γδ-selection

γδT cells emerge from DN thymocytes, as the rearrangement of the TCRγ and δ chains occurs in the DN stages . γδ-Vorläuferzellen, bei denen TCRγ und δ vor der TCRβ-Rekombination neu angeordnet sind, exprimieren den γδTCR/CD3-Komplex an der Plasmamembran, wo γδTCR wie der Prä-TCR selbstoligomerisiert und intrazelluläre Signalwege initiiert. Dieses γδTCR-Signal löst den als „γδ-Selektion“ bezeichneten Prozess aus, der die Bildung funktioneller TCRγδ-Ketten bestätigt und die Zelle erkennen lässt, dass „ich eine γδT-Zelle bin“.

Das γδ-Selektion-Signal löst die Differenzierung von CD5- CD24-hohen γδ-Vorläuferzellen zu CD5+ CD24-niedrigen γδT-gebundenen Zellen aus. Der Übergang von CD5- zu CD5+ γδT-Zellen ist bei Syk-defizienten Mäusen deutlich beeinträchtigt, während Zap70-defiziente Mäuse eine normale Differenzierung von CD5+ γδT-Zellen aufweisen. Bei Mäusen mit doppeltem Zap70/Syk-Mangel ist die Differenzierung der γδT-Zellen im CD5-Vorläuferstadium vollständig gestoppt. Die γδ-Selektion hängt also hauptsächlich von dem durch Syk vermittelten Signal ab, und Zap70 spielt bei diesem Prozess nur eine untergeordnete und redundante Rolle. Dieser Mechanismus ist ganz analog zu dem der β-Selektion. Ein kritisches Ziel des Syk-Signals bei der γδ-Selektion ist das Lat-Signalosom, da Lat-defiziente Mäuse eine vollständige Hemmung der γδ-Selektion und einen völligen Mangel an reifen γδT-Zellen aufweisen.

γδ-Vorläuferzellen von Syk/Zap70-defizienten Mäusen oder Lat-defizienten Mäusen sind durch die Expression ihrer Zelloberflächenproteine mit Ausnahme des γδTCR nicht von Zellen der αβT-Linie zu unterscheiden und behalten dennoch das Potenzial, sich in αβT-Zellen zu differenzieren. Was bestimmt das Differenzierungsschicksal in die αβT- oder γδT-Linie aus dem Vorläufer? Dieser Frage wurde in Studien mit γδTCR-transgenen Mäusen nachgegangen. Wenn das γδTCR-Signal durch einen Mangel an Signalproteinen oder endogenen Liganden für das transgene γδTCR geschwächt wird, entstehen aus den Vorläuferzellen DP-Zellen der αβT-Linie auf Kosten der Zellen der γδT-Linie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein stärkeres Signal (wahrscheinlich durch γδTCR-Ligandeninteraktion) zur Bindung an γδT-Zellen führt, während ein schwächeres Signal (wahrscheinlich durch ligandenunabhängigen Prä-TCR) zur αβT-Differenzierung führt. Experimente mit einem anderen transgenen Mausstamm, der γδTCR mit der gleichen Ligandenspezifität exprimiert, zeigten jedoch, dass γδT-Zellen auch in Abwesenheit der Liganden reifen können. Chien und Mitarbeiter verwendeten eine tetramerische Färbemethode zur Identifizierung der ligandenspezifischen γδT-Zellpopulation, um die Bedeutung der endogenen γδTCR-Liganden in nicht-transgenen Mäusen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die Anzahl der ligandenspezifischen γδT-Zellen zwischen den ligandenausreichenden und -defizienten Mäusen vergleichbar war, was darauf hindeutet, dass die Mehrheit der γδT-Zellen während der Thymusdifferenzierung nicht auf Liganden gestoßen ist. Die Autoren lieferten auch Hinweise darauf, dass einige γδTCRs ligandenunabhängig signalisieren können. Diese Beobachtungen widersprechen offensichtlich dem früheren Modell, dass die γδT-Linienbindung eine γδTCR-Ligandeninteraktion erfordert. In Anbetracht der Tatsache, dass polyklonale γδT-Zellen, die auf bestimmte exogene Liganden reagieren, sich im Thymus differenzieren und funktionell reifen, ist es wahrscheinlich, dass die Beobachtungen in bestimmten transgenen γδTCR-Mauslinien nicht die Mehrheit der γδT-Zellen mit polyklonalen γδTCRs widerspiegeln.

Um die Auswirkungen des γδ-Selektionssignals auf die αβT/γδT-Differenzierung zu untersuchen, haben wir Lat-defiziente Mäuse verwendet, bei denen die γδT-Zelldifferenzierung im CD5-Vorläuferstadium gestoppt ist. γδTCR+ Vorläuferzellen wurden aus erwachsenen Lat-defizienten Mäusen gereinigt, mit Lat exprimierenden Retroviren infiziert und auf Stromazellmonolayern kultiviert (Abb. 2a). Dieses Experiment ermöglicht eine direkte Bewertung des Zellphänotyps vor und nach der γδ-Selektion unter ligandenfreien Bedingungen. Im Vergleich zu nicht-transduzierten Kontrollzellen zeigten Lat-exprimierende γδT-Zellen eine deutliche Induktion der Oberflächenexpression von CD5 (Abb. 2b) sowie der mRNA-Expression von γδT-Zell-Signaturgenen (Tcrd, Egr3, Runx3 und Bcl-2) und eine vollständige Aufhebung der Transkription von Genen, die mit DN-Vorläuferzellen und αβT-Zellen assoziiert sind (Rag1, Rag2 und Ptcra) (Abb. 2c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das γδTCR-Signal sowohl die Differenzierung in Richtung der γδT-Linie antreibt als auch die Differenzierung in die αβT-Linie ligandenunabhängig unterdrückt.

Auch wenn die Mechanismen, durch die der Prä-TCR und der γδTCR die Differenzierungsprozesse in die αβT- bzw. γδT-Linien steuern, noch nicht klar sind (und diskutiert werden), ist es wahrscheinlich, dass die γδ-Selektion zumindest bei der Mehrzahl der natürlich erzeugten γδT-Zellen nicht von einem kognitiven γδTCR-Liganden im Thymus abhängig ist.

γδTCR-Signalstärke bestimmt γδT17/γδT1-Differenzierung

Während der Entwicklung sowohl der αβT- als auch der γδT-Linie wird die Expression von Syk und Zap70 invers reguliert: Syk wird in den frühen Stadien (DN1-3 und γδ-Vorläufer) hoch exprimiert und danach herunterreguliert, während Zap70 in den späteren Stadien (nach β- oder γδ-Selektion) exprimiert wird. γδT-Zellen, die die γδ-Selektion durchlaufen haben, exprimieren hohe Mengen an Zap70 sowie γδTCR/CD3-Komplexe und können auf endogene Liganden reagieren, wenn diese im Thymus bereitgestellt werden. Derzeit ist bekannt, dass γδT-Zellen im Gegensatz zu αβT-Zellen im Thymus keine ligandengesteuerte positive Selektion oder klonale Deletion erfahren. Mehrere Studien haben nahegelegt, dass die γδTCR-Ligandeninteraktion im Thymus stattdessen die Effektorfunktion der γδT-Zellen steuert.

Unter Verwendung der Tetramerfärbung einer γδT-Zellpopulation, die auf die nicht-klassischen MHC-Klasse-I-Moleküle T10 und T22 reagiert, fand die Gruppe um Chien heraus, dass antigen-naive γδT-Zellen, die sich in Abwesenheit der Liganden entwickelten, bevorzugt IL-17 produzierten, während antigen-erfahrene γδT-Zellen, die sich in Anwesenheit der Liganden entwickelten, überwiegend IFNγ produzierten. Diese Studie legte erstmals den Gedanken nahe, dass ein durch den Liganden induziertes starkes γδTCR-Signal und ein schwaches γδTCR-Signal γδT1- bzw. γδT17-Zellen induzieren. Eine kürzlich durchgeführte Studie mit neu erzeugten T10/T22-defizienten Mäusen ergab im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse, was dieses „Signalstärkemodell“ unterstützt. Dieses Modell wurde auch durch andere Studien gestützt. Die thymische Reifung und die Effektor-Differenzierung von Vγ5Vδ1 γδT-Zellen erfordern Skint1 (und wahrscheinlich andere Proteine der Skint-Familie), ein mutmaßliches kostimulatorisches Protein für den Vγ5Vδ1 TCR . In Abwesenheit von Skint1 werden Vγ5Vδ1 γδT-Zellen auf Kosten des γδΤ1-Zell-Phänotyps in einen γδΤ17-Zell-Phänotyp fehlgesteuert. Darüber hinaus erfordert die Entwicklung von γδT1-Zellen auch eine Kostenstimulation durch CD27, ein Protein der TNF-Rezeptor-Superfamilie, das in γδT1-Zellen, aber nicht in γδT17-Zellen exprimiert wird. Vor kurzem hat die Gruppe von Pennington bipotente γδT-Zellen (CD24lo CD44lo CD45RBlo) identifiziert, aus denen sowohl γδT17-Zellen als auch γδT1-Zellen entstehen können. In der fetalen Thymusorgan-Kultur wurde die Entwicklung von γδT17-Zellen durch starke TCR-Signale gehemmt, die durch Stimulation mit Anti-TCRδ- oder Anti-CD3ε-Antikörpern ausgelöst wurden, aber diese Effekte wurden durch pharmakologische Hemmung des MEK/ERK-Signalwegs aufgehoben. Diese Daten liefern direkte Beweise für die Idee, dass die Stärke des γδTCR-Signals eine kritische Determinante der γδT-Zelleffektor-Funktion ist.

Auf transkriptioneller Ebene induziert das starke γδTCR-Signal die Expression von γδT1-assoziierten Transkriptionsregulatoren wie Egr2, Egr3 und Id3, was zu einem γδT1-Zellschicksal führt. Id3 hemmt die Annahme des γδT17-Zellschicksals, indem es die durch HEB (kodiert durch Tcf12) vermittelte Transkriptionsregulation hemmt. HEB kann direkt stromaufwärts der Transkriptionsstartstellen von Sox4 und Sox13 binden und deren Expression fördern. Diese γδT17-assoziierten Transkriptionsfaktoren sind für die Expression des essenziellen Transkriptionsfaktors RORγt (kodiert von Rorc) und des Signalproteins Blk erforderlich. In Anbetracht dieser Tatsachen zeigt das TCR-Signalstärkemodell deutlich die Mechanismen auf, durch die das TCR-Signal die Effektorfunktion von γδT-Zellen steuert.

Eine Reihe von Studien hat jedoch die Auswirkungen der genetischen Ablation von TCR-Signalmolekülen auf die γδT-Zelleffektorfunktion aufgezeigt und damit die Vorstellung in Frage gestellt, dass die γδTCR-Signalstärke allein das γδT17/γδT1-Differenzierungsschicksal bestimmt. Zap70 W163C mutierte Mäuse weisen einen vollständigen Verlust der Entwicklung von Vγ6+ γδT17-Zellen auf, haben aber eine normale Entwicklung von γδT1-Zellen, während TCR-Signale in diesen Mäusen gedämpft sind. Eine weitere Studie von Silva-Santos und Mitarbeitern zeigte, dass Mäuse, die haploinsuffizient für CD3δ und CD3γ (CD3DH) sind, eine geringere Zellexpression der γδTCR/CD3-Komplexe und eine beeinträchtigte γδTCR-Signalgebung aufweisen, zeigten eine deutliche Reduktion der thymischen Entwicklung von Vγ6+ γδT17-Zellen sowie von γδT1-Zellen, aber nicht von Vγ4+ γδT17-Zellen, was darauf hindeutet, dass die γδT17-Untergruppen unterschiedliche γδTCR-Signalstärken für ihre Entwicklung benötigen. Obwohl die Entwicklung von αβT-Zellen und die αβTCR-Signaltransduktion in CD3DH-Mäusen nicht beeinträchtigt waren, ist dieser Mausstamm das einzige Tiermodell, in dem bisher eine spezifische Hemmung der γδTCR-Signalübertragung nachgewiesen wurde. Es bleibt unklar, warum γδT-Zellen in CD3DH-Mäusen spezifisch betroffen sind, aber es ist wahrscheinlich, dass die unterschiedliche Zusammensetzung der TCR-CD3-Komplexe αβT- und γδT-Zellen für den einzigartigen Phänotyp der CD3DH-Mäuse verantwortlich ist. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass Mäuse mit der CD3ε-C80G-Mutation, die nicht in der Lage ist, Konformationsänderungen im TCR zu induzieren, ebenfalls eine gestörte Entwicklung von γδT17-Zellen, aber eine normale Entwicklung von γδT1-Zellen aufweisen.

Syk ist für die γδT17-Differenzierung erforderlich

Kürzlich berichteten wir über einen neuen Regulationsmechanismus, durch den die γδTCR-proximalen Kinasen Syk und Zap70 die γδT17-Induktion unterschiedlich steuern. Syk-defiziente Mäuse weisen einen vollständigen Verlust von γδT17-Zellen (sowohl der Vγ4+ als auch der Vγ6+ Untergruppen) im Thymus auf. Bemerkenswert ist, dass die forcierte Expression von Zap70 in Syk-defizienten T-Vorläuferzellen die Bildung von γδT17-Zellen nicht wiederherstellen konnte, was auf eine nicht-redundante Rolle von Syk bei der γδT17-Differenzierung hindeutet. Da Syk-, aber nicht Zap70-defiziente γδT-Zellen eine signifikante Verringerung der durch γδTCR-Stimulation induzierten Akt-Phosphorylierung aufweisen, deutet dies darauf hin, dass Syk die γδTCR-induzierte Aktivierung des PI3K-Akt-Wegs vermittelt. PI3K-defiziente Mäuse (p110γ-/- p110δ-/-) zeigen eine vollständige Hemmung der Entwicklung von γδT17-Zellen, sind aber hinsichtlich der γδ-Selektion (CD5-Hochregulierung) oder der Entwicklung von γδT1-Zellen nicht beeinträchtigt. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung von PI3K die Expression von γδT17-assoziierten Transkriptionsfaktoren (Rorc, Sox13 und Sox4) reduziert, was darauf hindeutet, dass der PI3K-Akt-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Einleitung des γδT17-Differenzierungsprogramms spielt. In Übereinstimmung damit hat ein früherer Bericht gezeigt, dass kinaseinaktive PI3Kδ- oder PI3Kγ-defiziente Mäuse eine deutliche Verringerung der Anzahl peripherer γδT17-Zellen und eine Verbesserung der γδT17-abhängigen Entzündung aufweisen. Der PI3K-Akt-Signalweg ist auch für die Differenzierung von IL-17-produzierenden αβT (Th17)-Zellen erforderlich, was darauf hindeutet, dass dieser Signalweg ein gemeinsamer Regulationsmechanismus von αβT- und γδT-Linien ist, um IL-17-produzierende proinflammatorische Untergruppen zu induzieren.

γδTCR-induzierte Aktivierung des PI3K-Akt-Signalwegs hängt von Syk, aber nicht von Lat ab, was darauf hindeutet, dass Syk den PI3K-Akt-Signalweg für die Induktion der γδT17-Differenzierung zusätzlich zu dem Lat-abhängigen Hauptstrom-Signalweg antreibt, der die γδ-Selektion induziert. Es ist unklar, ob Syk den PI3K/Akt-Signalweg in γδT-Zellen durch direkte Interaktion oder auf indirekte Weise aktiviert. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass Rasgrp1-defiziente Mäuse einen γδT-Zelleffektor-Phänotyp aufweisen, der dem von PI3K-defizienten Mäusen ähnelt (d. h. ein Verlust von γδT17-Zellen und eine Zunahme von γδT1-Zellen). Da Rasgrp1 als Upstream-Aktivator des PI3K/Akt-Signalwegs bei der αβTCR-Signalgebung fungieren kann, ist es wahrscheinlich, dass Rasgrp1 Signale von γδTCR an PI3K weiterleitet, um die γδT17-Differenzierung zu induzieren.

Ein bevorzugter Verlust von γδT17-Zellen wurde auch bei Mäusen berichtet, denen Blk fehlt, eine Kinase der Src-Familie, die sowohl in γδT-Zellen als auch in B-Zellen exprimiert wird, obwohl ihre Funktion bei der γδTCR-Signaltransduktion unbekannt ist.

Zap70 kontrolliert bestimmte γδT-Zelluntergruppen

Wir haben auch die Rolle von Zap70 bei der thymischen Differenzierung von γδT-Zellen nachgewiesen. Zap70-defiziente Mäuse zeigen eine deutliche Verringerung der Vγ6+-Zellen, von denen die meisten γδT17 sind, sind aber in Bezug auf die Entwicklung anderer γδT-Zellen, einschließlich der Vγ1+- und Vγ4+-Untergruppen, unbeeinträchtigt. In der Tat war die Expression des Zap70-Proteins in der Vγ6+-Untergruppe unter den γδT-Zellen am höchsten. Da die CD5-Expression in den Zap70-defizienten Vγ6+-Zellen niedriger war als in den Kontrollzellen, ist Zap70 wahrscheinlich für die thymische Reifung der Vγ6+-Zellen erforderlich. In unseren Experimenten hatten Zap70-defiziente Mäuse eine normale thymische Differenzierung von Vγ4+-Zellen, einschließlich der γδT17-Untergruppe, was im Widerspruch zu einem früheren Bericht steht, in dem eine hypomorphe Zap70-Mutation eine Verringerung der thymischen Vγ4+-γδT17-Zellen verursachte. Diese Diskrepanz könnte auf die unterschiedlichen Mäuse zurückzuführen sein, die in den beiden Studien verwendet wurden (Haydays Gruppe verwendete hypomorphe Zap70-Mutantenmäuse auf einem BALB/c-Hintergrund, während wir vollständige Zap70-defiziente Mäuse auf einem C57BL/6-Hintergrund verwendeten). Darüber hinaus wiesen Zap70-defiziente Mäuse eine signifikante Verringerung der peripheren Vγ4+-Zellen auf, die sowohl die γδT17- als auch die γδT1-Untergruppe umfassten, hatten aber keine Beeinträchtigung der Vγ1+-Zellen. Im Gegensatz zur essentiellen Rolle von Zap70 bei der Entwicklung von αβT-Zellen beschränkt sich die Notwendigkeit von Zap70 also auf die thymische Reifung von Vγ6+-Zellen und die periphere Aufrechterhaltung von Vγ4+-Zellen.

Unsere Erkenntnisse über die unterschiedlichen Rollen von Zap70 und Syk könnten einen neuen Anhaltspunkt zum Verständnis der Mechanismen der γδTCR-Signalübertragung und der Entwicklung von γδT-Zellen liefern. Zap70 ist für die αβTCR-Signalgebung und die γδTCR-Signalgebung in bestimmten γδT-Zelluntergruppen erforderlich. In αβT-Zellen ist die Aktivierung von Zap70 abhängig von Lck, das mit CD4- oder CD8-Corezeptoren gekoppelt ist, die an pMHC auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen binden. Es wird daher vermutet, dass Lck-Zap70 eine Signalachse ist, die auf die Antigenerkennung durch Zell-Zell-Kontakt spezialisiert ist; im Fall von γδT-Zellen bleibt jedoch unklar, wie Zap70 trotz fehlender CD4- und CD8-Expression aktiviert wird. Im Gegensatz dazu ist Syk mit einer breiten Palette von Immunrezeptoren assoziiert, darunter pre-TCR, γδTCR, BCR und FcR . Da Syk in der Lage ist, ITAMs und nachgeschaltete Ziele unabhängig von Kinasen der Src-Familie, wie z. B. Lck, zu phosphorylieren, können diese Rezeptoren ligandenunabhängig oder nach Bindung an eine Vielzahl von löslichen sowie zelloberflächengebundenen Antigenen aktiviert werden. Somit kann die Verwendung von Syk oder Zap70 in der Immunrezeptor-Signalgebung bestimmen, wie der Rezeptor das Antigen erkennt. Tatsächlich führte die Expression von Syk anstelle von Zap70 dazu, dass αβT-Zellen auf die Stimulation mit löslichen Anti-CD3-Antikörpern reagieren konnten, während normale αβT-Zellen nur auf multimerisierte Anti-CD3-Antikörper reagierten, die die Interaktion mit dem pMHC auf der Zelloberfläche nachahmen. Diese Ergebnisse veranlassten uns zu der Hypothese, dass die Art der Antigenerkennung durch Lymphozyten nicht nur durch ihren Rezeptor an sich, sondern auch durch die unterschiedliche Verwendung von Kinasen der Syk-Familie bestimmt werden könnte. Auf der Grundlage dieses Konzepts sagen wir voraus, dass es endogene Zelloberflächen-γδTCR-Liganden gibt, die für die thymische Reifung von Vγ6+-Zellen sowie für die periphere Aufrechterhaltung von Vγ4+-Zellen erforderlich sind, und dass Vγ1+-Zellen keine Zelloberflächen-γδTCR-Liganden für ihre Entwicklung und/oder Aufrechterhaltung benötigen.

γδTCR-unabhängige und -abhängige Prozesse für die Induktion von γδT17

In einem kürzlich erschienenen Bericht wurde auf elegante Weise gezeigt, dass γδT17-Zellen aus einem Vorläufer entstehen, der sich von den anderen γδT-Zelluntergruppen unterscheidet. Es wurde berichtet, dass intrathymische Vorläuferzellen fötalen Ursprungs, die hohe Mengen an Sox13 exprimieren, in einer Population identifiziert wurden, die zuvor als DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi) Thymozyten kategorisiert wurde. Aus diesen Sox13+ Vorläuferzellen entstanden im rekonstituierten fötalen Thymus bevorzugt γδT17-Zellen, während dies bei anderen Vorläuferzellen innerhalb der DN2-Population nicht der Fall war. Besonders wichtig ist, dass die Sox13+ Vorläuferzellen nachweisbar waren und ihre γδT17-Linienprogramme in TCRδ-defizienten oder Rag-defizienten Mäusen intakt waren, was darauf hindeutet, dass das Schicksal der γδT17-Linien durch einen zelleigenen, γδTCR-unabhängigen Mechanismus „vorverdrahtet“ ist. In einem früheren Bericht wurde jedoch gezeigt, dass sich γδT17-Zellen aus dem DN2-Stadium (CD44+CD25+c-kithi) entwickeln können, wenn sie auf einer Monoschicht von Notch-Ligand-exprimierenden Stromazellen kultiviert werden. Es könnte daher notwendig sein, die Differenzierungsstadien und die Progenitor-Deszendenten-Beziehungen in der γδT-Zellentwicklung neu zu definieren.

Abbildung 3 fasst die Differenzierungsprozesse von γδT-Zellen und αβT-Zellen zusammen und hebt die Unterschiede in der Notwendigkeit von αβ/γδTCR-Signalen und Kinasen der Syk-Familie hervor. Die frühen Schritte der Differenzierung, d.h. die β-Selektion für die αβT-Zelllinie und die γδ-Selektion für die γδT-Zelllinie, werden durch ligandenunabhängige pre-TCR- oder γδTCR-Signale angetrieben, die als Kontrollpunkt für die Zellen dienen, die eine funktionelle TCRβ-Kette bzw. γδTCR-Kette exprimieren. Diese ligandenunabhängigen Rezeptorsignale werden durch Syk initiiert, das in DN-Thymozyten, einschließlich γδT-Vorläufern, exprimiert wird. In der γδT-Zelllinie ist das Syk-vermittelte γδTCR-Signal auch für das Priming der γδT17-Zelldifferenzierung über die Aktivierung des PI3K-Wegs erforderlich. Sowohl während der β-Selektion als auch während der γδ-Selektion wird die Expression von Syk und Zap70 umgekehrt reguliert: Syk wird herunterreguliert, während Zap70 bei prä-TCR- oder γδTCR-Signalisierung hochreguliert wird. Daher hängt der spätere Schritt der Differenzierung der αβT-Linie von der Zap70-vermittelten αβTCR-Signalisierung ab, die es den DP-Thymozyten ermöglicht, pMHC auf der Oberfläche von TECs zu erkennen, um je nach Stärke der αβTCR-pMHC-Interaktion positiv oder negativ selektiert zu werden. Im Gegensatz dazu bestimmt die Zap70-vermittelte γδTCR-Signalisierung als Reaktion auf endogene Liganden die Effektorfunktion der γδT-Zellen: ein starkes Signal induziert γδT1, während ein schwaches/kein Signal γδT17 induziert.