γδ-selektion

γδT-celler uppstår från DN-thymocyter, eftersom omarrangemanget av TCRγ- och δ-kedjorna sker i DN-stadierna . γδ-prekursorceller, som har TCRγ och δ omarrangerade före TCRβ-rekombination, uttrycker γδTCR/CD3-komplexet på plasmamembranet, där γδTCR självoligomeriseras, liksom pre-TCR, och initierar intracellulära signalvägar . Denna γδTCR-signal inducerar den process som kallas ”γδ-selektion”, som bekräftar genereringen av funktionella TCRγδ-kedjor, vilket får cellen att inse att ”jag är en γδT-cell” .

Den γδ-selektionssignalen utlöser differentieringen från CD5- CD24höga γδ-prekursorceller till CD5+ CD24låga γδT-engagerade celler . Övergången från CD5- till CD5+ γδT-celler är tydligt nedsatt hos Syk-deficienta möss, medan Zap70-deficienta möss uppvisar normal differentiering av CD5+ γδT-celler. Zap70/Syk-möss med dubbla brister uppvisar ett fullständigt stopp i differentieringen av γδT-celler i CD5-prekursorstadiet. γδ-selektion är således huvudsakligen beroende av den Syk-medierade signalen, och Zap70 spelar endast en mindre och överflödig roll i denna process. Denna mekanism är helt analog med den för β-selektion. Ett kritiskt mål för Syk i γδ-selektionssignalen är Lat-signalosomen, eftersom Lat-deficienta möss uppvisar fullständig hämning av γδ-selektion och en total avsaknad av mogna γδT-celler .

γδ-prekursorceller från Syk/Zap70-deficienta möss eller Lat-deficienta möss kan inte särskiljas från αβT-linjens celler genom uttrycket av deras cellytaproteiner, med undantag för γδTCR, och de bibehåller fortfarande potentialen att differentiera sig till αβT-celler. Vad avgör differentieringsöde till αβT- eller γδT-linjen från prekursorn? Denna fråga har behandlats genom studier med hjälp av γδTCR-transgena möss. När γδTCR-signalen försvagas genom brist på antingen signalproteiner eller endogena ligander för den transgena γδTCR, gav prekursorcellerna upphov till DP-celler av αβT-linjen på bekostnad av celler av γδT-linjen . Dessa resultat tyder på att en starkare signal (sannolikt vid γδTCR-ligandinteraktion) leder till engagemang för γδT-celler, medan en svagare signal (sannolikt genom ligandoberoende pre-TCR) leder till αβT-differentiering. Försök med en annan transgen musstam som uttrycker γδTCR med samma ligandspecificitet visade dock att γδT-celler kunde mogna i frånvaro av liganderna . Chien och medarbetare använde en tetramerisk färgningsmetod för att identifiera den ligandspecifika γδT-cellpopulationen för att undersöka betydelsen av endogena γδTCR-ligander i icke-transgena möss. Resultaten visade tydligt att antalet ligandspecifika γδT-celler var jämförbart mellan ligandtillräckliga och -deficienta möss, vilket tyder på att majoriteten av γδT-cellerna inte har stött på ligander under tymdifferentieringen . Författarna har också bevisat att vissa γδTCRs kan signalera ligandoberoende . Dessa observationer motsäger uppenbarligen den tidigare modellen att γδT-linjebindningen kräver γδTCR-ligandinteraktion. Med tanke på att polyklonala γδT-celler som reagerar på vissa exogena ligander differentieras och mognar funktionellt i thymus, är det troligt att observationerna i vissa γδTCR-transgena muslinjer inte återspeglar majoriteten av γδT-celler med polyklonala γδTCRs.

För att undersöka effekten av γδ-selektionssignalen på αβT/γδT-differentieringen använde vi Lat-deficienta möss, i vilka γδT-celldifferentieringen stoppas i CD5-prekursorstadiet. γδTCR+-prekursorceller renades från vuxna Lat-deficienta möss, infekterades med retrovirus som uttrycker Lat och odlades på stromala cellmonolager (fig. 2a). Detta experiment gör det möjligt att direkt utvärdera cellfenotypen före och efter γδ-selektion under ligandfria förhållanden. Jämfört med icke-transducerade kontrollceller uppvisade Lat-uttryckande γδT-celler en markant induktion av ytuttrycket av CD5 (fig. 2b), liksom mRNA-uttryck av γδT-cellsignaturgener (Tcrd, Egr3, Runx3 och Bcl-2), och fullständig abrogation av transkriptionen av gener som är förknippade med prekursor-DN-celler och αβT-celler (Rag1, Rag2 och Ptcra) (fig. 2c). Dessa resultat tyder på att γδTCR-signalen både driver differentiering mot γδT-linjen och undertrycker differentiering till αβT-linjen på ett ligandoberoende sätt.

Tillsammans, även om mekanismerna fortfarande är svårfångade (och omdebatterade) genom vilka pre-TCR och γδTCR styr differentieringsprocesserna till αβT- respektive γδT-linjerna, är det troligt att γδ-selektion, åtminstone i majoriteten av de naturligt genererade γδT-cellerna, inte är beroende av kognata γδTCR-ligand i thymus.

γδTCR-signalstyrka bestämmer γδT17/γδT1-differentiering

Under utvecklingen av både αβT- och γδT-linjerna är uttrycket av Syk och Zap70 omvänt reglerat: Syk uttrycks i hög grad i de tidiga stadierna (DN1-3 och γδ-prekursor) och nedregleras därefter, medan Zap70 uttrycks i de senare stadierna (efter β-selektion eller γδ-selektion) . γδT-celler som har passerat γδ-selektion uttrycker höga nivåer av Zap70 samt γδTCR/CD3-komplex och kan reagera på endogena ligander om de tillhandahålls i thymus. Det är för närvarande känt att γδT-celler, till skillnad från αβT-celler, inte genomgår liganddriven positiv selektion eller klonell deletion i thymus. Flera studier har föreslagit att γδTCR-ligandinteraktionen i thymus i stället styr γδT-cellernas effektorfunktion.

Med hjälp av tetramerisk färgning av en γδT-cellpopulation som är reaktiv för de icke-klassiska MHC-klass I-molekylerna T10 och T22 fann Chiens grupp att antigennaiva γδT-celler som utvecklades i avsaknad av liganderna företrädesvis producerade IL-17, medan antigenerfarna γδT-celler som utvecklades i närvaro av liganderna företrädesvis producerade IFNγ . Denna studie föreslog för första gången tanken att en ligandinducerad stark γδTCR-signal och en svag γδTCR-signal inducerar γδT1- respektive γδT17-celler. En nyligen genomförd studie med nyproducerade T10/T22-deficienta möss rapporterade i stort sett samma resultat, vilket stöder denna ”signalstyrkemodell” . Denna modell har fått ytterligare stöd av andra studier. Den tymiska mognaden och effektordifferentieringen av Vγ5Vδ1 γδT-celler kräver Skint1 (och sannolikt andra proteiner ur Skint-familjen), ett förmodat kostimulerande protein för Vγ5Vδ1 TCR . I avsaknad av Skint1 är Vγ5Vδ1 γδT-celler felaktigt inriktade på en γδΤ17-cellfenotyp på bekostnad av γδΤ1-cellfenotypen . Utvecklingen av γδT1-celler kräver dessutom kostimulering via CD27, ett protein från TNF-receptorns superfamilj som uttrycks i γδT1-celler, men inte i γδT17-celler . Nyligen identifierade Penningtons grupp thymiska bipotenta γδT-celler (CD24lo CD44lo CD45RBlo) som kan ge upphov till både γδT17-celler och γδT1-celler. I organkulturer av fosterthymus hämmades utvecklingen av γδT17-celler av starka TCR-signaler som inducerades av stimulering med anti-TCRδ- eller anti-CD3ε-antikroppar, men dessa effekter upphävdes av farmakologisk hämning av MEK/ERK-systemet. Dessa data ger direkta bevis till stöd för idén att γδTCR-signalstyrkan är en kritisk faktor som bestämmer γδT-cellernas effektorfunktion.

På transkriptionsnivå inducerar den starka γδTCR-signalen uttrycket av γδT1-associerade transkriptionsregulatorer, såsom Egr2, Egr3 och Id3, vilket resulterar i γδT1-cellernas öde . Id3 hämmar antagandet av γδT17-cellfate genom att hämma den transkriptionsreglering som förmedlas av HEB (som kodas av Tcf12) . HEB kan binda direkt uppströms till de transkriptionella startplatserna för Sox4 och Sox13 för att främja deras uttryck. Dessa γδT17-associerade transkriptionsfaktorer krävs för uttryck av den viktiga transkriptionsfaktorn RORγt (kodad av Rorc) och signalproteinet Blk . Med tanke på dessa fakta visar modellen för TCR-signalstyrka tydligt de mekanismer genom vilka TCR-signalen kontrollerar γδT-cellernas effektorfunktion.

En serie studier har dock visat hur genetisk ablation av TCR-signalmolekyler påverkar γδT-cellernas effektorfunktion, vilket ifrågasätter idén om att γδTCR-signalstyrkan i sig självt bestämmer γδT17/γδT1-differentieringsöde. Zap70 W163C-muterade möss uppvisar en fullständig förlust av Vγ6+ γδT17-cellutveckling men har normal utveckling av γδT1-celler, samtidigt som TCR-signalerna dämpas hos dessa möss . En annan studie av Silva-Santos och medarbetare visade att möss haploinsufficienta för CD3δ och CD3γ (CD3DH), som hade lägre uttryck på cellytan av γδTCR/CD3-komplexen och försämrad γδTCR-signalering, uppvisade en markant minskning av den thymiska utvecklingen av Vγ6+ γδT17-celler samt γδT1-celler men inte av Vγ4+ γδT17-celler, vilket tyder på att γδT17-undergrupperna kräver olika γδTCR-signalstyrka för sin utveckling. Även om αβT-cellernas utveckling och αβTCR-signaltransduktionen inte påverkades i CD3DH-möss är denna musstam den enda djurmodell hittills där specifik hämning av γδTCR-signalering har påvisats. Det är fortfarande oklart varför γδT-celler påverkas specifikt i CD3DH-möss, men det är troligt att den distinkta sammansättningen av TCR-CD3-komplexen αβT- och γδT-cellerna förklarar den unika fenotypen hos CD3DH-möss. I detta sammanhang bör det noteras att möss med CD3ε C80G-mutationen, som inte kan inducera konformationsförändringar i TCR, också uppvisar försämrad γδT17-cellutveckling men normal γδT1-cellutveckling .

Syk krävs för γδT17-differentiering

Nyligen rapporterade vi en ny regleringsmekanism genom vilken de γδTCR-proximala kinaserna Syk och Zap70 differentiellt kontrollerar γδT17-induktionen . Syk-deficienta möss uppvisar fullständig förlust av γδT17-celler (både Vγ4+ och Vγ6+-undergrupper) i thymus. Framför allt misslyckades tvångsuttryck av Zap70 i Syk-defekta T-progenitorceller att återställa γδT17-cellgenerationen, vilket tyder på att Syk har en icke-redundant roll i γδT17-differentieringen. Eftersom Syk- men inte Zap70-deficienta γδT-celler uppvisar en signifikant minskning av Akt-fosforyleringen som induceras av γδTCR-stimulering, tyder det på att Syk förmedlar den γδTCR-inducerade aktiveringen av PI3K-Akt-systemet. PI3K-deficienta möss (p110γ-/- p110δ-/-) uppvisar fullständig hämning av γδT17-cellutvecklingen men är opåverkade när det gäller γδ-selektion (CD5-uppreglering) eller γδT1-utveckling. Hämning av PI3K visade sig minska uttrycket av γδT17-associerade transkriptionsfaktorer (Rorc, Sox13 och Sox4), vilket tyder på att PI3K-Akt-vägen spelar en avgörande roll för att inducera γδT17-differentieringsprogrammet. I överensstämmelse med detta har en tidigare rapport visat att kinasinaktiva PI3Kδ- eller PI3Kγ-deficienta möss uppvisar en markant minskning av antalet perifera γδT17-celler och en förbättring av γδT17-beroende inflammation . PI3K-Akt-vägen krävs också för differentiering av IL-17-producerande αβT-celler (Th17) , vilket tyder på att denna signalväg är en gemensam regleringsmekanism som delas av αβT- och γδT-linjerna för att inducera IL-17-producerande proinflammatoriska undergrupper.

γδTCR-inducerad aktivering av PI3K-Akt-vägen är beroende av Syk men inte Lat, vilket tyder på att Syk driver PI3K-Akt-vägen för att inducera γδT17-differentiering utöver den Lat-beroende mainstream-signalvägen som inducerar γδ-selektion . Det är oklart om Syk aktiverar PI3K/Akt-vägen i γδT-celler genom direkt interaktion eller på ett indirekt sätt. I en tidigare studie rapporterades att Rasgrp1-deficienta möss uppvisar en γδT-cell-effektorfenotyp som liknar den hos PI3K-deficienta möss (dvs. förlust av γδT17-celler och ökning av γδT1-celler) . Eftersom Rasgrp1 kan fungera som en uppströmsaktivator av PI3K/Akt-vägen i αβTCR-signalering , är det troligt att Rasgrp1 vidarebefordrar signaler från γδTCR till PI3K för att inducera γδT17-differentiering.

Preferentiell förlust av γδT17-celler rapporterades också hos möss med brist på Blk, ett Src-familjekinas som uttrycks i γδT-celler såväl som i B-celler, även om dess funktion i γδTCR-signaltransduktionen är okänd .

Zap70 kontrollerar vissa γδT-cellundergrupper

Vi har också påvisat Zap70:s roll i den thymiska differentieringen av γδT-celler . Zap70-deficienta möss uppvisar en markant minskning av Vγ6+ celler, varav majoriteten är γδT17 men är opåverkade när det gäller utvecklingen av andra γδT-celler, inklusive Vγ1+ såväl som Vγ4+ undergrupper. Faktum är att uttrycksnivån för Zap70-proteinet var högst i Vγ6+-undergruppen bland γδT-cellerna. Eftersom CD5-uttrycket var lägre i Zap70-bristande Vγ6+-celler än i kontrollceller, krävs Zap70 sannolikt för tymisk mognad av Vγ6+-celler. I våra experiment hade Zap70-deficienta möss normal tymisk differentiering av Vγ4+-celler, inklusive γδT17-subgruppen, vilket motsäger den tidigare rapporten där en hypomorf Zap70-mutation orsakade en minskning av tymiska Vγ4+ γδT17-celler . Denna diskrepans kan bero på de olika möss som användes i de två studierna (Haydays grupp använde hypomorfa Zap70-muterade möss på en BALB/c-bakgrund, medan vi använde fullständigt Zap70-defekta möss på en C57BL/6-bakgrund). Dessutom uppvisade Zap70-deficienta möss en signifikant minskning av perifera Vγ4+-celler, som inkluderade både γδT17- och γδT1-undergrupperna, men hade oskadade Vγ1+-celler. I motsats till dess viktiga roll i αβT-cellutvecklingen är således kravet på Zap70 begränsat till den tymiska mognaden av Vγ6+-celler och det perifera underhållet av Vγ4+-celler.

Våra fynd om de olika rollerna för Zap70 och Syk kan ge en ny ledtråd för att förstå mekanismerna för γδTCR-signalering och γδT-cellutveckling. Zap70 krävs för αβTCR-signalering och γδTCR-signalering i vissa γδT-cellundergrupper. I αβT-celler är aktiveringen av Zap70 beroende av Lck, som är kopplad till CD4- eller CD8-koreceptorer som binder till pMHC på ytan av antigenpresenterande celler . Det antyds således att Lck-Zap70 är en signalaxel som är specialiserad på antigenigenigenkänning som uppnås genom cellcellskontakt; även om det i fallet γδT-celler förblir oklart hur Zap70 aktiveras trots avsaknaden av CD4- och CD8-uttryck. Däremot är Syk associerad med ett stort antal immunoreceptorer, inklusive pre-TCR, γδTCR, BCR och FcR . Eftersom Syk kan fosforylera ITAM och nedströmsmål oberoende av Src-familjens kinaser, t.ex. Lck , kan dessa receptorer aktiveras ligandoberoende eller efter bindning till en rad olika lösliga antigener och antigener på cellytan. Användningen av Syk eller Zap70 i immunreceptorns signalering kan således diktera hur receptorn känner igen antigenet. Expression av Syk i stället för Zap70 gjorde faktiskt αβT-celler kapabla att reagera på stimulering av lösliga anti-CD3-antikroppar, medan normala αβT-celler endast reagerade på multimeriserade anti-CD3-antikroppar som efterliknar interaktionen med pMHC på cellytan . Dessa fynd föranledde oss att ställa hypotesen att det sätt för antigenigenigenkänning som används av lymfocyter kan bestämmas inte bara av deras receptor i sig, utan också av en distinkt användning av Syk-familjens kinaser. Utifrån detta koncept förutspår vi att det finns endogena γδTCR-ligander på cellytan som krävs för thymisk mognad av Vγ6+-celler samt för det perifera underhållet av Vγ4+-celler, och att Vγ1+-celler inte kräver γδTCR-ligander på cellytan för sin utveckling och/eller sitt underhåll.

γδTCR-oberoende och -beroende processer för γδT17-induktion

En färsk rapport visade på ett elegant sätt att γδT17-celler uppstår från en progenitor som skiljer sig från de andra γδT-cellsubgrupperna . Det rapporterades att intrathymiska progenitorer med ursprung i fostret som uttrycker höga nivåer av Sox13 identifierades i en population som tidigare kategoriserats som DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi) tymocyter. Dessa Sox13+ progenitorer gav företrädesvis upphov till γδT17-celler i den återskapade fosterthymus, medan andra progenitorer inom DN2-populationen inte gjorde det. Viktigast av allt var att Sox13+-progenitorerna kunde påvisas och att deras γδT17-linjeprogram var intakta hos TCRδ-deficienta eller Rag-deficienta möss, vilket tyder på att γδT17-linjens öde är ”förprogrammerat” genom en cellintrinsisk, γδTCR-oberoende mekanism. En tidigare rapport visade dock att γδT17-celler kan utvecklas från DN2-stadiet (CD44+CD25+c-kithi) när de samodlas på ett monolager av Notch-ligand-uttryckande stromaceller . Det kan alltså finnas ett behov av att omdefiniera differentieringsstadierna och relationerna mellan progenitor och descendent i γδT-cellernas utveckling.

Figur 3 sammanfattar differentieringsprocesserna för γδT-celler samt αβT-celler, och belyser skillnaderna i kravet på αβ/γδTCR-signaler och Syk-familjens kinaser. De tidiga stegen i differentieringen, dvs. β-selektion för αβT-cellinjen och γδ-selektion för γδT-cellinjen, drivs av ligandoberoende pre-TCR- eller γδTCR-signalering, som fungerar som en kontrollpunkt för de celler som uttrycker en funktionell TCRβ-kedja respektive γδTCR-kedja. Dessa ligandoberoende receptorsignaler initieras av Syk, som uttrycks i DN-thymocyter, inklusive γδT-prekursorer. I γδT-cellinjen krävs den Syk-medierade γδTCR-signalen också för att starta differentieringen av γδT17-celler via aktivering av PI3K-vägen. Under både β-selektion och γδ-selektion regleras uttrycket av Syk och Zap70 omvänt: Syk nedregleras medan Zap70 uppregleras vid pre-TCR- eller γδTCR-signalering. Därför är det senare steget i αβT-linjedifferentieringen beroende av Zap70-medierad αβTCR-signalering, vilket gör det möjligt för DP-thymocyter att känna igen pMHC på ytan av TECs för att bli positivt eller negativt selekterade beroende på styrkan i αβTCR-pMHC-interaktionen. Däremot bestämmer Zap70-medierad γδTCR-signalering som svar på endogena ligander γδT-cellernas effektorfunktion: en stark signal inducerar γδT1, medan en svag/ingen signal inducerar γδT17.

.