Material och metoder

Provsamling

Deltagare som var 18 år eller äldre inbjöds att delta i studien via e-postmeddelanden och annonser som placerades på anslagstavlor vid University of British Columbia, Vancouver BC. Deltagarna ombads att lämna prover med hjälp av torrflockade munslev (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) och svampade munslev (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) med hjälp av självstyrande instruktioner; ordningen i vilken proverna lämnades var slumpmässigt fördelad med hjälp av en dator. En forskningsassistent var närvarande under provtagningen för att svara på frågor som deltagarna hade om instruktionerna för provtagning. Alla prover förvarades i rumstemperatur. Farmakogenetiska rapporter gavs inte till deltagarna, eftersom detta inte låg inom ramen för denna studie.

DNA-extraktion

DNA extraherades med hjälp av det pärlbaserade DNA-extraktionskitet Ambion MagMAX (Applied Biosystems, Foster City, CA) i enlighet med tillverkarens instruktioner. DNA extraherades 3 dagar efter provtagning och eluerades i 60 µl. DNA-kvantiteten och -kvaliteten bedömdes med hjälp av Qubit 2.0 fluorescensanalys (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Provernas renhet bestämdes genom värdena för optisk densitet A260/280 (ODA260/280) med hjälp av NanoVue-spektrofotometern.

Genotypning

Genotypning utfördes på QuantStudio 12K Flex-instrumentet för kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) med hjälp av analysmetoder som validerats av tillverkaren (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Innehållet i analyserna omfattade 28 SNP:er som påverkar läkemedelsresponsen på OpenArray-plattformen (se tilläggsfil 2) och en CYP2D6 CNV TaqMan-analys (Assay ID: Hs_0001000101_cn). För att validera testerna genotypades 44 DNA-kontroller från National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Human Genetic Cell Repository vid Coriell Institute for Medical Research. Överensstämmelse med den förväntade genotypen bekräftades. Dessutom verifierades resultaten genom Sanger-sekvensering av kontroll-DNA:t. För varje körning kördes deltagarproverna dubbelt på OpenArray och fyrdubbelt på CNV-analysen tillsammans med Corriell DNA-prover som användes som positiva kontroller och kontroller utan mall (NTC).

Statistisk analys

Programvaran TaqMan Genotyper v1.3.1 (Applied Biosystems) användes för att bestämma SNP-genotyperingsfrekvensen på OpenArray. Genotypavropningsfrekvensen beräknades för varje OpenArray-analys genom att dividera det totala antalet framgångsrikt tilldelade genotyper med det totala antalet försök till genotypavropning.

För CNV-analysen med TaqMan användes programvaran CopyCaller v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) för att tilldela CYP2D6-kopieringsnummeravropningar och CNV-konfidenspoäng. DNA-prover tilldelades ett diploid kopianummer av vildtyp och variationer i kopianummer (deletion eller duplikationshändelser) grupperades i 2N- respektive CNV-grupperna. En genotypningsfrekvens på 95 % och en konfidenspoäng på 95 % fastställdes för SNP- respektive CNV-genotypningsresultat. Ett Student’s t-test med två stickprov som utgick från ojämna varianser beräknades för att fastställa den signifikanta skillnaden mellan DNA-avkastning, renhet och antal genuppsättningar från de olika DNA-typerna i par. Genotypningsuppgifterna som genererades från DNA-provtypen (svampade vs. torrflockade) från samma deltagare jämfördes för att beräkna överensstämmelse.

Resultat

Trettioen deltagare rekryterades och samlade in svampade svabbprover och torrflockade svabbprover. Deltagarna tyckte att de självledda instruktionerna för insamling var raka och lätta att följa för båda typerna av svabbar. Deltagarna ställde frågor om det nödvändiga trycket för att gnugga svabbarna och den korrekta placeringen av svabbarna i munnen. Deltagarnas kommentarer om de två svabbarna var likartade och vissa föredrog svampade svabbar och andra föredrog torra svabbar; det fanns ingen samstämmig åsikt.

Det fanns en signifikant skillnad i genomsnittlig DNA-avkastning mellan DNA som samlades in med hjälp av torra svabbar jämfört med svampade svabbar (0,26 ± 0,34 µg jämfört med 1,91 ± 1,44 µg, p = 4,4 × 10-7; tabell 1). Den genomsnittliga DNA-renheten för alla insamlingstyper låg inom det accepterade intervallet för rent DNA (medelvärde (SD)) 1,72(0,78) och 1,85(0,39) för torra svabbar respektive svampade svabbar.

Det fanns tre prover som samlades in från svamptippade svabbar som hade låga DNA-koncentrationer (< 5 ng/µl). Dessa tre prover hade 100 % genotyperingsfrekvens på OpenArray och 100 % CNV-konfidenspoäng (fig. 1). Omvänt hade ett av proverna som hade en DNA-koncentration på 79 ng/µl den lägsta OpenArray-kallfrekvensen (18 %). De högsta resultaten på OpenArray (> 95 %) för torrflockade svabbprover observerades för sju prover med en koncentration som varierade mellan 1,2 och 8,9 ng/µl (fig. 1a). De högsta CNV-konfidenserna (> 95 %) observerades för prover med koncentrationer mellan 1,0 och 24,4 ng/µl (fig. 1b).

För alla assays på OpenArray, DNA-prover som samlats in från svampade svabbar resulterade i generellt sett högre genotypningsfrekvenser (97 %) jämfört med torrflockade svabbar (54 %) (Fig. 2). Med ett ytterligare steg med en 0,5 × utspädning av extraherat DNA hade svampade svabbar en konsekvent genotypningsfrekvens på > 95 %. Provuppsökningsfrekvensen på OpenArray varierade från individ till individ. 29 (93,5 %) deltagare hade provuppsökningsfrekvenser > 95 % från DNA från svampade svabbar och 4 (12,9 %) hade provuppsökningsfrekvenser > 95 % från DNA från torrflockade svabbar. En 94-procentig överensstämmelse av framgångsrikt genotypade analyser observerades mellan svampade svabbprover och torrflockade svabbprover som samlats in från samma individ.

Kopieringsnummerkallar för CYP2D6 tilldelades 2(6,5 %) av proverna från svampade svabbprover med ett övergripande konfidensvärde på 0,99. I jämförelse tilldelades 8(25,8 %) av proverna från torrflockade svabbar kopianalyser med en total konfidenspoäng på 0,91 (se tilläggsfil 3).

Diskussion

Syftet med denna forskning är att hjälpa utredare och företag att identifiera en optimal insamlingsmetod som ger högkvalitativt DNA för genotypning. Denna studie ger ny information om DNA-kvaliteten för två typer av svabbar, som var hög (definierad som ODA260/A280 1,8) även om det fanns en signifikant skillnad i DNA-avkastning (p-värde = 4,4-7). På OpenArray-plattformen hade svampade svabbprover den högsta totala genotypningsfrekvensen (97 % jämfört med 54 %) och den högsta konfidenspoängen för CYP2D6 CNV TaqMan Assay (0,99 jämfört med 0,91). En > 95-procentig SNP-genotypningsfrekvens anses återspegla data av godtagbar kvalitet och CNV-konfidenspoäng på 99 % anses vara av hög kvalitet.

Ett DNA-prov isolerat från svampade svabbar hade en frekvensen som var lägre än 95 %. I rutinmässig laboratoriepraxis skulle prover med låg uttagningsfrekvens samlas in igen på grund av ofullständiga resultat för patientrapporter. Genom att utelämna detta prov ökade den totala genotypningsfrekvensen till 99,5 % för svampade svabbar.

CYP2D6 CNV-resultaten visade en ökning av CNV-tilldelningar för DNA som samlats in från torrflockade svabbar 8(25,8 %) jämfört med svampade svabbar 2(6,5 %). Högre antal CNV-tilldelningar korrelerade med lägre konfidenspoäng. Majoriteten av deltagarna, 30(97 %), kunde samla in prover som resulterade i höga genotypningsfrekvenser för svampade svabbar, medan endast ett fåtal personer, 4(13 %), kunde samla in prover med höga frekvenser för båda typerna av svabbar. Sammanfattningsvis kan man konstatera att svampade svabbar var acceptabla för patienterna och gav DNA av god kvalitet med tillräcklig avkastning för qPCR-baserad farmakogenetisk testning.