Abstract

Bäume der Gattung Copaifera sind in den tropischen Regionen Lateinamerikas und Westafrikas heimisch. Copaifera sp wird weithin als Volksmedizin verwendet und hat verschiedene ethnopharmakologische Indikationen, darunter Gonorrhoe, Bronchitis, Asthma, Hautgeschwüre, Geschwüre, Halsschmerzen, Gebärmutterinfektionen, allgemeine Entzündungen, Krebs und Leishmaniosen. Kaurensäure ist ein natürlich vorkommendes Diterpen, das in Copaifera vorkommt und als entzündungshemmendes Mittel, zur Behandlung von Geschwüren, Leishmaniose und Krebs verwendet wird. In Anbetracht der Tatsache, dass der Ames-Test ein hervorragendes Instrument zur Bewertung der Sicherheit von Extrakten, Ölen und Phytochemikalien ist, die aus Heilpflanzen isoliert wurden, haben wir das mutagene Potenzial von vier Arten der Gattung Copaifera untersucht, und zwar von Oleoresinen (C. oblongifolia; C. langsdorffii) und Blattextrakten (C. lucens; C. multijuga) sowie von Kaurensäure, einer ihrer wichtigsten Verbindungen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Copaifera spp. und die Kaurensäure bei allen im Ames-Test untersuchten Konzentrationen keinen Anstieg der Anzahl der revertierenden Kolonien ohne mutagene Wirkung in den Experimenten verursachten. Die in unserer Studie erzielten Ergebnisse unterstützen die sichere Verwendung der ausgewählten Heilpflanzen der Gattung Copaifera und der Kaurensäure.

1. Einleitung

Im Laufe der Geschichte haben verschiedene Kulturen Pflanzen für medizinische Zwecke verwendet. In der Tat haben sich Pflanzen als Quelle von Arzneimitteln für die Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheiten erwiesen. Heute spielen pflanzliche Systeme weiterhin eine wesentliche Rolle für die Gesundheit, und das Interesse an pflanzlichen Arzneimitteln hat weltweit zugenommen, so dass Pflanzen immer noch als Quelle für neue Arzneimittel untersucht werden.

Bäume der Gattung Copaifera sind in den tropischen Regionen Lateinamerikas und Westafrikas heimisch. Die Gattung Copaifera gehört zur Familie der Leguminosae und umfasst 72 Arten. Auf brasilianischem Gebiet gibt es über 20 Copaifera-Arten, die dort „copaibeiras“, „pau d’óleo“ oder „copaíbas“ genannt werden. Copaifera spp. sind in der Volksmedizin weit verbreitet. Sie haben verschiedene ethnopharmakologische Indikationen, wie die Behandlung von Gonorrhoe, Bronchitis, Asthma, Hautgeschwüren, Geschwüren, Halsentzündungen, Gebärmutterinfektionen, allgemeinen Entzündungen, Krebs und Leishmaniosen .

In der wissenschaftlichen Literatur finden sich zahlreiche Berichte über die pharmakologischen Aktivitäten von Copaifera-Arten, wie z.B. ihre entzündungshemmende, antitumorale, antiproliferative, anthelmintische, antituberkuläre, gastroprotektive, chemopräventive, immunmodulatorische und antibakterielle Wirkung.

Kaurensäure ist ein Diterpen, das natürlich in einigen brasilianischen Pflanzen vorkommt, darunter auch in Copaifera-Oleoresinen. Der Kaurensäure wurden zahlreiche pharmakologische Eigenschaften zugeschrieben, wie z. B. ihre entzündungshemmende Wirkung, ihre Verwendung zur Behandlung von Geschwüren und ihr antiparasitäres, schmerzstillendes und krebshemmendes Potenzial.

Da natürliche Verbindungen traditionell verwendet werden, wird häufig angenommen, dass sie sicher sind. Zahlreiche Studien haben jedoch gezeigt, dass mehrere in der traditionellen Medizin verwendete Pflanzenarten mutagene, karzinogene oder toxische Wirkungen aufweisen. Dennoch werden eine Reihe von Pflanzen und phytotherapeutischen Produkten weiterhin verwendet, ohne dass ihre Sicherheit wissenschaftlich nachgewiesen ist.

Der Ames-Test ist weltweit bekannt für seine Fähigkeit, durch verschiedene Agenzien verursachte Punktmutationen zu erkennen. Bei diesem Test werden indikative Salmonella-Typhimurium-Stämme verwendet, die empfindlich auf Substanzen reagieren, die verschiedene Arten von Mutationen hervorrufen. Auf der Grundlage des Ames-Tests kann die mutagene Wirkung einer Verbindung in Abhängigkeit von der S. Typhimurium-Konzentration bestimmt werden. Dieser Test wird weltweit für ein erstes Screening des mutagenen Potenzials neuer Arzneimittel eingesetzt. Eine mutagene Reaktion hat einen hohen prädiktiven Wert für die Karzinogenität. Im Laufe der Jahre haben die wissenschaftliche Gemeinschaft, Behörden und Unternehmen den Wert dieses Tests erkannt.

In Anbetracht der Tatsache, dass der Ames-Test ein hervorragendes Instrument zur Bewertung der Sicherheit von Extrakten, Ölen und Phytochemikalien ist, die aus Heilpflanzen isoliert wurden, haben wir diesen Test verwendet, um das mutagene Potenzial der Oleoresine oder Blattextrakte von vier Copaifera-Arten und von Kaurensäure zu bewerten.

2. Materialien und Methoden

2.1. Pflanzenmaterial

Das Pflanzenmaterial wurde zwischen August 2012 und Mai 2014 in verschiedenen brasilianischen Bundesstaaten gesammelt. Die Pflanzenbelege wurden entweder von Dr. Regina Celia Vianna Martins da Silva vom botanischen Labor der brasilianischen Agrarforschungsgesellschaft (Embrapa), Belém, Bundesstaat Pará, Brasilien, oder von Dr. Milton Groppo Junior von der Abteilung für Biologie der Universität von São Paulo, Campus Ribeirão Preto, Bundesstaat São Paulo, Brasilien, identifiziert, wo die Belege hinterlegt wurden. Tabelle 1 enthält Informationen über die Belegexemplare.

Um die Oleoresine von C. oblongifolia und C. langsdorffii zu gewinnen, wurde mit einem Erdbohrer ein Loch mit einem Durchmesser von etwa einem Zoll gebohrt. Das Loch wurde in der Mitte des Baumstamms, einen Meter über dem Boden, gebohrt. Das Oleoresin wurde mit Hilfe eines Rohrs, das an einen Filter angeschlossen war, in eine bernsteinfarbene Flasche abgeleitet. Nachdem das Oleoresin aufgefangen worden war, wurde das Loch ordnungsgemäß verschlossen.

Die Blätter von C. lucens und C. multijuga wurden 48 Stunden lang bei 40°C luftgetrocknet oder gefriergetrocknet und in einem Mixer pulverisiert. Das erhaltene Pulver wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur in Ethanol/Wasser 7:3 mazeriert. Nach der Filtration wurde das Lösungsmittel unter 40°C im Vakuum verdampft. Diese Prozedur wurde viermal wiederholt, und die Extrakte wurden vereinigt, unter Vakuum konzentriert und gefriergetrocknet, was einen durchschnittlichen Anteil von 20 % (w/w) an rohen hydroalkoholischen Blattextrakten ergab.

Kaurensäure (Abbildung 1), Reinheit über 99 %, wurde wie von Simão et al. beschrieben isoliert. Die Copaifera Spezies Oleoresine und Blätter wurden gesammelt und die Forschung wurde nach Genehmigung durch die brasilianische Regierung durch SISBIO (Biodiversity Information and Authorization System #35143-1) und CGEN (Genetic Heritage Management Council #010225/2014-5) entwickelt.

Abbildung 1

Chemische Struktur der Kaurensäure.

2.2. Ames-Test

Der Ames-Test wurde zur Untersuchung der Mutagenität von Copaifera spp. verwendet. Die von Maron und Ames entwickelte Methode der Vorinkubation mit und ohne exogene Aktivierung (S9) wurde zur Analyse verschiedener Salmonella-Typhimurium-Stämme (TA98, TA100, TA97a und TA102) angewandt, um Mittel zu identifizieren, die Genmutationen verursachen. Die Teststämme, die freundlicherweise von Dr. B.N. Ames (Berkeley, CA, USA) zur Verfügung gestellt wurden, wurden aus gefrorenen Kulturen 12-14 Stunden lang über Nacht in Oxoid Nutrient Broth Number 2 gezüchtet.

Für den Test der mutagenen Aktivität wurden verschiedene Konzentrationen jedes Oleoresins, jedes Extrakts oder der in DMSO gelösten Kaurensäure zu 0,1 mL Bakterienkultur in 0,5 mL Phosphatpuffer 0,2 M oder 0,5 mL 4%iger S9-Mischung gegeben und bei 37°C für 20-30 min inkubiert. Die Konzentrationen reichten von 62,5 bis 500 μg/Platte für C. lucens (Extrakt), von 120 bis 1000 μg/Platte für C. multijuga (Extrakt), von 125 bis 1000 μg/Platte für C. oblongifolia (Oleoresin), von 500 bis 4000 μg/Platte für C. langsdorffii (Oleoresin) und von 25 bis 200 μg/Platte für die Kaurensäure. Diese Konzentrationen wurden auf der Grundlage eines vorläufigen Toxizitätstests ausgewählt. Bei allen nachfolgenden Versuchen war die obere Grenze des geprüften Dosisbereichs entweder die höchste nicht toxische Dosis oder die niedrigste toxische Dosis, die im vorläufigen Versuch ermittelt wurde. Die Toxizität wurde entweder als Verringerung der Anzahl der Histidin-Revertanten (His+) oder als Ausdünnung des auxotrophen Hintergrundrasens nachgewiesen.

Das Stoffwechselaktivierungsgemisch (S9-Fraktion), das aus den Lebern von Sprague-Dawley-Ratten hergestellt wurde, die mit dem polychlorierten Biphenylgemisch Aroclor 1254 (500 mg/kg) behandelt wurden, wurde von Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, USA) erworben und vor jedem Test frisch zubereitet. Das Stoffwechselaktivierungssystem bestand aus 4 % S9-Fraktion, 1 % Magnesiumchlorid 0,4 M, 1 % Kaliumchlorid 1,65 M, 0,5 % D-Glucose-6-Phosphat-Dinatrium 1 M und 4 % Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat-Natriumsalz (NADP) 0.1 M in 50 % Phosphatpuffer 0,2 M und 39,5 % sterilem destilliertem Wasser.

Nach der Inkubation wurden 2 ml Top-Agar zugegeben, und die Mischung wurde auf eine Platte mit Minimal-Agar gegossen. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37°C bebrütet, und die His+ Revertantenkolonien wurden manuell gezählt.

Die Ergebnisse wurden mit dem statistischen Softwarepaket Salanal 1.0 (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, vom Research Triangle Institute, RTP, NC, USA) analysiert; das Modell von Bernstein et al. wurde übernommen. Die Daten (Revertanten/Platte) wurden mittels Varianzanalyse (ANOVA) und anschließender linearer Regression bewertet. Der Mutagenitätsindex (MI) wurde ebenfalls für jede getestete Konzentration berechnet und entsprach der durchschnittlichen Anzahl der Revertanten pro Testplatte geteilt durch die durchschnittliche Anzahl der Revertanten pro Lösungsmittelkontrollplatte. Eine Probe wurde als mutagen betrachtet, wenn eine Dosis-Wirkungs-Beziehung festgestellt wurde und der MI bei einer oder mehreren Konzentrationen höher als zwei war (MI > 2).

Die folgenden Standardmutagene wurden als Positivkontrollen in Experimenten ohne S9-Mischung verwendet: 4-Nitro-O-phenylendiamin (10 μg/Platte) für TA98 und TA97a, Natriumazid (1,25 μg/Platte) für TA100 und Mitomycin C (0,5 μg/Platte) für TA102. Bei Versuchen mit S9-Aktivierung wurde 2-Antramin (1,25 μg/Platte) als Positivkontrolle für TA98, TA97a und TA100 und 2-Aminofluoren (10 μg/Platte) als Positivkontrolle für TA102 verwendet. DMSO diente als Lösungsmittelkontrolle (100 μl/Platte), und die Negativkontrolle entspricht der Rate der spontanen Reversion der einzelnen Stämme.

3. Ergebnisse

Tabelle 2 zeigt die mittlere Anzahl der Revertanten/Platte (M), die Standardabweichung (SD) und den mutagenen Index (MI), die für S. Typhimurium-Stämme TA98, TA100, TA102 und TA97a in Anwesenheit (+S9) oder in Abwesenheit (-S9) von Stoffwechselaktivierung nach Probenbehandlung mit dem Ziel-Oleoresin, -Extrakt oder -Verbindung.

Weder die Blattextrakte von C. lucens und C. multijuga noch die Oleoresine von C. langsdorffii und C. oblongifolia verursachten genetische Mutationen, wie der Ames-Test beweist. Auch die Kaurensäure erhöhte die Zahl der revertanten Kolonien nicht, so dass sie bei keiner der untersuchten Konzentrationen oder bei keinem der untersuchten Stämme mutagene Wirkungen hatte. Die Lösungsmittelkontrolle (DMSO) unterschied sich in der Anzahl der Revertanten nicht signifikant von der Negativkontrolle.

4. Diskussion

Die von Pflanzen ausgeübten mutagenen Wirkungen sind für den Menschen nicht leicht zu erkennen, und es können schädliche Langzeitfolgen wie Krebs auftreten. In der wissenschaftlichen Literatur wird daher immer wieder betont, wie wichtig es ist, Heilpflanzen auf ihre mutagene Wirkung hin zu untersuchen. In diesem Sinne haben wir hier das mutagene Potenzial von Copaifera spp. und Kaurensäure mit Hilfe des Ames-Tests untersucht. Akyıl und Konuk betonten, dass der Nachweis genotoxischer Wirkstoffe häufig auf der Verwendung von Bakterien als Testorganismen beruht. So ist der Ames-Test (oder Salmonellen-/Mikrosomen-Test) die am häufigsten verwendete Methode zum Nachweis der mutagenen Wirkung genotoxischer Stoffe.

Die Durchführung des Ames-Tests mit verschiedenen Stämmen ist von großer Bedeutung, wenn man die Besonderheiten der einzelnen Stämme in Bezug auf den Test berücksichtigt. So resultiert der hisG46-Marker im Stamm TA100 aus der Substitution eines Leucins (GAG/CTC) durch ein Prolin (GGG/CCC). Diese Mutation wird durch Mutagene, die hauptsächlich an einem der GC-Paare Basenpaar-Substitutionsmutationen verursachen, in den Wildtyp-Zustand zurückverwandelt. Die vom Stamm TA98 getragene hisD3052-Mutation ist eine -1-Rahmenverschiebungsmutation, die das Leseraster einer nahe gelegenen repetitiven -C-G-C-G-C-G-C-G-Sequenz betrifft. Die Reversion der hisD3052-Mutation zurück in den Wildtyp-Zustand wird durch verschiedene Frameshift-Mutagene wie 2-Nitrofluoren und verschiedene aromatische Nitroso-Derivate von Aminkarzinogenen induziert. Die hisD6610-Mutation im Stamm TA97a trägt ebenfalls eine +1-Rahmenverschiebungsmutation (Cytosin), die zu einem Lauf von 6 Cytosinen (-C-C-C-C-C-C-) führt. Es wird angenommen, dass dieser Stamm empfindlicher gegenüber einigen der Mutagene ist, die den Stamm TA98 umkehren. Der Stamm TA102 wurde entwickelt, der AT-Basenpaare an der Mutationsstelle hisG428 enthält. Die Mutation befindet sich auf dem Multikopie-Plasmid pAQ1. Das Plasmid verleiht Tetracyclin-Resistenz, was ein geeigneter Marker für den Nachweis des Plasmids ist. Bei der hisG428-Mutation handelt es sich um eine ockerfarbene Mutation, TAA, im hisG-Gen, die durch alle sechs möglichen Basenpaarveränderungen – sowohl Transitionen als auch Transversionen – rückgängig gemacht werden kann. Diese Mutation wird auch durch Mutagene rückgängig gemacht, die oxidative Schäden verursachen, sowie durch Vernetzungsmittel.

Außerdem kann eine biologisch aktive Chemikalie in einen inaktiven Metaboliten biotransformiert werden. Ebenso kann eine inaktive Chemikalie in einen aktiven Metaboliten biotransformiert werden. Daher ist es wichtig, die S9-Fraktion im Ames-Test zu verwenden: Sie ermöglicht die Durchführung von Analysen in Gegenwart des Metabolismus und liefert dadurch zuverlässigere Ergebnisse.

In Bezug auf die Sicherheit haben nach unseren Erkenntnissen weder die Kaurensäure noch die untersuchten Pflanzen (Extrakte und Oleoresine) mutagene Wirkungen in den verschiedenen Stämmen von Salmonella Typhimurium ausgeübt, unabhängig von der S9-Aktivierung.

Die meisten Arbeiten über die Gattung Copaifera berichten über Oleoresine, die aus dem Baumstamm gewonnen werden. Aber auch die Untersuchung von Blattextrakten ist von Bedeutung, da sie vielversprechende bioaktive Moleküle enthalten. In der Tat war die Suche nach Heilung von Krankheiten durch Blattaufguss möglicherweise eine der ersten Arten der Verwendung von Naturprodukten, eine Praxis, die auch heute noch angewandt wird.

Viele Copaifera spp. werden in verschiedenen Ländern gerne als Heilpflanzen verwendet, da diese Arten zahlreiche pharmakologische Eigenschaften aufweisen. Für die Kaurensäure wurden ebenfalls mehrere biologische Wirkungen berichtet.

Unsere Studie ist die erste, die die Sicherheit der Arten C. lucens und C. oblongifolia untersucht und auch C. langsdorffii in Oleoresin für die Untersuchung der Mutagenität verwendet. Die Auswirkungen von C. multijuga (Oleoresin/Extrakt) auf die DNA wurden in früheren Studien untersucht, allerdings mit anderen Techniken als in unserer Studie, bei der der Ames-Test verwendet wurde. Unsere Ergebnisse stimmen also mit den von anderen Autoren veröffentlichten Daten überein, die andere Copaifera-Arten und ihre chemischen Bestandteile getestet oder andere Versuchsmodelle verwendet haben und gezeigt haben, dass sie die DNA nicht schädigen.

Auf diese Weise haben das Oleoresin von C. multijuga und sein chemischer Marker, das Diterpen Kopalsäure, von Alves et al. durch den Mikronukleus-Assay (V79-Zelle) und den Ames-Test für die In-vitro-Studie sowie durch Mikronukleus- und Komet-Assays (Schweizer Mäuse) für die In-vivo-Studie bewertet. Die erhaltenen Daten zeigen, dass keiner der beiden Stoffe unter den verwendeten Versuchsbedingungen eine genotoxische/mutagene Wirkung ausübt. Im Vergleich zu unseren Ergebnissen deuten diese Daten darauf hin, dass bei C. multijuga sowohl der in unserer Studie untersuchte Extrakt als auch das von Alves et al. untersuchte Oleoresin keinen Einfluss auf die Anzahl der revertanten Kolonien im Vergleich zur Negativkontrolle im Ames-Test haben; dasselbe gilt für Kopalsäure und Kaurensäure. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unabhängig von der Stoffwechselaktivierung keine Mutagenität vorliegt.

In einer kürzlich durchgeführten Studie bewerteten Furtado et al. das genotoxische Potenzial von C. multijuga und die Ergebnisse zeigten, dass keine DNA-Schäden auftreten, da die Behandlung sowohl mit Oleoresin als auch mit dem Blattextrakt von C. multijuga die Mikronukleus-Häufigkeit in vitro (V79-Zelle) und in vivo (Schweizer Mäuse) nicht signifikant erhöht. Darüber hinaus untersuchten die Autoren auch Extrakte und Oleoresine anderer Arten dieser Gattung, wie C. duckei, C. reticulata, C. paupera und C. pubiflora, und ebenso wie bei C. multijuga wurde auch bei allen anderen getesteten Arten keine Genotoxizität festgestellt.

Die Ergebnisse der Studien von Alves et al. und Batista et al. zeigen, dass der Extrakt von C. langsdorffii die Häufigkeit von Mikrokernen (Schweizer Mäuse) im peripheren Blut bzw. im Knochenmark nicht signifikant erhöht. In einer anderen Studie zeigte der Comet-Assay mit Wistar-Ratten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Tieren, die nur mit dem C. langsdorffii-Extrakt behandelt wurden, und der negativen Kontrollgruppe. Diese Daten zeigen, dass der Extrakt keine Genotoxizität aufweist.

Der In-vivo-Mikronukleustest und der Comet-Assay mit Wistar-Ratten haben gezeigt, dass der Extrakt aus Copaifera malmei nicht genotoxisch ist und eine antimutagene Wirkung hat. Darüber hinaus ergaben die subchronischen Toxizitätstests keine toxikologisch relevanten Veränderungen, die anhand von Verhaltens-, biochemischen und hämatologischen Analysen über einen Zeitraum von bis zu 30 Tagen festgestellt werden konnten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Extrakt aus Copaifera malmei eine hohe Sicherheitsspanne für die therapeutische Anwendung aufweist. Toxizitäts- und Genotoxizitätsuntersuchungen zeigten, dass die Verwendung von Copaiba-Öl ebenfalls sicher ist: Die histopathologische Bewertung zeigte keine Veränderungen bei den mit Copaiba-Öl behandelten Tieren, und die Mutagenitätsbewertung (Mikronukleustest; 2000 mg/kg Körpergewicht) zeigte keine genotoxischen Wirkungen.

Leandro et al. wendeten den Ames-Test an, um zu zeigen, dass der C. trapezifolia-Extrakt gegenüber denselben Salmonella-Typhimurium-Stämmen, die hier getestet wurden, nicht mutagen ist, unabhängig von der metabolischen Aktivierung.

In Bezug auf die chemische Zusammensetzung der verschiedenen Copaifera-Arten wurden durch UPLC-MS/MS- und CG/MS-Analysen der Oleoresine saure Diterpene und wichtige flüchtige Sesquiterpene identifiziert, während in den Blättern hohe Gehalte an phenolischen Verbindungen einschließlich Flavonoid-Heterosiden und Galloylchinasäure-Derivaten nachgewiesen wurden. Unter den Inhaltsstoffen des Oleoresins sind die Diterpene bei weitem die wichtigsten Komponenten und umfassen ent-Agatensäure, ent-Copalinsäure und ent-Kaurensäure, gefolgt von Sesquiterpenen wie β-Bisabolen, α-Humulen und trans-β-Caryophyllen. Die hydroalkoholischen Extrakte aus den Blättern der Copaifera-Arten enthalten hauptsächlich Quercetin, Afzelin und Chinasäuren.

Nach Almeida et al. sind das Copaiba-Oleoresin (kommerzielles Produkt) und seine Fraktionen, die Sesquiterpene, Methylester von Diterpencarbonsäure und hohe β-Caryophyllen-Gehalte enthalten, nicht genotoxisch, wie durch den in vivo Comet-Assay oder den Mikronukleus-Test nachgewiesen wird. β-Caryophyllen, der Hauptbestandteil der Oleoresine und der flüchtigen Fraktionen, fördert keine zytotoxischen oder genotoxischen Effekte in menschlichen Lymphozytenkulturen und schützt vor DNA-Schäden, die durch Ethylmethansulfonat induziert werden. Die Bewertung von neun Sesquiterpenen, einschließlich trans-Caryophyllen, durch den Ames-Test hat gezeigt, dass keine der Verbindungen mutagen ist.

In einer kürzlich durchgeführten Studie hat die Behandlung von Magenkrebs- und normalen Magenschleimhaut-Zelllinien mit Kaurensäure gezeigt, dass die Säurekonzentration stark mit dem DNA-Schadensindex und mit der Mikronukleus-Häufigkeit korreliert, wie durch den Comet-Assay bzw. den Mikronukleus-Test bestimmt. Andererseits berichteten Cavalcanti et al., dass niedrige Konzentrationen von Kaurensäure, einem bioaktiven Diterpenoid, das aus C. langsdorffii extrahiert wird, weder DNA-Schäden noch eine Veränderung der Mikronukleus-Häufigkeit in V79-Zellen hervorrufen. Eine signifikant erhöhte DNA-Schädigung zeigte sich erst, nachdem die Zellen höheren Kaurensäurekonzentrationen (30 oder 60 μg/mL) ausgesetzt waren.

Hier wurde die Kaurensäuretoxizität für jeden untersuchten Salmonella Typhimurium-Stamm bestimmt, indem Säurekonzentrationen verwendet wurden, die an der Toxizitätsgrenze ansetzen. Höhere Kaurensäurekonzentrationen verhindern das Bakterienwachstum, was es uns ermöglichte, das mutagene Potenzial dieser Verbindung zu bewerten. Auf der Grundlage unserer Ergebnisse sind die hier getesteten Oleoresine selbst bei den höchsten untersuchten Konzentrationen nicht mutagen.

Die Verwendung unterschiedlicher Organismen oder verschiedener Testsysteme kann laut Literatur unterschiedliche Ergebnisse liefern. Dies liegt daran, dass die Testsysteme für Genotoxizität und Mutagenität in zwei Gruppen unterteilt werden. Zytogenetische Methoden analysieren Eukaryoten und liefern Informationen, die von Genmutationen bis hin zu Chromosomenschäden und Aneuploidien reichen. Im Gegensatz dazu analysieren bakterielle Methoden Prokaryonten und liefern Informationen über Genmutationen und primäre DNA-Schäden, die durch einen Wirkstoff verursacht werden.

So wurden Tests wie Schwesterchromatidaustausch, Chromosomenaberration und Mikronukleus angewandt, um DNA-Schäden auf chromosomaler Ebene im Human-Biomonitoring nachzuweisen, während der Ames-Salmonella/Mikrosomen-Mutagenitätstest ausgiebig eingesetzt wurde, um die mutagene Aktivität zahlreicher chemischer Substanzen und roher Pflanzenextrakte zu überprüfen.

Nach Ferguson können Substanzen im Falle von Säugetierzellen klastogen sein, was bei den im Mikronukleustest verwendeten Substanzen der Fall ist. Dieselben Substanzen können jedoch in bakteriellen Tests, wie dem Ames-Test, negativ getestet werden. Daher ist es wichtig, die Sicherheit von Pflanzen oder ihren chemischen Verbindungen zu bewerten, indem man sich auf die Bewertung der verschiedenen Arten von genetischen Schäden konzentriert. Es wird empfohlen, den Ames-Test mit In-vitro-Untersuchungen an Säugetierzellen zu verbinden, da sie mehrere wesentliche mutagene Parameter (genetische Mutationen, strukturelle Chromosomenschäden und Aneuploidie) abdecken können und auch die Tests in prokaryotischen und eukaryotischen Systemen abdecken. Darüber hinaus wird in der Literatur darauf hingewiesen, dass die Untersuchung mit dem Ames-Test nicht ausgelassen werden sollte, da der bakterielle Genmutationstest alle relevanten Wirkungsweisen nachweist, die spezifisch zu Genmutationen führen.

In früheren Arbeiten wurde beobachtet, dass Verbindungen ausschließlich in einer oder mehreren Säugetierzelllinien positiv sein können, d.h. die positiven Ergebnisse wurden nicht durch den Ames-Test oder In-vivo-Tests unterstützt. In der Tat werden die zunächst mit dem Ames-Test erzielten Ergebnisse anschließend in Tierversuchen reproduziert; daher hat das Fehlen von Mutagenität im Ames-Test die Herstellung neuer Arzneimittel mit weniger Nebenwirkungen ermöglicht. Diese Daten unterstreichen die Bedeutung von Studien wie der unseren, die das Fehlen der Mutagenität von Pflanzen und ihren Hauptbestandteilen mit Hilfe des Ames-Tests nachweisen.

5. Schlussfolgerungen

Insgesamt unterstützen unsere Ergebnisse die sichere Verwendung der ausgewählten Heilpflanzen der Gattung Copaifera. Allerdings könnten die mutagenen Wirkungen einzelner Verbindungen durch antagonistische Wirkungen anderer in den Extrakten oder Oleoresinen vorhandener Verbindungen überdeckt werden. Somit zeigen unsere Ergebnisse auch, dass sowohl die Kaurensäure als auch die untersuchten Heilpflanzen als potenziell sicher für die therapeutische Anwendung angesehen werden können.

Datenverfügbarkeit

Die Daten, die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind in dem Artikel enthalten.

Weitergabe

Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende und Jaqueline Lopes Damasceno hatten vollen Zugang zu allen Daten der Studie und übernehmen die Verantwortung für die Integrität der Daten und die Genauigkeit der Datenanalyse.

Interessenkonflikte

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Beiträge der Autoren

Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani und Jairo Kenupp Bastos leisteten wesentliche Beiträge zur Konzeption und Gestaltung, Erfassung, Analyse und Interpretation der Daten. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende und Carlos Henrique Gomes Martins waren an der Ausarbeitung des Manuskripts beteiligt oder haben es wegen wichtiger intellektueller Aspekte kritisch überarbeitet. Carlos Henrique Gomes Martins und Flávia Aparecida Resende erklärten sich bereit, für alle Aspekte der Arbeit verantwortlich zu sein. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Danksagungen

Die Autoren danken CAPES (Koordination für die Verbesserung des Hochschulpersonals), CNPq (Nationaler Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung) und der Forschungsstiftung von São Paulo (FAPESP, Zuschüsse Nr. 2011/13630-7 und 2012/25237-0) für die finanzielle Unterstützung sowie der Universität Franca für die erhaltene Unterstützung. Jaqueline Lopes Damasceno war Empfängerin eines CAPES-Promotionsstipendiums (Koordination für die Verbesserung des Hochschul- oder Bildungspersonals).