schädigung der Spermien während der Handhabung und Lagerung im Labor, aber auch Hinweise auf eine zusätzliche Produktion von ROS „automatisch“ nach der Ejakulation, zumindest in einigen Fällen von Hyperviskosität der Samenflüssigkeit. Dieser Zustand wird meist mit einer Infektion der akzessorischen Geschlechtsdrüse des Mannes und einer Varikozele in Verbindung gebracht, auch wenn die Pathophysiologie noch nicht vollständig geklärt ist. Darüber hinaus wurde bei oligoasthenozoospermischen Proben in Fällen von seminaler Hyperviskosität eine beeinträchtigte antioxidative Kapazität der Samenflüssigkeit festgestellt. Darüber hinaus führen übermäßig hohe ROS-Werte zu einer Lipidperoxidation, die die Membranmorphologie beeinträchtigt. Das Vorhandensein einer erhöhten Anzahl von Leukozyten in der Samenflüssigkeit wird mit SHV in Verbindung gebracht. Darüber hinaus sind Leukozyten eine Hauptquelle für ROS und Vektoren von Retroviren in der Samenflüssigkeit, während ihr Vorhandensein mit einer geringeren Empfängniswahrscheinlichkeit sowie einer niedrigeren Erfolgsrate bei der intrauterinen Insemination (IUI) und der konventionellen IVF in Verbindung gebracht wurde. Außerdem korreliert SHV mit der Zusammensetzung der Samenmikrobiota und der höheren Prävalenz pathogener Bakterien.

Es wurden verschiedene therapeutische Ansätze vorgeschlagen, um die Viskosität von SHV-Samen zu verringern. Überwässerung und Prostatamassage waren nicht wirksam. Sanftes Absaugen und Ausstoßen des Spermas mit einer 5-ml-Spritze sind nahezu unwirksam, da SHV kein mechanisches Phänomen ist. Die Proteolyse durch die Verwendung von Chymotrypsin verbessert die Handhabung von hyperviskösem Sperma, obwohl einige Veränderungen in den Spermaproteinen auftreten. In Anbetracht der Tatsache, dass ein solches Verfahren die Spermienstruktur schädigen kann und dass SHV in den meisten Fällen mit Leukozytospermie korreliert, stellten wir die Hypothese auf, dass SHV durch neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) verursacht wird und dass diese empfindlich auf den DNA-Abbau durch DNase I reagieren. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht über die Verwendung von DNase I zur Behandlung von SHV.

2. Teilnehmer

Eine prospektive Studie wurde über 3 Jahre bei Patienten mit einer Vorgeschichte von Unfruchtbarkeit in der Medizinischen Klinik von Athen, Locus Medicus, mit folgenden Ausschlusskriterien durchgeführt: Varikozele, Hypogonadismus, Kryptorchismus und angeborene Obstruktion der Samenleiter. Siebenundsiebzig Spermaproben mit HSV wurden als Studiengruppe und zweiundsechzig normale Spermaproben mit NSV als Kontrollgruppe entnommen, die wie folgt geschichtet wurden. Zunächst wurde ein Satz von zweiunddreißig HSV-Samenproben und zehn NSV-Samenproben mit DNase I behandelt. Ein weiterer Satz von sechsundzwanzig HSV-Samenproben und zweiundfünfzig NSV-Samenproben wurde mit der Dichtegradientenzentrifugationsmethode (DGC) bearbeitet. Neunzehn HSV-Proben schließlich wurden mit einer Kombination der Methoden bearbeitet, d. h. zunächst mit DNase I und anschließend mit DGC. Alle Teilnehmer unterschrieben eine Einverständniserklärung, bevor sie an der Studie teilnahmen.

2.2. Spermaanalyse

Samenproben, die durch Masturbation nach 3 bis 5 Tagen sexueller Abstinenz gewonnen wurden, wurden in sterile Behälter gegeben. Nach der Entnahme wurden die Spermaproben bei 37°C verflüssigt und anschließend einer konventionellen Analyse unterzogen (Referenzwerte für die Spermaanalyse, vor und nach dem oben beschriebenen kombinierten Verfahren). Die Motilität wurde von demselben offiziell geschulten (ESHRE) Biologen bewertet, der nicht an der Studie beteiligt ist. Das Vorhandensein weißer Blutkörperchen (WBC) wurde mit dem Peroxidase-Test (Leukoscreen FertiPro; Belgien) gemäß den WHO-Richtlinien 2010 bewertet. Obwohl die Viskosität mit einem quantitativen Viskosimeter bestimmt werden konnte, wurde die Viskoelastizität des Spermas durch die Verwendung von Einwegpipetten aus Plastik, die das Sperma durch die Schwerkraft fallen ließen, und durch die Beobachtung der Länge der Fäden geschätzt. Männer, deren Sperma eine Fadenlänge zwischen 2 cm und 4 cm aufwies, wurden als Männer mit leichter SHV (53,12 %) eingestuft; eine Fadenlänge zwischen 4 cm und 6 cm (40,62 %) wurde als mäßige SHV bezeichnet; und eine Fadenlänge von mehr als 6 cm wurde als schwere SHV (6,25 %) diagnostiziert und in die Gruppe mit hoher Viskosität (HV) aufgenommen, während die Viskoelastizität als normal angesehen wurde, wenn die Fadenlänge 2 cm oder weniger betrug.

2.3. Behandlung mit Enzymen

Die Wirkung von DNase I wurde in normalen und hochviskosen Samenproben untersucht. Nach der Verflüssigung wurde DNase I in einer Endkonzentration von 20 U/ml vorsichtig in das sterile Gefäß mit der Samenprobe gegeben und ständig gemischt, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 15 bis 60 Minuten. Die Motilität und Morphologie der oben genannten Samenproben wurden vor und nach dem enzymatischen Aufschluss analysiert und der % PR (Motilität von (a+b) % der Gesamtzahl der Spermatozoen) der Spermatozoen vor jeglicher Behandlung wurde bewertet (d.h. der anfängliche % PR).

2.4. Spermaaufbereitung

Die Dichtegradientenzentrifugation (DGC) wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Der Dichtegradient wird hergestellt, indem 1 ml des 40%igen Mediums über das 80%ige Medium PureSperm® (Nidacon International, Göteborg, Schweden) in einem konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen geschichtet wird. Das Sperma wurde auf die Oberseite des Gradienten geschichtet und 20 Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Umfang und Stärke der Zentrifugation können je nach Qualität der Probe variiert werden: So kann beispielsweise die Zentrifugationszeit bei Proben mit hoher Viskosität verlängert werden. Nach der Zentrifugation muss der größte Teil des Überstands vorsichtig entfernt und das Pellet in ein neues, sauberes Röhrchen gegeben und in 5 ml Medium resuspendiert werden, um das Dichtegradientenmedium zu entfernen. Anschließend wird es 10 Minuten lang bei 200 g geschleudert, der Überstand entfernt und das endgültige Pellet in das sterile Medium für die assistierte Reproduktionstechnologie (ART) resuspendiert. Bei der kombinatorischen Behandlung schließlich wurden Proben mit hoher Viskosität zunächst mit DNase I behandelt und dann mit der oben beschriebenen DGC-Methode aufbereitet. Konzentration, Motilität und Morphologie wurden vor und nach der Aufbereitung bestimmt.

In Anbetracht der Tatsache, dass die Anzahl der progressiv beweglichen Spermien nach dem Waschen (TPMSC) für die Vorhersage der Wirksamkeit der intrauterinen Insemination nützlich sein könnte, wurde die Ausbeute der einzelnen Methoden wie folgt bewertet: Der Prozentsatz der TPMSC nach der Behandlung entweder mit dem DGC-Präparat oder mit DNase I oder mit der kombinierten DNase I-Behandlung und anschließender DGC-Aufbereitung wurde durch die Anzahl der gesamten Spermien vor der Behandlung geteilt. Darüber hinaus wurde das Ergebnis der Ausbeute (d. h. % endgültige PR/Gesamtzahl der Spermien vor der Behandlung) mit dem Prozentsatz der anfänglichen PR/Gesamtzahl der Spermien vor jeder Behandlung verglichen. Die Ausbeute wurde bei Spermaproben mit hoher oder normaler Viskosität bewertet. Obwohl es keinen Konsens über die Anzahl der verabreichten beweglichen Spermien bei der ART gibt, ist es allgemein anerkannt, dass die Wiederherstellung der maximalen Anzahl beweglicher Spermien jeder Samenprobe nach einer Behandlung von großer Bedeutung ist.

2.5. Statistische Analyse

Die Daten wurden mittels einseitiger ANOVA und anschließendem Kruskal-Wallis-Mehrfachvergleichstest unter Verwendung von GraphPad Prism 6.0 analysiert. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

Die Konzentration der weißen Blutkörperchen (WBC) ist in Abbildung 1 dargestellt. Es besteht ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen allen Gruppen (p=0,0238 one-way ANOVA). Außerdem beträgt der statistische Unterschied innerhalb der HV-Gruppe 0,0018.

Die Verwendung von DNase I erhöht die Motilität der Spermien bei Männern (32 Probanden) mit hoher Viskosität. Wie Abbildung 2(a) zeigt, verbessert die Zugabe des Enzyms für fünfzehn Minuten (t=15) den Prozentsatz der (a)-Bewegung von 2,875% Spermatozoen auf 8,094% Spermatozoen unmittelbar nach der Verflüssigung (t=0), was statistisch signifikant ist (p=0,049, Mehrfachvergleichstest). Außerdem stieg die PR-Bewegung zwischen denselben Zeitpunkten von 27,468% auf statistisch signifikante 46,59% (p<0,0001, multipler Vergleichstest). Gleichzeitig sank die Motilität der (c)-Fraktion von 34,687 % (t=0) auf 21,5 % (t=15) (p<0,0001, multipler Vergleichstest), während die Motilität der (d)-Fraktion von 37,812 % (t=0) auf 31,968 % (t=15) abnahm (p=0,45 multipler Vergleichstest). Die Verwendung von DNase I in Sperma mit normaler Viskosität erhöht die Spermatozoenmotilität in keiner Probe statistisch signifikant, wie in Abbildung 2(b) dargestellt.

Die Fortsetzung der Inkubation für weitere fünfzehn Minuten (bei 21 von 32 Probanden) (für eine Gesamtzeit von dreißig Minuten, t=30) erhöhte die Motilität eines Teils der Spermatozoen auf 9,524 % (t=30) von 1,761 % (t=0) (p=0,046, Mehrfachvergleichstest), wie in Abbildung 3 dargestellt. Interessanterweise verbesserte sich die PR-Bewegung dramatisch von 24% (t=0) auf 45,047% (t=30) (p<0,0001, multipler Vergleichstest) der Spermatozoen. Die Motilität der (c) und (d) Fraktion der Spermien nahm statistisch signifikant von 35,714% auf 22,08% (p=0,001, multipler Vergleichstest) bzw. von 40,238% auf 32,238% (p=0,039, multipler Vergleichstest) ab. Die Neubewertung der Spermienviskosität nach der DNase I-Behandlung zeigte, dass die Viskosität in den meisten Fällen normalisiert oder zumindest verbessert wurde.

Anschließend verglichen wir die Ergebnisse von Spermien, die nach der DNase I-Behandlung einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen wurden, mit denen nach der Dichtegradientenbehandlung allein. Aufgrund von Probenbeschränkungen wurden die beiden Verfahren nicht an Proben derselben Probanden angewandt, sondern an Proben verschiedener Probanden, deren Spermien eine hohe Viskosität aufwiesen. Die Dichtegradientenzentrifugation wurde auch bei der intrauterinen Insemination (IUI) eingesetzt. Wie in Abbildung 4 dargestellt, stieg der Prozentsatz der (a) Bewegung nach der Dichtegradientenzentrifugation im Anschluss an die DNase I-Behandlung von 3,416 % auf 35,083 % der Spermien (eine 10,27-fache Verbesserung) im Vergleich zu 6,333 % auf 26,866 % der Spermien (eine 4,242-fache Verbesserung) im Falle der Dichtegradientenbehandlung allein (p<0,0001, Mehrfachvergleich Kruskal-Wallis-Test). Was die (b) Bewegung betrifft, so war die Verbesserung nach der Dichtegradientenzentrifugation im Anschluss an die DNase I-Behandlung ebenfalls statistisch signifikant (von 28,583% auf 40,916% der Spermien (eine 1,43-fache Steigerung), p=0,0112). In der Behandlungsgruppe mit Dichtegradientenzentrifugation stieg die entsprechende Verbesserung von 34,533 % auf 46,466 % der Spermien (eine 1,34-fache Verbesserung), obwohl der Unterschied zwischen den Gruppen statistisch nicht signifikant war (ns, Mehrfachvergleich Kruskal-Wallis-Test). Außerdem stieg die PR-Bewegung in der ersten Gruppe von 32 % auf 76 % der Spermien (2,375-fach) im Vergleich zu einer 1,776-fachen Verbesserung in der zweiten Gruppe (von 40,866 % auf 72,666 % der Spermien) (nicht statistisch signifikant zwischen den Gruppen, Mehrfachvergleich Kruskal-Wallis-Test). Die Motilität der (c) und (d) Fraktion der Spermien sank von 36,083% auf 10,583% bzw. von 31,916% auf 13,583%. Der entsprechende Rückgang in der Gruppe mit Dichtegradientenzentrifugation allein war von 29,40 % auf 14,80 % (nicht statistisch signifikant zwischen den Gruppen, Mehrfachvergleich Kruskal-Wallis-Test).

Die nachgewaschenen TPMSC wurden im Verhältnis zur ursprünglichen Anzahl (Ausbeute) der einzelnen Präparate bewertet (M&M). Die Ausbeute der Dichtegradientenbehandlung bei einem Individuum ohne Spermaviskosität betrug 27.096% (Abbildung 5, w/o V-d). Die Ausbeute desselben Präparats im Fall von Individuen mit hoher Viskosität (Abbildung 5, HV-d) betrug 18,519 %. Die Veränderung in beiden Fällen gegenüber der jeweiligen Kontrolle (d. h. Abbildung 5, ohne V, HV) war statistisch signifikant (p<0,0001 bzw. p=0,0377, Mehrfachvergleich Kruskal-Wallis-Test), was darauf hindeutet, dass nach der DGC-Behandlung viele PR-Spermatozoen verloren gingen. Wenn Spermien von Individuen mit hoher Viskosität einer DNase-Behandlung unterzogen wurden (Abbildung 5, HV-DNase), betrug die entsprechende Ausbeute 42,47 %, während der Vergleich zwischen der Dichtegradientenbehandlung (HV-d) und der DNase-Behandlung (HV-DNase) ein p<0,0001 in Bezug auf die HV-Gruppe ergab, Mehrfachvergleich Kruskal-Wallis-Test. Trotz der Größenordnung des oben genannten Ergebnisses führt die Kombination aus DNase-Behandlung und anschließender Dichtegradientenbehandlung (Abbildung 5, HV-DNase-d) zu einer Ausbeute von 29,782 % (p=0,0121 in Bezug auf die HV-Gruppe, Mehrfachvergleich Kruskal-Wallis-Test). Darüber hinaus wurde das kombinierte Präparat (HV-DNase-d) mit dem Prozentsatz der PR-Spermatozoen in hochviskosem Sperma vor jeglicher Behandlung (Abbildung 5, HV) verglichen und ergab p=0,448, was bedeutet, dass die meisten PR-Spermatozoen wiedergefunden wurden. Darüber hinaus gibt es im Vergleich zur w/oV-d-Gruppe keinen statistisch signifikanten Unterschied (p=0,619 im Kruskal-Wallis-Mehrfachvergleichstest).

Die Beurteilung der Morphologie der Spermien nach einer fünfzehnminütigen Inkubation mit DNase I führt zu einem statistisch signifikanten Anstieg des Anteils normaler Spermien von 5,468 % auf 7,25 %, p=0,0197, wie in Abbildung 6 dargestellt. Gleichzeitig verringerten sich die Kopfanomalien von 81,75 % auf 74,937 % (p=0,0004), während die Halsanomalien von 22,062 % auf 19,343 % (p=0,0197) abnahmen. Schwanzanomalien und das zytoplasmatische Tröpfchen folgen demselben Muster. Infolge dieser morphologischen Veränderungen ist es naheliegend, dass sich dies auch auf den Teratozoospermie-Index (TZI) auswirkt. Wie in Abbildung 6 dargestellt, sank er von 1,205 auf 1,084 (p<0,0001).

4. Diskussion

In dieser Studie stellten wir die Hypothese auf, dass die Hyperviskosität des Spermas von NETs herrührt. Die vorgestellten Daten zeigen, dass der Verdau der extrudierten DNA von NETs möglich ist, was zu einer Verbesserung der Spermatozoenmotilität führt. Der enzymatische Verdau der DNA des Samenplasmas wurde mit dem Ziel untersucht, die Motilität der Spermien zu erhöhen und sie so für den Einsatz in der ART geeignet zu machen. Die Verwendung von DNase I nach der Spermienverflüssigung führte zu einer Verbesserung sowohl der Motilität als auch der Morphologie der Spermatozoen. Es wurden mehrere Inkubationszeitpunkte verwendet, um die besten Ergebnisse zu erzielen, die nach 15 Minuten Inkubation erreicht wurden. Ziel der Studie war die Verbesserung der Ausbeute bei der intrauterinen Insemination in der Kohorte der subfertilen Männer, deren Spermien durch eine hohe Viskosität gekennzeichnet sind, die höchstwahrscheinlich auf die Behinderung durch extrudierte DNA zurückzuführen ist. Darüber hinaus verbesserte die Verwendung von DNase I die abnorme Morphologie, die normalerweise mit einer hohen Viskosität einhergeht. Die Anreicherung der Spermien wurde auch anhand der endgültigen Anzahl der isolierten, sowohl schnell als auch langsam fortschreitenden Spermien bewertet.

Die statistisch signifikante Verbesserung der Morphologie der Spermien nach der Behandlung mit DNase I könnte darauf hindeuten, dass diese Anomalien nach der Ejakulation auftreten und aufgrund der hohen Viskosität erhalten bleiben. In Anbetracht der Tatsache, dass hyperviskoses Sperma eine verringerte antioxidative Gesamtkapazität aufweist, kann die Anwesenheit von Spermien in dieser Umgebung zu Lipidperoxidation und DNA-Schäden und schließlich zu morphologischen Veränderungen führen. Es hat sich gezeigt, dass zumindest einige dieser morphologischen Anomalien durch eine Behandlung mit DNase I reversibel sind. Diese Verbesserung deutet auf eine optimale Anwendung der oben genannten Behandlung in Fällen hin, in denen es nicht auf eine große Anzahl direkt beweglicher Spermien ankommt, wie bei der intrauterinen Insemination, sondern auf eine bestmögliche Morphologie, wie es bei der IVF oder dem ICSI-Verfahren zur Befruchtung der Fall ist.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung von DNase I nur bei Vorliegen einer Hyperviskosität wirksam ist. Wie Abbildung 2(b) zeigt, ist der Einsatz von DNase I bei fehlender Hyperviskosität nicht wirksam. Insbesondere bei normaler Viskosität und unabhängig von der Motilität der Spermatozoen führte der Enzymverdau zu keinem statistisch signifikanten Unterschied bei einem der untersuchten Parameter. Im Gegenteil, in der Kohorte mit hyperviskosem Sperma führte die Verwendung des Enzyms zu einer statistisch signifikanten Verbesserung der PR-Motilität, wie in Abbildung 2(a) dargestellt. Darüber hinaus gab es keine Unterschiede in der Motilität und Morphologie der Spermien in der HV-Gruppe je nach schwerer oder mittlerer Viskosität, obwohl die Anzahl der Spermaproben mit schwerer Viskosität gering war. Wie in Abbildung 5 dargestellt, beträgt der statistisch signifikante Unterschied nach der DGC-Präparation zwischen der Gruppe mit hoher Viskosität (HV-d) und der Gruppe mit normaler Viskosität (w/oV-d) 0,0179, was darauf hindeutet, dass eine Verbesserung möglich ist. Darüber hinaus führte die kombinierte Behandlung (HV-DNase-d) zur Wiederherstellung eines Prozentsatzes von PR-Spermien, der das Niveau der entsprechenden Spermien bei Männern mit hoher Viskosität (HV) vor der Behandlung erreichte, da der endgültige Prozentsatz von PR (29,782%, HV-DNase-d) im ersten Fall keinen statistischen Unterschied zum anfänglichen PR (26,478%, HV vor der Behandlung) aufweist, p=0,4480. Die Bedeutung dieses kombinierten Ansatzes, obwohl er die Ausbeute im Vergleich zur DNase-Behandlung allein verringert (p<0001 zwischen HV-d und HV-DNase), wurde durch die Tatsache untermauert, dass die Behandlung mit dem Dichtegradienten von den wiedergewonnenen Spermatozoen der Klassen (c) und (d) subtrahiert wurde, wodurch diese gereinigt wurden. Im Gegensatz dazu war der entsprechende statistische Unterschied zwischen der Ausbeute des DGC-Präparats (HV-d, 18,519 %) und „HV vor der Behandlung“ (26,478 %) signifikant (d. h. p=0,0322).

Außerdem könnte sie die mechanische Behandlung von hyperviskosem Sperma ersetzen; so wird es üblicherweise verdünnt oder in eine Injektionsnadel gezogen und durchgedrückt, um die erhöhte Viskosität zu überwinden. Allerdings sind diese Methoden wahrscheinlich nicht wirksam, da diese Art der Behandlung die ROS-Produktion erhöht. Außerdem ist die Hyperviskosität negativ mit der Chromatinintegrität korreliert, da die Dekondensation gestört ist, was bereits festgestellt wurde.

Im Allgemeinen wurde die Anwendung von DNase I in den Atemwegen bereits von der FDA im Fall von zystischer Fibrose medizinisch genehmigt. Außerdem ist DNase ein natürlicher Bestandteil des Samenplasmas, dessen Rolle wahrscheinlich in der Verdünnung von NETs besteht, die im weiblichen Fortpflanzungstrakt nach der Rekrutierung von Neutrophilen als Reaktion auf eine Entzündung gebildet werden, und das vorgeschlagene Verfahren ist potenziell medizinisch bei der ART anwendbar. Seine Rolle wird auch durch die Tatsache unterstrichen, dass sein Fehlen nachteilige Auswirkungen auf die Besamung von Primaten hat.

Hyperviskosität wird wahrscheinlich entweder durch eine Entzündung oder durch eine Funktionsstörung der Samendrüsen verursacht, obwohl der genaue Mechanismus nicht klar ist. Sie könnte mit Virusinfektionen des Genitaltrakts in Verbindung stehen, wie unser Labor bereits gezeigt hat. Mehrere therapeutische Protokolle wurden angewandt, um die Viskosität der Samenflüssigkeit zu verringern, aber nur selten waren die Ergebnisse ermutigend. Methoden wie Überwässerung und Prostatamassage haben nicht die erwarteten Ergebnisse gebracht. Die Verwendung von proteolytischen Enzymen wie Alpha-Chymotrypsin führte zwar zu hoffnungsvollen Ergebnissen, wurde aber nicht angewandt.

In einer anderen Studie wurde DNase I verwendet, um die Viskosität zu verringern, aber die endgültigen Ergebnisse waren in dieser Hinsicht nicht erfolgreich. Die Autoren untersuchten keine qualitativen Spermienparameter, d.h. die Motilität. Außerdem war die Inkubationszeit viel länger (eine Stunde) als die von uns vorgeschlagene (fünfzehn Minuten), so dass die neutrale Auswirkung auf die Viskosität möglicherweise auf die verlängerte Inkubation des Enzyms mit dem Samenplasma zurückzuführen ist.

Schließlich wurde trotz der Daten, dass die Hyperviskosität des Samens mit einer Entzündung des männlichen Genitaltrakts, d.h. der Samenblasen, korreliert, Samenblasen, was zum Einsatz von Antibiotika und Antioxidantien geführt hat, konnten diese Therapieformen diesen Zustand nur in den Fällen behandeln, in denen der Hauptfaktor die Entzündung war. In der Regel wird die Hyperviskosität durch verschiedene Faktoren verursacht, die synergistisch wirken, so dass es keine direkte ursächliche Therapie für die Hyperviskosität gibt.

Neutrophile Granulozyten, die wichtigste Leukozytenpopulation in der Samenflüssigkeit, üben ihre schützende Funktion aus, indem sie Bakterien durch Phagozytose inaktivieren und anschließend durch den Kontakt mit proteolytischen Enzymen und ROS abtöten. Eine zweite Wirkungsweise, durch die Neutrophile Krankheitserreger neutralisieren können, ist die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs). NETs sind dreidimensionale faserige Netzwerke, die hauptsächlich aus Chromatin bestehen und Mikroorganismen abfangen und immobilisieren können. NETs sind nachweislich empfindlich gegenüber dem Abbau durch DNase, aber nicht durch Protease. Da die Bildung von NETs auf DNA basiert und sich gezeigt hat, dass seminale DNase extrudierte DNA verdaut und verhedderte Spermien befreit, stellten wir die Hypothese auf, dass die Verwendung von exogener DNase sich als wertvolle Behandlung in Fällen von seminaler Hyperviskosität erweisen könnte, die hauptsächlich durch das Vorhandensein extrazellulärer, freiliegender neutrophiler DNA verursacht wird.

Aus pathophysiologischer Sicht hat sich das Konzept, das Hyperviskosität auf Entzündungen zurückführt, fast durchgesetzt. Zu den Entzündungsreaktionen gehört die Bildung von NETs aus Neutrophilen zum Abfangen von Mikroorganismen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Spermien viel Energie verbrauchen, um sich aus den NETs zu befreien, und daher ist die Untersuchung ihres Oxidations- und Apoptosestatus von großer Bedeutung. Darüber hinaus ist der bereits beschriebene „Fangeffekt“ eine Folge der Verhinderung der Bewegung der Spermien aufgrund ihrer Verankerung in den NETs.

In dieser Studie haben wir versucht, die extrazelluläre DNA des Samenplasmas, die die Hauptkomponente der NETs ist, mit DNase I zu lysieren, um sie von den NETs zu befreien und die Qualitätsparameter der Spermien, d.h. Motilität und Morphologie, wiederherzustellen. Wie Abbildung 1 zeigt, besteht außerdem ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Konzentration der weißen Blutkörperchen und dem Grad der Viskosität. Die vorgeschlagene Behandlung ist auf die Phase nach der Ejakulation und nicht auf die klinische Phase beschränkt. Darüber hinaus wurde die ursprüngliche Hypothese, dass die erhöhte Viskosität der Spermien auf das Vorhandensein von DNA im Sperma zurückzuführen ist, bestätigt, obwohl weitere Studien erforderlich sind, um diese Hypothese zu bestätigen. In Anbetracht der Tatsache, dass rekrutierte Neutrophile an entzündeten Stellen NETs bilden, stellten wir die Hypothese auf, dass die DNA im Sperma von Neutrophilen stammt. Obwohl wir keinen direkten Beweis für diese Annahme vorlegen konnten, gehen wir davon aus, dass nach unserem Kenntnisstand die Hauptquelle der DNA das Chromatin der Neutrophilen ist, das bei Entzündungen ausgeschieden wird.

5. Schlussfolgerungen

Unsere Studienergebnisse unterstützen die Schlussfolgerung, dass die Behandlung mit DNase I eine statistisch signifikante Verbesserung der Spermienmotilität und -morphologie bewirkt. Sie verbessert die grundlegenden Spermienparameter für die ART, d.h. Motilität und Morphologie, nur im Fall von hyperviskösem Sperma. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass eine Hauptursache für SHV die Bildung von NETs ist, und wir schlagen daher das therapeutische Potenzial und den Nutzen dieses Ansatzes vor.

Datenverfügbarkeit

Die Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Ethische Genehmigung

Alle Verfahren, die in dieser Studie durchgeführt wurden und an denen menschliche Teilnehmer beteiligt waren, entsprachen den ethischen Standards der Bioethik- und Deontologiekommission der Nationalen Kapodistrianischen Universität Athen, Medizinische Fakultät, die im Januar 2014 genehmigt wurde (Referenznummer: 1130).

Einverständnis

Alle Patienten gaben vor ihrer Teilnahme an der Studie ihr informiertes Einverständnis.

Interessenkonflikte

Alle Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Beiträge der Autoren

Angelos D. Gritzapis und Vassilis Tsilivakos konzipierten die Studie. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis und Vassilis Tsilivakos führten die Datenerfassung durch, wirkten an der Gestaltung mit und verfassten das Manuskript. Effrosyni Nosi führte die Immunoassays durch und Angelos D. Gritzapis führte die statistische Analyse durch. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti und Vassilis Tsilivakos beteiligten sich an der Analyse und Interpretation der Daten. Alle Autoren lasen und genehmigten die endgültige Fassung des Manuskripts.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde vom Clinical Diagnostic Laboratory, Locus Medicus S.A.

finanziert.