Abstract

Träd av Copaifera-släktet är inhemska i de tropiska regionerna i Latinamerika och västra Afrika. Copaifera sp används i stor utsträckning som folkmedicin och har olika etnofarmakologiska indikationer, bland annat gonorré, bronkit, astma, hudsår, sår, halsont, livmoderinfektioner, allmänna inflammationer, cancer och leishmanioser. Kaurenonsyra är en naturligt förekommande diterpen som finns i Copaifera och har använts som antiinflammatoriskt medel, behandling av magsår, leishmaniasis och cancer. Med tanke på att Ames-testet är ett utmärkt verktyg för att bedöma säkerheten hos extrakt, oljor och fytokemikalier som isolerats från medicinalväxter, utvärderar vi utifrån det den mutagena potentialen hos fyra arter, mellan oleoresiner (C. oblongifolia; C. langsdorffii) och blattextrakt (C. lucens; C. multijuga), av Copaifera-släktet och även av kaurenonsyra, som är en av dess viktigaste föreningar. Resultaten visade att Copaifera spp. och kaurenonsyra inte gav upphov till någon ökning av antalet revertantkolonier, utan mutagen effekt i experiment, i alla koncentrationer som utvärderades med Ames-testet. De resultat som erhållits i vår studie stöder en säker användning av de utvalda medicinalväxterna av Copaifera-släktet och av kaurensyra.

1. Introduktion

Under historien har olika kulturer använt växter för medicinska ändamål. Växter har faktiskt visat sig vara en källa till läkemedel för behandling av ett brett spektrum av sjukdomar. I dag fortsätter växtbaserade system att spela en viktig roll för hälsan och intresset för fytomedicinska produkter har ökat över hela världen, så mycket att växter fortfarande undersöks som en källa till nya medicinska medel .

Träd som tillhör släktet Copaifera har sitt ursprung i de tropiska regionerna i Latinamerika och västra Afrika. Släktet Copaifera tillhör familjen Leguminosae och omfattar 72 arter. Över 20 Copaifera spp. finns i Brasilien, där de kallas ”copaibeiras”, ”pau d’óleo” eller ”copaíbas”. Copaifera spp. används i stor utsträckning inom folkmedicinen. De har olika etnofarmakologiska indikationer, t.ex. behandling av gonorré, bronkit, astma, hudsår, sår, halsont, livmoderinfektioner, allmänna inflammationer, cancer och leishmanier .

Den vetenskapliga litteraturen innehåller många rapporter om de farmakologiska aktiviteterna hos Copaifera-arter, såsom deras antiinflammatoriska , antitumör, antiproliferativa , anthelmintiska , antituberkulära , gastroprotektiva , kemopreventiva , immunmodulerande och antibakteriella verkan, bland annat.

Kaurensyra är en diterpen som förekommer naturligt i vissa brasilianska växter, bland annat Copaifera oleoresiner. Otaliga farmakologiska egenskaper har rapporterats för kaurenonsyra, t.ex. dess antiinflammatoriska effekt, dess användning för att behandla magsår och dess antiparasitära, analgetiska och anticancerpotential .

Då naturliga föreningar har använts traditionellt antas de ofta vara säkra. Många studier har dock rapporterat att flera växtarter som används i traditionell medicin uppvisar mutagena, cancerframkallande eller toxiska effekter . Trots detta fortsätter ett antal växter och fytoterapeutiska produkter att användas utan vetenskapliga bevis för deras säkerhet.

Ames-testet är globalt känt för sin förmåga att upptäcka punktmutationer orsakade av olika agens. I testet används indikativa Salmonella Typhimurium-stammar som är känsliga för ämnen som framkallar olika typer av mutationer. På grundval av Ames-testet är det möjligt att fastställa den mutagena effekten av en förening som en funktion av S. Typhimurium-koncentrationen . Detta test används för inledande screening av nya läkemedels mutagena potential över hela världen. En mutagen reaktion har ett högt prediktivt värde för karcinogenicitet . Under årens lopp har det vetenskapliga samfundet och statliga myndigheter och företag erkänt värdet av detta test.

Med tanke på att Ames-testet är ett utmärkt verktyg för att bedöma säkerheten hos extrakt, oljor och fytokemikalier som isolerats från medicinalväxter använde vi detta test för att utvärdera den mutagena potentialen hos oleoresinerna eller blattextrakten från fyra Copaifera-arter och hos kaurenonsyra.

2. Material och metoder

2.1. Växtmaterial

Plantmaterialet samlades in i olika brasilianska delstater mellan augusti 2012 och maj 2014. Växtkupongerna identifierades antingen av dr Regina Celia Vianna Martins da Silva vid det botaniska laboratoriet vid Brasilianska jordbruksforskningsbolaget (Embrapa), Belém, delstaten Pará, Brasilien, eller av dr Milton Groppo Junior vid biologiavdelningen vid São Paulos universitet, Ribeirão Preto Campus, delstaten São Paulo, Brasilien, där kupongerna deponerades. I tabell 1 finns en förteckning över information om de exemplar som finns i dokumentationen.

För att dra ut C. oblongifolia- och C. langsdorffii-oleoresinerna användes en skruvmejsel för att borra ett hål med en diameter på cirka en tum. Hålet borrades i mitten av trädstammen, en meter över marken. Oleoresinet dränerades till en bärnstensflaska med hjälp av ett rör som var kopplat till ett filter. När oleoresinet hade samlats upp förseglades hålet ordentligt.

C. lucens och C. multijuga-bladen lufttorkades vid 40 °C i 48 timmar eller lödofiliserades och pulvriserades i en mixer. Det erhållna pulvret utsattes för maceration i etanol/vatten 7:3 vid rumstemperatur i 48 timmar. Efter filtrering avdunstades lösningsmedlet under 40 °C under vakuum. Detta förfarande upprepades fyra gånger och extrakten kombinerades, koncentrerades under vakuum och lödofiliserades, vilket gav i genomsnitt 20 viktprocent råa hydroalkoholiska extrakt av blad.

Kaurenonsyra (figur 1), med en renhet på över 99 %, isolerades i enlighet med Simão et al. Copaifera-arternas oleoresiner och blad samlades in och forskningen utvecklades efter godkännande av den brasilianska regeringen genom SISBIO (system för information och godkännande av biologisk mångfald #35143-1) och CGEN (rådet för förvaltning av genetiskt arv #010225/2014-5).

Figur 1

Kemisk struktur för kaurensyra.

2.2. Ames-test

Ames-testet användes för att undersöka Copaifera spp. mutagenicitet. Förinkubationsmetoden som utvecklats av Maron och Ames , med och utan exogen aktivering (S9), användes för att analysera olika Salmonella Typhimurium-stammar (TA98, TA100, TA97a och TA102) i ett försök att identifiera agens som orsakar genmutationer. Teststammarna, som vänligen tillhandahölls av Dr. B.N. Ames (Berkeley, CA, USA), odlades från frysta kulturer i 12-14 timmar, över natten, i Oxoid Nutrient Broth Number 2.

För testet av mutagen aktivitet tillsattes olika koncentrationer av varje oleoresin, varje extrakt eller kaurenonsyra löst i DMSO till 0,1 mL bakteriekultur i 0,5 mL fosfatbuffert 0,2 M eller 0,5 mL 4 % S9-blandning och inkuberades vid 37 °C i 20-30 minuter. Koncentrationerna varierade från 62,5 till 500 μg/platta för C. lucens (extrakt), från 120 till 1000 μg/platta för C. multijuga (extrakt), från 125 till 1000 μg/platta för C. oblongifolia (oleoresin), från 500 till 4000 μg/platta för C. langsdorffii (oleoresin) och från 25 till 200 μg/platta för kaurenonsyra. Dessa koncentrationer valdes på grundval av ett preliminärt toxicitetstest. I alla efterföljande tester var den övre gränsen för det testade dosintervallet antingen den högsta icke-toxiska dosen eller den lägsta toxiska dosen som fastställts i det preliminära testet. Toxicitet upptäcktes antingen som en minskning av antalet histidinrevertanter (His+) eller som en gallring av den auxotrofa bakgrundsgräsmattan.

Den metaboliska aktiveringsblandningen (S9-fraktionen) som framställts från levern från Sprague Dawley-råttor som behandlats med den polyklorerade bifenylblandningen Aroclor 1254 (500 mg/kg) köptes från Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, USA) och nybereddes före varje test. Det metaboliska aktiveringssystemet bestod av 4 % S9-fraktion, 1 % magnesiumklorid 0,4 M, 1 % kaliumklorid 1,65 M, 0,5 % D-glukos-6-fosfat-dinatrium 1 M och 4 % nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfatnatriumsalt (NADP) 0,5 %.1 M i 50 % fosfatbuffert 0,2 M och 39,5 % sterilt destillerat vatten.

Efter inkubation tillsattes 2 ml toppagar och blandningen hälldes på en platta med minimalagar. Plattorna inkuberades vid 37 °C i 48 timmar och kolonierna med His+ revertanter räknades manuellt.

Resultaten analyserades med det statistiska programvarupaketet Salanal 1.0 (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, från Research Triangle Institute, RTP, NC, USA); modellen från Bernstein et al. användes. Data (revertanter/platta) bedömdes genom variansanalys (ANOVA), följt av linjär regression. Det mutagena indexet (MI) beräknades också för varje testad koncentration och motsvarade det genomsnittliga antalet revertanter per testplatta dividerat med det genomsnittliga antalet revertanter per kontrollplatta med lösningsmedel. Ett prov ansågs mutagent när ett dos-responsförhållande upptäcktes och MI var högre än två (MI > 2) vid en eller flera koncentrationer .

Följande standardmutagena ämnen användes som positiva kontroller i experiment utan S9-blandning: 4-nitro-O-fenylendiamin (10 μg/platta) för TA98 och TA97a, natriumazid (1,25 μg/platta) för TA100 och mitomycin C (0,5 μg/platta) för TA102. I experiment med S9-aktivering användes 2-antramin (1,25 μg/platta) som positiv kontroll för TA98, TA97a och TA100, och 2-aminofluoren (10 μg/platta) användes som positiv kontroll för TA102. DMSO fungerade som lösningsmedelskontroll (100 μL/platta) och den negativa kontrollen motsvarar graden av spontan reversion för varje stam.

3. Resultat

Tabell 2 visar medelantalet revertanter/platta (M), standardavvikelsen (SD) och det mutagena indexet (MI) som observerats för S. Typhimurium-stammarna TA98, TA100, TA102 och TA97a i närvaro (+S9) eller i avsaknad (-S9) av metabolisk aktivering efter provbehandling med oleoresin, extrakt eller förening.

Varken C. lucens- och C. multijuga-blattextrakten eller C. langsdorffii- och C. oblongifolia-oleoresinerna orsakade genetiska mutationer, vilket framgick av Ames-testet. Kaurenonsyra ökade inte heller antalet revertanta kolonier, så den utövade inte mutagena effekter i någon av de undersökta koncentrationerna eller på någon av de utvärderade stammarna. Lösningsmedelskontrollen (DMSO) skilde sig inte signifikant av antalet revertanter från den negativa kontrollen.

4. Diskussion

De mutagena effekter som utövas av växter är inte lätta att märka hos människor, och negativa långtidseffekter som cancer kan manifesteras. Därmed har den vetenskapliga litteraturen betonat vikten av att screena medicinalväxter för deras mutagena potens . I denna mening har vi här undersökt Copaifera spp. och kaurenonsyrans mutagena potential med hjälp av Ames-testet. Akyıl och Konuk betonade att detektion av genotoxiska ämnen ofta bygger på användningen av bakterier som testorganismer. På så sätt är Ames-testet (eller Salmonella/mikrosomtestet) den metod som oftast används för att upptäcka genotoxiska ämnens mutagena effekter .

Ames-testets prestanda med hjälp av olika stammar är av stor betydelse med tanke på var och en av deras särdrag i förhållande till testet. På detta sätt är hisG46-markören i stam TA100 resultatet av utbytet av ett leucin (GAG/CTC) mot ett prolin (GGG/CCC). Denna mutation återställs till vildtyptillstånd med hjälp av mutagena ämnen som orsakar basparsubstitutionsmutationer främst vid ett av GC-paren. Mutationen hisD3052 som bärs av stam TA98 är en -1 ramförskjutningsmutation som påverkar läsramen för en närliggande repetitiv -C-G-C-C-G-C-G-C-G-C-G-G- sekvens. Reversion av hisD3052-mutationen tillbaka till vildtypstillståndet induceras av olika ramförskjutningsmutationer, t.ex. 2-nitrofluoren och olika aromatiska nitrosoderivat av aminkarcinogener. HisD6610-mutationen i stam TA97a har också en ramförskjutningsmutation +1 (cytosin) som resulterar i en körning av 6 cytosiner (-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-). Denna stam tros vara mer känslig för några av de mutagena ämnen som omvandlar stam TA98. Stam TA102 utvecklades som innehåller AT-baspar vid hisG428-muteringsstället. Mutationen bärs på multikopieringsplasmidet pAQ1. Plasmiden ger tetracyklinresistens, vilket är en lämplig markör för att upptäcka plasmidens närvaro. HisG428-mutationen är en ockramutation, TAA, i hisG-genen som kan återställas genom alla sex möjliga basparändringar, både transitioner och transversioner. Denna mutation reverseras också av mutagena ämnen som orsakar oxidativ skada, förutom att upptäcka tvärbindande medel .

Den biologiskt aktiva kemikalien kan dessutom biotransformeras till en inaktiv metabolit. På samma sätt kan en inaktiv kemikalie biotransformeras till en aktiv metabolit . Därför är det viktigt att använda S9-fraktionen i Ames-testet: den gör det möjligt att utföra analyser i närvaro av metabolism, vilket ger mer tillförlitliga resultat.

Här, när det gäller säkerhet, utövade enligt våra resultat varken kaurenonsyra eller de undersökta växterna (extrakt och oleoresiner) mutagena effekter i de olika stammarna av Salmonella Typhimurium oavsett S9-aktivering.

De flesta artiklar om släktet Copaifera rapporterar om oleoresiner som avlägsnats från trädstammen. Att studera bladextrakt är dock också relevant eftersom de innehåller lovande bioaktiva molekyler. Faktum är att sökandet efter att bota sjukdomar genom bladinfusioner kan ha varit ett av de första sätten att använda naturprodukter, en praxis som fortfarande tillämpas nuförtiden .

Många Copaifera spp. används populärt som medicinalväxter i olika länder eftersom dessa arter uppvisar många farmakologiska egenskaper. När det gäller kaurenonsyra har flera biologiska effekter också rapporterats .

Vår studie är den första som undersöker säkerheten hos arterna C. lucens och C. oblongifolia och som också använder C. langsdorffii i oleoresin för att studera mutagenicitet. Effekterna av C. multijuga (oleoresin/extrakt) på DNA har behandlats i tidigare studier, dock med hjälp av olika tekniker i förhållande till vår studie som använde Ames-testet. Således bekräftar våra resultat data som publicerats av andra författare, som testat andra arter av Copaifera och deras kemiska beståndsdelar, eller använt olika experimentella modeller, och visat att de inte skadar DNA.

På detta sätt kan oleoresinet av C. multijuga och dess kemiska markör, diterpenen copalsyra, utvärderades av Alves et al. genom mikronukleusassay (V79-cellen) och Ames-testet för in vitro-studier, samt mikronukleus- och kometassays (schweiziska möss) för in vivo-försök. De erhållna uppgifterna visade att ingen av dem har någon genotoxisk/mutagen effekt under de experimentella förhållanden som använts. Jämfört med våra resultat visar dessa uppgifter att för C. multijuga påverkar varken det extrakt som utvärderades i vår studie eller det oleoresin som utvärderades av Alves et al. antalet revertantkolonier jämfört med den negativa kontrollen i Ames-testet; detsamma gäller för kopalsyra och kaurensyra. Dessa resultat tyder på att mutagenicitet saknas, oavsett metabolisk aktivering.

I en nyligen genomförd studie utvärderade Furtado et al. den genotoxiska potentialen hos C. multijuga och resultaten visade på avsaknad av skador på DNA, med tanke på att behandlingen både med oleoresin och bladextraktet av C. multijuga inte signifikant ökar mikronukleusfrekvensen in vitro (V79-cellen) och in vivo (schweiziska möss). Författarna utvärderade dessutom extrakt och oleoresiner från andra arter av detta släkte, såsom C. duckei, C. reticulata, C. paupera och C. pubiflora, och i likhet med resultaten för C. multijuga rapporterades avsaknad av genotoxicitet för alla testade arter.

Resultaten från studier av Alves et al. och Batista et al. visade att C. langsdorffii-extraktet inte signifikant ökade frekvensen av mikrokärnor (schweiziska möss) i perifert blod respektive benmärg. I en annan studie visade kometanalysen med Wistar-råttor inga signifikanta skillnader mellan djur som behandlades med enbart C. langsdorffii-extrakt och den negativa kontrollgruppen . Dessa data visar att extraktet inte uppvisar genotoxicitet.

Nyligen visade in vivo mikronukleustest och kometförsök med Wistar-råttor att Copaifera malmei-extraktet inte är genotoxiskt och har antimutagen aktivitet. Dessutom visade det subkroniska toxicitetstestet inga toxikologiskt relevanta förändringar, enligt beteendemässiga, biokemiska och hematologiska analyser i upp till 30 dagar. Dessa resultat tyder på att Copaifera malmei-extraktet har en hög säkerhetsmarginal för terapeutisk användning. Toxicitets- och genotoxicitetsbestämningar visade att användningen av Copaiba-olja också är säker: histopatologisk utvärdering avslöjade inga förändringar hos Copaiba-oljebehandlade djur, och mutagenitetsbedömning (mikronukleustest; 2000 mg/kg kroppsvikt) visade inte på genotoxiska effekter .

Leandro et al. använde Ames-testet för att visa att extraktet från C. trapezifolia inte är mutagent mot samma Salmonella Typhimurium-stammar som testades här, oberoende av metabolisk aktivering.

Med avseende på de olika Copaifera-arternas kemiska sammansättning har UPLC-MS/MS- och CG/MS-analyser av oleoresinerna identifierat sura diterpener och större flyktiga sesquiterpener, medan höga halter av fenoliska föreningar, inklusive flavonoida heterosider och galloylkinesyraderivat, har verifierats i bladen. Bland oleoresinbeståndsdelarna är diterpener de överlägset viktigaste komponenterna och inkluderar ent-agatsyra, ent-kopalsyra och ent-kaurenonsyra, följt av sesquiterpener som β-bisabolen, α-humulen och trans-β-karyofyllen . När det gäller Copaifera species leaf hydroalkoholiska extrakt innehåller de huvudsakligen quercetin, afzelin och kinasyror .

Enligt Almeida et al. , är Copaiba oleoresin (kommersiell produkt) och dess fraktioner, som innehåller sesquiterpener, metylestrar av diterpenkarboxylsyra och höga halter av β-karyofyllen, inte genotoxiska, vilket framgår av in vivo comet assay eller mikronukleustest. β-karyofyllen, huvudbeståndsdelen i oleoresiner och flyktiga fraktioner, främjar inte cytotoxiska eller genotoxiska effekter i humana lymfocytkulturer och skyddar mot DNA-skador orsakade av etylmetansulfonat . Utvärdering av nio sesquiterpener, inklusive transkaryofyllen, med Ames-testet har visat att ingen av föreningarna är mutagena .

I en nyligen genomförd studie visade behandling av cellinjer för magsäckscancer och normal magsäcksslemhinna med kaurenonsyra att syrakoncentrationen starkt korrelerar med indexet för DNA-skador och med mikronukleusfrekvensen, som bestäms med hjälp av comet-assay respektive mikronukleustest . Å andra sidan rapporterade Cavalcanti et al. att låga koncentrationer av kaurenonsyra, en bioaktiv diterpenoid som extraherats från C. langsdorffii, inte heller orsakar DNA-skador eller förändrar mikronukleusfrekvensen i V79-celler. Signifikant ökad DNA-skada blev tydlig först efter celexponering för högre kaurenonsyrakoncentrationer (30 eller 60 μg/mL).

Här bestämde vi kaurenonsyrans toxicitet för varje utvärderad Salmonella Typhimurium-stam genom att använda syrakoncentrationer med utgångspunkt från toxicitetsgränsen. Högre kaurenonsyrakoncentrationer förhindrar bakterietillväxt, vilket gjorde det möjligt för oss att bedöma den mutagena potentialen hos denna förening. På grundval av våra resultat är de oleoresiner som testats här inte mutagena, inte ens vid de högsta undersökta koncentrationerna.

Enligt litteraturen kan användningen av olika organismer eller olika testsystem ge olika resultat. Detta beror på att testsystem för genotoxicitet och mutagenicitet delas in i två grupper. Cytogenetiska metoder analyserar eukaryoter och ger information som varierar från genmutationer till kromosomskador och aneuploidier. Bakteriella metoder däremot analyserar prokaryoter och ger information om genmutationer och primära DNA-skador som orsakas av ett agens .

Tester som systerkromatbyte, kromosomavvikelser och mikrokärnor har använts för att påvisa DNA-skador på kromosomnivå vid biologisk övervakning hos människor, medan Ames Salmonella/mikrosommutationstest har använts i stor utsträckning för att verifiera den mutagena aktiviteten hos oräkneliga kemiska ämnen och råa växtextrakt .

Enligt Ferguson kan ämnen vara klastogena när det gäller däggdjursceller, vilket är fallet med ämnen som används i mikronukleustestet. Samma ämnen kan dock vara negativa i bakteriella tester, t.ex. Ames-testet. Det är därför viktigt att utvärdera säkerheten hos växter eller deras kemiska föreningar genom att fokusera på utvärderingen av de olika typerna av genetiska skador. Det rekommenderas att Ames-testet kombineras med in vitro-studier av däggdjursceller eftersom de kan täcka in flera viktiga mutagena parametrar (genetiska mutationer, strukturella kromosomskador och aneuploidi) och även täcker in testerna i prokaryotiska och eukaryotiska system. I litteraturen betonas dessutom att studien med Ames-testet inte bör utelämnas, eftersom det bakteriella genmutationstestet upptäcker alla relevanta verkningssätt som specifikt leder till genmutationer .

I tidigare arbeten har man observerat att föreningar kan vara uteslutande positiva i en eller flera av däggdjurscellinjerna, det vill säga att de positiva resultaten inte stöds av Ames-testet eller in vivo-testerna . De resultat som först erhålls genom Ames-testet reproduceras senare i djurförsök; avsaknaden av mutagenicitet i Ames-testet har därför gjort det möjligt att ta fram nya läkemedel med färre biverkningar . Dessa uppgifter understryker betydelsen av studier som vår, som visar att växter och deras huvudkomponenter inte är mutagena med hjälp av Ames-testet.

5. Slutsatser

Samt sett stöder våra resultat en säker användning av de utvalda medicinalväxterna som tillhör släktet Copaifera. De mutagena effekterna av enskilda föreningar kan dock maskeras på grund av antagonistiska effekter av andra föreningar som finns i extrakt eller oleoresiner . Våra resultat visar också att både kaurenonsyra och de utvärderade medicinalväxterna kan betraktas som potentiellt säkra för terapeutisk användning.

Data Tillgänglighet

Den data som används för att stödja resultaten av denna studie ingår i artikeln.

Oppenläggning

Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende och Jaqueline Lopes Damasceno hade full tillgång till alla data i studien och tar ansvar för dataintegriteten och noggrannheten i dataanalysen.

Intressekonflikter

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Författarnas bidrag

Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani och Jairo Kenupp Bastos bidrog i hög grad till utformning och design, insamling, analys och tolkning av data. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende och Carlos Henrique Gomes Martins har varit delaktiga i utarbetandet av manuskriptet eller har granskat det kritiskt med avseende på viktigt intellektuellt innehåll. Carlos Henrique Gomes Martins och Flávia Aparecida Resende gick med på att ansvara för alla aspekter av arbetet. Alla författare har läst och godkänt det slutliga manuskriptet.

Acknowledgments

Författarna tackar CAPES (Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel), CNPq (Nationella rådet för vetenskaplig och teknisk utveckling) och São Paulos forskningsstiftelse (FAPESP, Grants nos. 2011/13630-7 och 2012/25237-0) för finansiellt stöd och University of Franca för det stöd de fått. Jaqueline Lopes Damasceno har fått ett doktorandstipendium från CAPES (Coordination for the Improvement of Higher Level-or Education-Personal).