Identifiering, fylogenetisk analys och gruppklassificering av bZIP-gener i A. duranensis och A. ipaensis

Baserat på homologisökningar och domänverifiering identifierades totalt 50 och 45 unika bZIP-gener i A. duranensis respektive A. ipaensis genom. Detaljerna för dessa gener, inklusive gen-ID, genomisk position, domänsammansättning och gruppklassificering finns i tilläggsfil 1. I enlighet med det befintliga nomenklatursystemet gav vi unika namn till var och en av dessa nya bZIP-gener: AdbZIP1-50 och AibZIP1-45. Efter kontroll av bZIP-domäner hade 93 gener en typisk bZIP-domän, inklusive ett invariant N-× 7-R/K-motiv i den grundläggande regionen och en heptad upprepning av Leu som är placerad exakt nio aminosyror uppströms från R/K mot C-terminus (Additional file 2). De återstående två bZIP-generna, AdbZIP28 och AibZIP22, hade en ovanlig substitution i den grundläggande regionen: den bevarade Arg/Lys (R/K) ersattes med IIe (I). Denna ersättning har också rapporterats i andra arter .

En systematisk undersökning av bZIP-genfamiljen genomfördes först i Arabidopsis . I denna analys skiljdes och namngavs olika grupper av bZIP-gener utifrån deras fylogenetiska relationer och funktionella divergenser. Detta klassificeringssystem har sedan dess antagits för andra arter baserat på kluster av bZIP-gener från deras egna och Arabidopsis genomer . Här, baserat på en ML-analys (maximum likelihood) av bZIP-proteiner från Arachis- och Arabidopsisgenomerna, identifierade vi 11 distinkta bZIP-genklasser (grupperna A-I, S och U), alla med högt bootstrap-stöd (fig. 1). Subgruppsklassificeringen av Arachis bZIP-gener bekräftades ytterligare genom en fylogenetisk trädrekonstruktion efter att bZIP-gener från sojabönor lagts till (Additional file 3). De flesta bZIP-klasser omfattar närbesläktade bZIP:er från Arachis och deras ortologer från Arabidopsis; klasser E och F har inga motsvarande medlemmar i A. duranensis eller A. ipaensis. Det är anmärkningsvärt att bZIP-gener inom samma klad delade liknande gruppspecifika sekvensegenskaper, inklusive exon/intronstruktur, intronfaser, MEME-motiv och förutsägelse av bindningsställets struktur (analyseras ytterligare nedan). Detta mönster av interspecifik gruppklustring tyder på att de gruppspecifika egenskaperna uppstod före divergensen mellan Arachis och Arabidopsis. Flera skillnader har dock också ackumulerats i bZIP-generna hos de olika växtarterna under evolutionär tid.

Genstruktur för Arachis bZIP-gener

Som intron- och exonorganisation kan indikera den evolutionära banan för bZIP-gener , undersökte vi strukturen för Arachis bZIP-gener, inklusive intronantal, längd och splicingfas (Additional file 4). Vi fann att de övergripande genstrukturerna var identiska eller liknande för Arachis bZIP-gener inom samma fylogenetiska grupp. Med tanke på antalet introner i jordnöts bZIP:er var 24 % av AdbZIP:erna och 22 % av AibZIP:erna intronlösa och förekom uteslutande i grupperna S och B. Bland de gener som innehöll introner varierade antalet introner från 1 till 13 i AdbZIP- och AibZIP-gener. bZIP-gener i grupp G innehöll flest introner, vilket stämmer överens med observationer i andra arvsmassor av baljväxter .

Spliceringsfaserna betecknades som tre spliceringsfaser: fas 0 (P0), spliceringen skedde efter kodonets tredje nukleotid, fas 1 (P1), spliceringen skedde efter kodonets första nukleotid och fas 2 (P2), spliceringen skedde efter den andra nukleotiden. Splöjningsställenas faser inom de öppna läsramarna (open reading frames, ORF) var olika, men var mycket konserverade i bZIP-domänens bas- och gångjärnsregioner, eftersom alla förändringar i dessa regioner skulle påverka deras kod och funktion. Baserat på intronpositionen och förekomst eller antal skarvningsfaser i bZIP-domänen identifierades fyra intronmönster (a till d) i Arachis bZIP-gener (fig. 2 och Additional file 2). Mönster a hade bara ett intron infogat vid positionen – 5 i hinge-regionen, mellan aminosyrorna Gln och Ala; detta mönster identifierades i alla Arachis bZIP-gener i grupperna A och G. Mönster b hade två introninfogningar med fas 0, en i den grundläggande regionen och den andra i hinge-regionen; detta mönster identifierades i alla bZIP-gener i grupp D. Mönster c hade ett enda intron infogat i positionen – 20 i den grundläggande regionen i fas 2 (P2) och innehåller alla bZIP-gener i grupperna C och H. Mönster d saknade introner i den grundläggande regionen och hinge-regionen och innehåller alla bZIP-gener i grupperna B och S. Dessutom var de flesta Arachis bZIP-gener som uppvisar mönster d intronlösa, med undantag för AdbZIP45 och AibZIP40. Var och en av dessa gener hade en intron utanför bas- och hinge-regionerna. Mönstren för splicingfasen i Arachis bZIP-domänen som observerades här stämde överens med dem som observerades hos andra arter . Det höga bevarandet av genstruktur och intronfaser inom fylogenetiska klasser stödde den accepterade gruppindelningen och föreslog att dessa olika mönster av exonsplicing kan spela en viktig roll i den funktionella evolutionen.

Motivsammansättningarna för olika grupper av Arachis bZIPs

Förutom bZIP-domänen upptäcktes många ytterligare bevarade motiv i bZIP-gener med hjälp av MEME-analysverktyget. Som framgår av figur 3 identifierades totalt 18 bevarade motiv utanför bZIP-domänen, och konsensusmotivsammansättningarna för varje undergrupp konstruerades (Additional file 5). Dessa konsensusmotiv visade att de övergripande sammansättningarna av motiven var likartade inom samma undergrupp men olika mellan olika grupper. Detta tydde på att funktionell divergens hos bZIP-gener kan bestämmas av gruppspecifika motiv. En individuell undersökning av dessa motiv visade att många var gruppspecifika. Exempelvis identifierades motiv 1, 2, 3 och 10 endast i grupp D, motiv 5, 14 och 15 endast i grupp G, motiv 6 endast i grupp I och motiv 9 endast i grupp H. Flera motiv kan vara förknippade med specifika biologiska funktioner. Motiv 1 är t.ex. domänen DELAY OF GERMINATION (DOG) 1, som krävs för induktion av vila och flera aspekter av frömognad, delvis genom att störa ABA-signaleringskomponenter . Motiv 3 innehåller potentiella fosforyleringsställen för kaseinkinas II (CK II) (S/TxxD/E), som spelar en nyckelroll i celldelning och cellutvidgning och påverkar olika utvecklings- och stressresponsiva vägar . Intressant nog har dessa gruppspecifika motiv också identifierats i bZIPs från samma grupp i andra baljväxters genomer , vilket tyder på att motivsammansättningen är bevarad bland baljväxter.

Arachis bZIP DNA-bindningsplatsens struktur och dimeriseringsegenskaper

Den grundläggande kärnregionen och gångjärnsregionen i bZIP-domänen bestämmer oberoende av varandra DNA-bindningsspecificiteten, vilket visats av flera experiment . Den ovanliga ersättningen av de två oföränderliga platserna, asparagin (Asn/N; position: – 18) och arginin (Arg/R; position: – 10), förändrade DNA-bindningsspecificiteten . Vi anpassade aminosyrasekvenserna för bas- och gångjärnsregionerna hos bZIP-proteiner från jordnötter för att identifiera konserverade och polymorfa aminosyrarester inom varje grupp (Additional file 6). Inga ersättningar av Asn/N i positionen – 18 observerades i någon jordnöts bZIP-protein. Alla medlemmar i grupp I hade dock lysin (Lys/K) i stället för arginin (R) i positionen – 10, vilket stämmer överens med grupp I bZIPs från andra baljväxtarter . Dessutom hade AdbZIP28 och AibZIP22 (grupp U) en hydrofob isoleucinrest (Ile/I) i stället för en argininrest (Arg/R), och det har visats att en sådan ersättning helt hämmar bZIP:s affinitet för AP1 i jäst och att den inte känner igen G-boxar i ris .

Leu-zipper-sekvensen medierar homo- och/eller heterodimeriseringen av bZIP-proteiner, som är kända för att binda till DNA som dimerer . Leu zipper-regionen består av heptadsrepetitioner, aminosyrorna betecknas a, b, c, d, e, f och g inom varje heptad . Eftersom aminosyrorna i positionerna a, d, e och g ligger nära Leu zipper-gränssnittet är det dessa aminosyror som i första hand bestämmer Leu zipper-oligomeriseringen, dimeriseringsstabiliteten och dimerspecificiteten. Vi analyserade sammansättningen av de aminosyror som finns vid a-, d-, e- och g-positionerna i jordnöts bZIP-proteiner (fig. 4a).

I a-positionen, var cirka 20 % av resterna asparagin (Asn/N), som kan bilda en polär ficka i det hydrofoba gränssnittet, vilket möjliggör stabilare N-N-interaktioner vid a↔a′ (motsvarande position i den motsatta spiralen), jämfört med andra aminosyror . I de olika heptaderna hade den andra och femte heptaden den högsta frekvensen Asn/N-rester i a-positionen (61,46 respektive 60,22 %; fig. 4b). I d-positionen (fig. 4a) fanns Leu i 45 % av alla jordnötsbZIP:er och är en av de mest dimerstabiliserande alifatiska aminosyrorna . I e-positionen hade 37 % av alla jordnötsbZIP:er de sura aminosyrorna D eller E, medan 44 % av alla jordnötsbZIP:er i g-positionen hade de basiska aminosyrorna R eller K (fig. 4a). Dessa laddade aminosyror tros bilda saltbryggor mellan spiralerna i elektrostatiska interaktioner . De attraktiva eller repulsiva g↔e′ elektrostatiska interaktionerna kan också bilda interhelikala saltbryggor som påverkar dimeriseringsspecificiteten och stabiliteten . För att undersöka bidraget från laddade rester i e och g-positionerna när det gäller att styra dimeriseringsegenskaperna hos Arachis bZIP-proteiner, beräknades frekvensen av attraktiva och repulsiva g↔e′-par i varje heptad (fig. 4c). I alla heptads var de attraktiva g↔e′-paren koncentrerade till den andra (15,6 %), femte (35 %) och sjätte (30 %) heptads, vilket tyder på att de kan bilda fullständiga attraktiva g↔e′-interaktioner och bidra till stabilitet genom komplementering i en heterodimer. Tre grupper som omfattar 28 underfamiljer (BZ1-BZ28) delades vidare upp baserat på homo- och heterodimeriseringsegenskaper, särskilt dimeriseringsspecificitet (Additional file 7).

Inverkan av duplicering av hela genomet och tandemduplicering på expansionen av Arachis bZIP-genfamilj

Vi identifierade de kollinjära duplicerade blocken på hela genomet i genomet för A. duranensis och A. ipaensis och de ortogena kollinjära blocken mellan två genomer. De parvisa synonyma avstånden (Ks-värden) mellan paralogerna och ortologerna inom kollinjära block beräknades, och deras frekvensfördelningar plottades (fig. 5a; Ks bin = 0,05). Den högsta Ks-frekvensen mellan A. duranensis och A. ipaensis, som representerar genomsnittlig sekvensvariation, var 0,035. Detta representerade sekvensdivergensen mellan dessa två närbesläktade Arachis-arter, som uppskattades ha divergerat för ~ 2,16 miljoner år sedan . Vidare var Ks-topparna för A. duranensis och A. ipaensis paraloger 0,90 respektive 0,95, vilket motsvarar sekvensdivergensen för den tidiga papilionoida duplikationen av hela arvsmassan (WGD) som inträffade för ~ 58 miljoner år sedan .

Vi upptäckte 35 AdbZIP:er och 32 AibZIP:er som var involverade i duplicerade genomiska block, vilket motsvarar cirka 70 % (35/50) och 71 % (32/45) av bZIP-generna i varje art (fig. 5b och Additional file 8). Dessutom förekom de duplicerade bZIP-genparen antingen inom en kromosom eller mellan kromosomer, och vissa av dessa par var segmentalt duplicerade en, två eller tre gånger. Detta resultat tyder på att generna helst ska behållas och att kromosomala arrangemang är frekventa efter WGD. Tandemduplikationer upptäcktes för endast två genpar (AdbZIP33/AdbZIP34 och AdbZIP41/AdbZIP42) i A. duranensis och endast ett genpar (AibZIP28/AibZIP29) i A. ipaensis. Detta tyder på att tandemduplicering förekom sällan och inte var viktigare än segmentell duplicering vid expansionen av bZIP-genfamiljen. Vi använde också fylogenetiska och synteniska analyser för att identifiera 35 ortologa bZIP-genpar mellan A. duranensis och A. ipaensis. Dessa gener var också homeologer mellan de två subgenomerna av den tetraploida jordnöten.

För att förstå de evolutionära begränsningar som verkar på Arachis bZIP-gener beräknade vi Ka/Ks-värden för varje duplicerat bZIP-genpar i två Arachis-arter (Additional file 9). För de flesta av dessa parvisa jämförelser var Ka/Ks-värdena mindre än 0,5 (endast en parvis jämförelse mellan duplicerade AdbZIP-gener och endast två mellan duplicerade AibZIP-gener var större än 0,5). Detta tyder på att ett starkt renande urval verkade på Arachis duplicerade bZIPs för att avlägsna skadliga mutationer på proteinnivå.

Expressionsanalys av Arachis bZIP-gener under jordnötsfröutveckling

För att profilera bZIP-genuttrycket använde vi våra tidigare publicerade RNA-seq-data , som dokumenterar genuttrycket i jordnötsfrön vid olika utvecklingsstadier: 20, 40 och 60 dagar efter blomning (DAF). Med hjälp av dessa data identifierade vi FPKM-värdena för alla Arachis bZIPs och alla differentiellt uttryckta bZIPs i de tre utvecklingsstadierna. Med undantag för 24 bZIP:er, som inte uttrycktes i något utvecklingsstadium, identifierades fyra grupper med motsvarande bZIP-gener med specifik uttrycksprofil (Fig. 6a och Additional file 10). Den första gruppen bestod av 37 bZIPs som var uppreglerade under tidig utveckling (20 DAF), men nedreglerade därefter (vid 40 och 60 DAF). Den andra gruppen bestod av 15 bZIP:er som var uppreglerade vid 40 DAF, medan den tredje gruppen bestod av 17 bZIP:er som var nedreglerade vid 40 DAF. Den fjärde gruppen bestod av 22 bZIP:er som var starkt uttryckta i alla tre utvecklingsstadierna. De högt uttryckta bZIP:erna i grupp fyra var huvudsakligen fördelade i klasser A, C och S. Flera av dessa bZIP:er var homologa med gener som har varit inblandade i fröutvecklingen hos andra växter, t.ex. arabidopsis, ris och majs. Här valdes 12 bZIPs, som var högt uttryckta och homologa till tidigare välstuderade gener i fröutvecklingen, ut för qRT-PCR-bekräftelse, och man fann att de uttrycksmönster som bestämdes genom RNA-seq överensstämde med dem som hittades med hjälp av qRT-PCR (Fig. 6b).

I grupp A var AdbZIP33 och AibZIP28 ortologer till Arabidopsis ABA insensitive 5 (ABI5), som är förknippad med ABA-signalering samt reglering av fröutveckling och livslängd i Arabidopsis och baljväxter . Våra RNA-seq- och qRT-PCR-resultat visade att båda de ortologa ABI5-kopiorna från de två subgenomerna av den tetraploida jordnöten uttrycktes i hög grad under utvecklingen, vilket tyder på att funktionen hos dessa gener kan vara likartad i jordnöt och Arabidopsis. Våra qRT-PCR-resultat visade också att grupp A-generna AdbZIP42, AdbZIP48 och AibZIP31 uttrycktes stabilt under utvecklingen (fig. 6b och Additional file 11). Dessa gener är homologa med ABFs och AREB, som är involverade i ABA-medierad fröutveckling, groning och embryomognad . Tre gener i grupp C (AdbZIP23, AdbZIP37 och AibZIP30) var också starkt uttryckta och är homologa med majsens bZIP-faktor Opaque2. Opaque2 reglerar proteinansamling och ämnesomsättning av aminosyror och socker i majsfrön . Dessutom var grupp S-generna AibZIP10, AdbZIP12, AdbZIP24, AdbZIP26 och AdbZIP36 extremt högt uttryckta i jordnötsfrön (fig. 6b och Additional file 11). Intressant nog hade grupp S-generna AdbZIP24 och AdbZIP36 ett liknande uttrycksmönster som grupp C-generna AdbZIP37 och AibZIP30: en minskning av uttrycksnivån när fröutvecklingen fortskred.

Vi undersökte sedan ytterligare divergenserna i genuttryck mellan homologa gener från AA- och BB-genomerna i den tetraploida jordnötskaninen. Värmekartanalysen visade att de övergripande uttrycksmönstren under fröutvecklingen var likartade för 31 par homeologa/orthologa gener från AA- och BB-genomerna. Vi använde metoden för differentiell uttrycksanalys i kombination med statistiska metoder för att beräkna skillnader i genuttryck mellan dessa genpar för varje prov. Vi fann att 3 genpar (AdbZIP5 och AibZIP5, AdbZIP17 och AibZIP15, AdbZIP46 och AibZIP41) var differentiellt uttryckta vid 20 DAF, 3 par (AdbZIP3 och AibZIP1, AdbZIP4 och AibZIP4, AdbZIP49 och AibZIP45) vid 40 DAF och 5 par (AdbZIP3 och AibZIP1, AdbZIP33 och AibZIP28, AdbZIP37 och AibZIP30, AdbZIP10 och AibZIP10, AdbZIP1 och AibZIP3) vid 60 DAF. Dessa resultat indikerade den övergripande uttryckskonserveringen mellan två genomer, men antydde att 20 % av generna hade divergerat i uttryck under den parallella evolutionen och polyploidiseringen av två genomer (Fig. 6c).

qRT-PCR-uttrycksprofiler av Arachis bZIP-gener under saltstress

Vi använde qRT-PCR för att utforska förändringar i bZIP- genuttrycket som svar på saltbehandling (Fig. 7 och Additional file 12). Vi kunde inte tydligt amplifiera 4 bZIP-gener med PCR. Efter att jordnötsrötter behandlats med salt i 1 timme var 20 gener signifikant differentiellt uttryckta; efter 5 timmar var 27 gener signifikant differentiellt uttryckta; och efter 10 timmar var 41 gener signifikant differentiellt uttryckta (fig. 7j; Students t-test: P < 0,05). Vid varje tidpunkt var många fler gener uppreglerade än nedreglerade (14 vs. 6 vid 1 h, 21 vs. 6 vid 5 h och 34 vs. 7 vid 10 h). Bland dessa differentiellt uttryckta bZIPs efter saltbehandling fördelades många av dem i grupperna A och S (fig. 7k), vilket tyder på att bZIPs i dessa grupper spelar viktiga roller i sockersignalering och reglering av abiotisk stress .

Grupp A bZIP:er har CKII- och Ca2 + -beroende proteinkinasfosforyleringsmotiv som är involverade i stress- och/eller ABA-signalering, och dessa motiv är viktiga för växters anpassning till olika abiotiska miljöstressorer . Många gener i grupp A är förknippade med saltstressresponsen. I Arabidopsis är ABI5 och ABFs/AREB viktiga ABA-beroende signaltransduktionsfaktorer som är involverade i abiotisk stresstolerans . Överexpression av GhABF2 förbättrade signifikant toleransen mot saltstress både i Arabidopsis och bomull . I tomat ökade knockout av slAREB1 och slbZIP1 toleransen mot saltstress, medan överuttryck av slAREB1 och slbZIP1 minskade toleransen mot saltstress. Generna AdbZIP42 och AibZIP35 uppreglerades signifikant som svar på saltstress, och dessa gener är homologa med ABFs, GhABF2, slAREB1 och slbZIP1. Dessutom har dessa gener rapporterats fosforyleras av de ABA-aktiverade SnRK2-proteinkinaserna , vilket tyder på att fosforylering av ABA-reaktionselementbindande faktorer kan vara avgörande för den ABA-medierade saltstressresponsen.

Grupp B-generna AdbZIP45 och AibZIP40 uppreglerades efter 10 timmars saltstress, och dessa gener är homologa med AtbZIP17, vilket skulle kunna förbättra uttrycket av flera saltstressresponsgener i Arabidopsis . Sju bZIP-gener i grupp G (AdbZIP7, AdbZIP15, AdbZIP19, AdbZIP50, AibZIP17, AibZIP21 och AibZIP38) var homologa med Arabidopsis AtbZIP41 och tomat slbZIP38, och dessa gener har båda visat sig reglera saltstress negativt . Av dessa sju gener var AdbZIP15 signifikant nedreglerad efter 1 h och 5 h saltstressbehandling, medan AdbZIP19 och AibZIP17 var signifikant uppreglerade efter 10 h saltstress. AdbZIP15, AdbZIP19 och AibZIP17 kan alltså ge motståndskraft mot saltstress. AdbZIP15 kan vara en negativ regulator av saltstress, eftersom dess uttrycksmönster liknade slbZIP38:s som svar på saltstress.

Grupp S-generna AdbZIP24 och AdbZIP36 var homologa till AtbZIP1, AtbZIP53, MtbZIP2 och MtbZIP26, och uttrycksmönstren för dessa gener som svar på saltstress var likartade (fig. 7). Särskilt AdbZIP36 uppreglerades signifikant efter 10 timmars saltstress. Två homologa gener i Arabidopsis, AtbZIP1 och AtbZIP53, visade sig omprogrammera den primära kolhydrat- och aminosyrametabolismen för att hjälpa rötterna att anpassa sig till saltstress . De homologa generna MtbZIP2 och MtbZIP26 induceras också transkriptionellt av saltbehandling och förbättrar växternas tolerans mot saltstress . Särskilt märkbart är att uttrycksmönstret för AdbZIP36 liknade det för AtbZIP1, MtbZIP2 och MtbZIP26 i Arabidopsis och M. truncatula , vilket tyder på att AdbZIP36 kan vara en positiv regulator av tolerans mot saltstress i jordnötter. Sammanfattningsvis har vår studie av uttrycksanalys identifierat flera kandidater till bZIPs i jordnötter, som kan vara förknippade med saltstressresponsen, som mål för framtida forskning.