Växtmaterial

Bladen av Strychnos spinosa Lam. samlades in i januari 2013 från byn Sakara, Zaria, Nigeria. Växtmaterialet identifierades av Musa Muhammad, en botaniker från herbarieavdelningen vid institutionen för biologiska vetenskaper (Ahmadu Bello University, Zaria) där ett voucher-exemplar (nr 900161) var deponerat. De insamlade bladen torkades i ett ventilerat rum fritt från föroreningar och maldes sedan till ett pulver med hjälp av en Macsalab-kvarn (modell 2000 LAB Eriez), förvarades i en glasbehållare och förvarades i mörker i rumstemperatur (25 ± 3 °C) före användning.

Extraktion och vätske-vätskefraktionering

Aceton-, metanol- och diklormetan/metanol-extraktioner

En variant av Suffness & Douros metod användes för att fraktionera komponenterna som finns i olika bladextrakt. Det torkade bladpulvret (2 kg) macererades tre gånger i aceton (6 l) för att ge acetonextraktet (AcetE, 75 g) efter filtrering och avlägsnande av lösningsmedlet i vakuum. Resterna macererades ytterligare i metanol (6 l) enligt samma förfarande som beskrivits för acetonextraktion ovan för att få fram metanolextraktet (MetE, 119,2 g). En del av de torkade pulveriserade bladen (1 kg) extraherades också i en blandning (1/1, v/v) av diklormetan/metanol (3 l) tre gånger för att ge diklormetan/metanolextrakt (DcmMetE, 114 g) efter filtrering och avlägsnande av lösningsmedlet i vakuum. En del av acetonextraktet (70 g) löstes och fraktionerades i en blandning (1/1, v/v) av kloroform och vatten för att ge vatten- och kloroformfraktionerna. n-butanol tillsattes till vattenfraktionen för att ge fraktionerna n-butanol (nButF, 25,1 g) och vatten (Wat1, 5 g). Kloroformfraktionen koncentrerades till torrhet och löstes i 10 % vatten i metanol före extraktion med hexan. Hexanfraktionen (HexF, 23,9 g) och restprodukten av 10 % vatten i metanol erhölls därför efter tillsats av n-hexan. Andelen vatten i metanol ökades för att ge 35 % vatten i metanol som slutligen gav kloroform (ChlF, 7,05 g) och 35 % vatten (wat2, 2,8 g) efter tillsats av kloroform. Från den jämförande TLC:n kombinerades fraktionerna vatten (Wat1) och 35 % vatten i metanol (Wat2) till en fraktion (WatF, 7,8 g).

Alkaloidextraktion

Bladen av S. spinosa (1 kg) macererades med blandningen (96:3:1, v/v) av EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) och perkolerades sedan med EtOAc för att ge extraktet (26 g) efter avlägsnande av lösningsmedlet med hjälp av rotationsförångare under reducerat tryck. Extraktet löstes i EtOAc och extraherades med 4 % ättiksyra för att ge EtOAc-fraktion (EtAcF, 20,02 g). Den sura lösningen (pH 3-4) basifierades till pH (8-9) med Na2CO3 och extraherades tre gånger med DCM för att ge råalkaloidextrakt (AlkE, 2,8 g) efter avlägsnande av lösningsmedlet i vakuum.

Antimikrobiell analys

Mikroorganismer och beredning av inokulum

Mikroorganismer som användes var tre grampositiva bakterier, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) och Enterococcus faecalis (ATCC 29212), en gramnegativ bakterie, Escherichia coli (ATCC 25922); och fyra svampar, däribland tre jästsvampar, Candida albicans, Cryptococcus neoformans (djurisolat) och Candida albicans (ATCC 10231) samt en filamentös svamp, Aspergillus fumigatus. Vissa av de svampstammar som användes odlades från kliniska fall av svampinfektionssjukdomar hos djur, före behandling, vid avdelningen för veterinärmedicinska tropiska sjukdomar, fakulteten för veterinärmedicinska vetenskaper. C. albicans isolerades från en gouldian finch, C. neoformans från en gepard, medan A. fumigatus isolerades från en kyckling som led av en systemisk mykos.

Bakterie- och svampkulturer togs från 24 timmars färska agarodlingsplattor och inokulerades i färsk Sabouraud dextrose-buljong (SDB) för svampar och Mueller-Hinton-buljong (MHB) (Fluka, Schweiz) för bakterier, innan analysen utfördes. Den mikrobiella suspensionens turbiditet justerades till en McFarland-standard 0,5, vilket motsvarar koncentrationer på 1-5 × 108 och 1-5 × 107 cfu/ml för bakterier respektive svampar. De mikrobiella suspensionerna späddes ytterligare (1:100) i media för att få ett slutinokulum på cirka 1,5 × 106 cfu/ml för bakterier och 1,5 × 105 cfu/ml för svampar.

Bestämning av minsta hämmande koncentration

En tvåfaldig seriell mikrodilutionsmetod med tetrazoliumviolett som indikator för mikrobiell tillväxt användes för att bestämma den minsta hämmande koncentrationen (MIC) för extrakt och fraktioner mot bakterier och svampar enligt modifiering av Masoko et al. .

A 100 μl (10 mg/ml) av extrakt och fraktioner lösta i dimetylsulfoxid (DMSO) späddes seriellt två gånger med sterilt destillerat vatten i 96-håls-mikrotiterplattor och 100 μl nypreparerad mikrobiekultur i MHB eller SDB tillsattes i varje hål. DMSO (5 %) användes som negativ kontroll medan gentamicin (1 mg/ml) och amfotericin B var positiva kontroller. Mikrotiterplattorna förseglades i plastpåsar och inkuberades i 24 timmar vid 37 °C. Därefter tillsattes 40 μl 0,2 mg/ml p-iodonitrotetrazoliumviolett (INT) till varje brunn och mikrotiterplattorna inkuberades ytterligare vid 37 °C. Minimala hämmande koncentrationer bestämdes efter 1 och 2 timmar för bakterier och efter 16 och 36 timmar för svampar. MIC bestämdes som den lägsta koncentrationen som hämmar mikrobiell tillväxt, vilket indikeras av en minskning av intensiteten av formazans röda färg.

Antioxidantanalyser

Antioxidantverksamheten hos extrakt och fraktioner från bladen av S. spinosa bestämdes genom att man använde 2,2′-difenyl-1-pikryhydrazyl (DPPH) och 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) diammoniumsalt (ABTS).

DDPPH-analys

Antioxidationsaktiviteten utfördes enligt beskrivningen av Du Toit et al. med små modifieringar. Proverna löstes upp i metanol av HPLC-kvalitet (Sigma-Aldrich, Tyskland) och späddes två gånger seriellt till koncentrationsområden på 1000 till 7,81 μg/ml för extrakt och fraktioner, och 40 till 0,31 μg/ml för en standardreferens L-askorbinsyra (Sigma, Tyskland). Kortfattat: 40 μl (10 mg/ml) av proverna fördes in i 96-håls mikrotiterplattor (Bioster, Spanien) och späddes två gånger seriellt i metanol. Därefter infördes 160 μl (3,7 mg/100 ml) metanolisk lösning av 2,2-difenyl-1-pikryhydrazyl (DPPH) i varje brunn och efter 30 minuters inkubation i rumstemperatur i mörker mättes absorbansen vid 517 nm med hjälp av en multimode-mikroplattläsare (BioTek, USA). Den fria radikalavskiljande aktiviteten för varje prov och referensstandard bestämdes som procentuell hämning enligt följande formel:

Med Absample som absorbansen för extraktet med DPPH, Abblank som absorbansen för extraktet utan DPPH och Abcontrol som absorbansen för metanol och DPPH. Koncentrationen av prover som reducerar 50 % av den fria radikalen DPPH (IC50) bestämdes genom att plotta den procentuella hämmningen mot provkoncentrationerna. Testet upprepades tre gånger och resultaten uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse.

ABTS-analys

Den ABTS-radikalavskiljande kapaciteten hos extrakt och fraktioner bestämdes med hjälp av en metod av Re et al. med små modifieringar. I korthet genererades ABTS-radikalen genom att 7 mM lösning av ABTS och 2,45 mM lösning av kaliumpersulfat reagerade i rumstemperatur i 12 timmar. Absorptionen av ABTS-radikalens stamlösning justerades till 7,00 ± 0,02 vid 734 nm innan den användes. 40 μl av en lösning av extrakt eller fraktioner upplöst i metanol av HPLC-kvalitet (Sigma-Aldrich, Tyskland) fördes in i mikrotiterplattor och späddes seriellt till koncentrationer mellan 15,62 och 2 000 μg/ml. Trolox (Sigma, Tyskland) och L-askorbinsyra (Sigma, Tyskland) framställdes i koncentrationer från 200 till 1,56 μg/ml. Därefter tillsattes 160 μl ABTS-lösning till brunnarna (med undantag för tomrummet) och absorbansen mättes vid 734 nm efter 6 minuters inkubation i rumstemperatur. Trolox och askorbinsyra användes som positiva kontroller, metanol som negativ kontroll och extrakt eller fraktioner utan ABTS som blank. Procentuell hämning av ABTS-+ och IC50 beräknades som rapporterats ovan för DPPH-analys.

Cytotoxicitetsanalys

Acetonextraktens och fraktionernas cytotoxicitet mot Vero aknjurceller bedömdes med MTT-reduktionsanalysen enligt tidigare beskrivning med smärre modifieringar. Cellerna såddes med en densitet på 1 × 105 celler/ml (100 μl) i 96-well-mikrotiterplattor och inkuberades vid 37 °C och 5 % CO2 i en fuktig miljö. Efter 24 timmars inkubation tillsattes prover (100 μl) i olika slutkoncentrationer till brunnarna med celler. Doxorubicin användes som en positiv referens. En lämplig blank kontroll med motsvarande koncentrationer av aceton inkluderades också och plattorna inkuberades ytterligare i 48 timmar i en CO2-inkubator. Därefter sögs mediet i varje brunn från cellerna, som sedan tvättades med PBS, och slutligen tillsattes nytt medium (200 μl) till varje brunn. Därefter tillsattes 30 μl MTT (5 mg/ml i PBS) i varje brunn och plattorna inkuberades vid 37 °C i 4 timmar. Mediet sögs ut från brunnarna och DMSO tillsattes för att lösa upp de bildade formazankristallerna. Absorptionen mättes på en BioTek Synergy-mikroplattläsare vid 570 nm. Hämning av celltillväxten för varje extrakt uttrycktes i form av LC50-värden, definierade som den koncentration som orsakade 50 % hämning av cellens livsduglighet. Värdena för selektivitetsindex (SI) beräknades genom att dividera LC50-värdena för cytotoxicitet med MIC-värdena (SI = LC50/MIC). Testerna utfördes i fyra exemplar och varje experiment upprepades tre gånger.

Statistisk analys

Alla experiment utfördes i tre exemplar och värdena uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse. Skillnader mellan värden bedömdes för signifikans med hjälp av variansanalys och resultaten jämfördes med hjälp av Fishers minsta signifikanta skillnad (LSD) på 5 % signifikansnivå.