Röntgenstrålarnas interaktion med elektronerna i en kristall ger upphov till ett diffraktionsmönster, som matematiskt sett är en Fouriertransform av elektrontäthetsfördelningen. De detektorer som används för att mäta röntgenstrålarna kan dock bara mäta amplituden av de diffrakterade röntgenstrålarna; fasförskjutningarna, som krävs för att använda Fouriertransformen och hitta elektrontäthetsfördelningen, kan inte mätas direkt med denna metod. Detta är känt i fysikvärlden som ”fasproblemet”. Förenklat kan man säga att faserna inte kan hittas från de uppmätta amplituderna av röntgenstrålarna. Andra extrapoleringar måste göras och ytterligare experiment måste utföras för att få fram en kartläggning av elektrontätheten. Många gånger kan befintliga uppgifter om föreningens fysikaliska och kemiska egenskaper hjälpa till när det finns en dålig täthetskarta. En annan metod som kallas Patterson-syntes är mycket användbar för att ta reda på en första uppskattning av faserna och den är mycket användbar i de inledande skedena för att bestämma proteiners struktur när faserna inte är kända. Problemet kan förenklas genom att hitta en atom, vanligtvis en tungmetall, med hjälp av Patterson-syntesen och sedan använda denna atoms position för att uppskatta de inledande faserna och beräkna en inledande elektrondensitetskarta som ytterligare kan hjälpa till att modellera positionen för andra atomer och förbättra fasuppskattningen ännu mer. En annan metod kallas Molecular Replacement (molekylär ersättning); den lokaliserar proteinstrukturens plats i cellen. Förutom den molekylära ersättningsmetoden kan fasproblemet också lösas med den isomorfa ersättningsmetoden, den anomala diffraktionsmetoden med flera våglängder, den anomala diffraktionsmetoden med en enda våglängd och direkta metoder.

Molekylär ersättningRedigera

Fasproblemet kan lösas genom att man har en atomär modell som kan beräkna faser. En modell kan erhållas om den relaterade proteinstrukturen är känd. För att bygga denna atomära modell måste dock modellens orientering och position i den nya enhetscellen bestämmas. Det är då tekniken, molekylär ersättning (eller MR) kommer in.

Molekylär ersättning, även känd som MR, är en metod för att lösa fasproblem inom röntgenkristallografi. MR lokaliserar orienteringen och positionen för en proteinstruktur med dess enhetscell, vars proteinstruktur är homolog till den okända proteinstruktur som måste bestämmas. De erhållna faserna kan bidra till att generera elektrondensitetskartor och bidra till att producera beräknade intensiteter av proteinstrukturmodellens position till de observerade strukturerna från röntgenkristallografiexperimentet.

MR-metoden är också effektiv för att lösa makromolekylära kristallstrukturer. Denna metod kräver mindre tid och ansträngning för strukturbestämning, eftersom derivat av tunga atomer och insamling av data inte behöver förberedas. Metoden är okomplicerad och modellbyggandet förenklas eftersom det inte behövs någon kedjespårning.

Denna metod består av två steg:

1. en rotationssökning för att orientera den homologa modellen i enhetscellen eller målet
2. ett translationsmål där den nya orienterade modellen placeras i enhetscellen

Patterson-baserad (Molekylär ersättning)Redigering

Patterson-kartor är interatomära vektorkartor som innehåller toppar för varje relaterad atom i enhetscellen. Om Patterson-kartorna genererades på grundval av data som härrör från elektrondensitetskartorna bör de två Patterson-kartorna vara nära besläktade med varandra endast om modellen är korrekt orienterad och placerad i rätt läge. Detta kommer att göra det möjligt för oss att härleda information om den okända proteinstrukturens placering med dess cell. Det finns dock ett problem med den molekylära ersättningen, den har sex dimensioner, tre parametrar för att ange orientering och position. Med Patterson-kartorna kan den delas upp i delmängder av parametrarna för att titta på varje del separat.

RotationsfunktionRedigera

Rotationsfunktionen har intramolekylära vektorer som bara beror på molekylens orientering och inte på dess position, eftersom även när molekylen förflyttas i enhetscellen är alla atomer förskjutna med samma mängd men vektorerna mellan atomerna är desamma. Patterson-kartan för den okända proteinstrukturen jämförs med den homologa kända proteinstrukturen i olika orienteringar

Klassisk rotationsfunktionRedigera

För att hitta orienteringen bestämmer du rotationsaxeln och rotationsvinkeln kring den axeln. Två parametrar behövs för att definiera en axel (en vektor från sfärens centrum till en punkt på sfärens yta). Rotationsaxeln börjar parallellt med z-axeln och roteras runt y-axeln med vinkeln ᶱ, därefter roterar objektet runt z-axeln med vinkeln ᶲ och slutligen roterar det runt rotationsaxeln med vinkeln ᵠ. Dessa anger en punkt på ytan av en enhetssfär.

Snabb rotationsfunktionRedigera

Rotationsfunktionen kan beräknas genom att jämföra två Patterson-kartor eller topparna i dessa Pattersons. Rotationsfunktionen kan beräknas mycket snabbare med Fouriertransformationer endast om Pattersons uttrycks i termer av sfäriska harmonier.

Direkt rotationsfunktionRedigera

I den direkta rotationsfunktionen kan proteinstrukturen placeras i enhetscellen för den okända strukturen och Patterson för den orienterade molekylen jämförs med Patterson för hela den okända strukturen.

Translation FunctionEdit

När orienteringen av den kända strukturen är känd kan dess modell (elektrontäthetskarta) orienteras för att beräkna strukturfaktorer där en korrelationsfunktion används för att bestämma vektorn för att översätta modellen ovanpå den homologa modellen inom en asymmetrisk enhet.

Med korrekta orienterade och översatta fasmodeller för proteinstrukturen är det tillräckligt noggrant att härleda elektrontäthetskartorna från de härledda faserna. Elektrondensitetskartorna kan användas för att bygga upp och förfina modellen för den okända strukturen.

Anomal diffraktion med flera våglängderEdit

X-strålar genereras i stora maskiner som kallas synkrotroner. Synchotroner accelererar elektroner till nästan ljusets hastighet och förflyttar dem genom en stor, ihålig polygonring av metall. I varje hörn böjer magneter elektronströmmen, vilket leder till att energi avges i form av elektromagnetisk strålning. Eftersom elektronerna rör sig med ljusets hastighet avger de röntgenstrålar med hög energi.

Fördelarna med att använda synkrotroner är att forskarna inte behöver odla flera versioner av varje kristalliserad molekyl, utan i stället bara odla en typ av kristall som innehåller selen. De har sedan möjlighet att ställa in våglängden så att den matchar selenets kemiska egenskaper. Denna teknik är känd som Multiwavelength Anomalous Diffraction. Kristallerna bombarderas sedan flera gånger med våglängder av olika längd och så småningom uppstår ett diffraktionsmönster som gör det möjligt för forskarna att avgöra var selenatomerna finns. Denna position kan användas som en referens eller markör för att bestämma resten av strukturen. Fördelarna med detta gör att forskarna kan samla in sina data mycket snabbare.

Isomorphous Replacement MethodEdit

Denna metod jämför röntgendiffraktionsmönstren mellan den ursprungliga proteinkristallen och samma typ av kristall med ett tillägg av minst en atom med högt atomnummer. Metoden användes av Max Ferdinand Perutz (1914-2002) för att bestämma strukturen hos små molekyler och så småningom även hos hemoglobin. En perfekt isomorfism är när den ursprungliga kristallen och dess derivat har exakt samma proteinkonformation, molekylernas position och orientering samt enhetscellparametrarna. Den enda skillnad som kristallen och dess derivat har i en perfekt isomorfism är de intensitetsskillnader som beror på tillägget av tunga atomer på derivatet. Dessa skillnader kan identifieras manuellt eller genom ett automatiskt Patterson-sökförfarande, såsom SIR 2002, SHELXD, nB och ACORN, och sådan information är viktig för att bestämma proteinets fasvinklar. Perfekt isomorfism förekommer dock knappast på grund av förändringen av celldimensionerna. För proteinet med tung atom är den tolerabla förändringen av celldimensionen dmin/4, för dmin är upplösningsgränsen. Andra faktorer, såsom rotation, bidrar också till icke-isomorfism.

ProcedurerRedigera

1. Förbered några derivat av proteinet i kristallin struktur. Mät sedan celldimensionen för att kontrollera isomorfism.
2. Samla in röntgenintensitetsdata för originalproteinet och dess derivat.
3. Använd Patterson-funktionen för att bestämma koordinaterna för den tunga atomen.
4. Förädla parametrarna för den tunga atomen och beräkna fasvinkeln för proteinet.
5. Beräkna proteins elektrontäthet.

De derivat som framställs är gjorda genom två olika metoder. Den föredragna metoden är att blötlägga proteinkristallen i en lösning som är sammansatt identiskt med modervätskan, men med en liten ökning av utfällningskoncentrationen. En annan metod är samkristallisering, men den är inte vanligt förekommande eftersom kristallen inte växer eller växer nonisomorft. Blötläggningsförfarandet beror på hur vida kristallporerna är. Porerna ska vara tillräckligt breda för att reagenset ska kunna diffundera in i kristallen och nå de reaktiva platserna på ytan av alla proteinmolekyler i kristallen.

Metod för multipel våglängds anomal diffraktionEdit

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction (förkortat MAD) är en metod som används inom röntgenkristallografin och som gör det möjligt för oss att bestämma strukturerna hos biologiska makromolekyler, såsom proteiner och DNA, i syfte att lösa fasproblemet. Kraven för strukturen omfattar atomer som orsakar betydande spridning av röntgenstrålar; särskilt svavel eller metalljoner från metallproteiner. Eftersom selen kan ersätta naturligt svavel är det vanligare att det används. Användningen av denna teknik underlättar avsevärt för kristallografen att använda MIR-metoden (Multiple Isomorphous Replacement) eftersom preparering av tunga föreningar är överflödig.

Denna metod används för att lösa fasproblem, när det inte finns några tillgängliga data om spridd diffraktion förutom amplituder. Dessutom används den när en tungmetallatom redan är bunden i proteinet eller när proteinkristallerna inte är isomorfa, vilket är olämpligt för MIR-metoden. Metoden har främst använts för tunga metalllösningar, dessa metallenzymer kommer normalt från den första övergångsserien och deras grannar. Det är viktigt att ha en källa för ett kraftfullt magnetfält för att genomföra detta experiment, miljöer som underjordiska bör övervägas. En partikelaccelerator kallad synkrotron krävs också för metoden.

Anomal diffraktionsmetod med en enda våglängdEdit

I jämförelse med anomal diffraktion med flera våglängder (MAD) använder anomal diffraktion med en enda våglängd (SAD) en enda uppsättning data från en enda våglängd. Den viktigaste fördelaktiga skillnaden mellan MAD och SAD är att kristallen tillbringar mindre tid i röntgenstrålen vid SAD, vilket minskar den potentiella strålningsskadan på molekylen. Eftersom SAD endast använder en våglängd är det också mer tidseffektivt än MAD.

Elektrontäthetskartorna som härleds från anomala diffraktionsdata med en enda våglängd behöver genomgå modifieringar för att lösa fasomtydigheter. En vanlig modifieringsteknik är lösningsmedelsutjämning, och när SAD kombineras med lösningsmedelsutjämning är de elektrontäthetskartor som blir resultatet av jämförbar kvalitet med de kartor som härleds från fullständig MAD-fasning. Solvent flattening innebär att man justerar elektrontätheten i de interstitiella regionerna mellan proteinmolekylerna som upptas av lösningsmedlet. Lösningsmedelsområdet antas vara relativt oordnat och utan egenskaper jämfört med proteinet. En utjämning av elektrontätheten i lösningsmedelsregionerna kommer att förstärka proteinets elektrontäthet i en tolkningsbar grad. Denna metod kallas ISAS, iterativ anomal spridning av enstaka våglängder.

Direkta metoderRedigera

Den direkta metoden kan hjälpa till att återskapa faserna med hjälp av de data den erhåller. Direktmetoden uppskattar de initiala och expanderande faserna med hjälp av en trippelrelation. Trippelrelation (trio) är relationen mellan intensiteten och fasen för en reflektion och två andra intensiteter och faser. När den här metoden används spelar storleken på proteinstrukturen roll eftersom sannolikhetsfördelningen för fasen är omvänt proportionell mot kvadratroten av antalet atomer. Direktmetoden är den mest användbara tekniken för att lösa fasproblem.