Protrombin spelar en central roll i blodkoagulationen (fig. 1, 2). Dess funktionella egenskaper hänger samman med förekomsten av gamma-karboxyglutamylrester (Gla), som är resultatet av vitamin K-beroende posttranslationell karboxylering av tio specifika glutamylrester (fig. 3, 4). Mina studier på nötkreatur (t.ex. undersökning av kopplingen mellan metalljonbindning och proteinfunktion inom ””””””””prothrombinaskomplexet””””””””) kommer att skilja mellan ligandering och de efterföljande konformationella involveringarna av Gla-resterna i den normala fysiologiska processen. Inom denna ram har jag tidigare isolerat och karakteriserat sex olika Gla-bristande (0-, 1-, 2-, 3-, 5- och 7-Gla) protrombinvarianter. Var och en av dem genererade trombin kvantitativt men med en märkbart långsammare hastighet (hög K/m) än 10-Gla-protrombin på grund av den kraftiga minskningen av Ca/2+- och fosfolipidbindning jämfört med normalt 10-Gla-protrombin. Sju- och mindre-Gla-varianter uppvisade endast 3 % av den normala protrombinaktiviteten, mätt genom deras förmåga att påskynda koaguleringen av plasma med brist på protrombin och faktor VII. Nyligen isolerade 8- och 9-Gla-protrombiner har 18 respektive 75 % av den normala aktiviteten, vilket utgör en övergång mellan 7- och 10-Gla-protrombinerna. Isolering av 8- och 9-Gla-varianter blev möjlig genom användning av monoklonala antikroppar (McAb) mot den Ca2+-stabiliserade strukturen (Ca II Ab) av protrombin för immunoaffinitetskromatografi. Mina immunokemiska studier med Ca II Ab, polyklonala och monoklonala, har visat att de (polyklonala) inte är specifika för normalt protrombin eftersom de korsreagerar med 7-, 8- och (särskilt) 9-Gla-varianter. Dessutom tyder mina preliminära data med 5- och 7-Gla-protrombiner på att Glu-positionerna 15 och 17 inte modifieras, och att selektiva positioner (rester 7,8,20,30,33) kan vara företrädesvis karboxylerade. Den föreslagna forskningen kommer att avslöja om de prothrombiner som lider av Gla-brist verkligen är selektivt bristfälliga, vilket visar i vilken ordning ””””””””in vivo”””””””” karboxylering av Glu-rester sker. Min expertis när det gäller att beskriva hur positionen och/eller antalet Gla-rester påverkar de funktionella, fysikalisk-kemiska (konformationella) och immunokemiska egenskaperna hos protrombin och Gla-innehållande fragment 1 utgör grunden för isolering av mänskligt material både för grundläggande och kliniska studier. Jag kommer att isolera normala och de mest avgörande Gla-bristande protrombinerna. De senare kommer sedan att delas in i två (eller flera) grupper beroende på deras fysiologiska aktivitet. Målet kommer att vara att övervaka plasman hos patienter som behandlas med warfarin för normala prothrombiner, 9-Gla (om detta är det enda som är funktionellt aktivt) och totala prothrombiner (normala plus Gla-bristfälliga) genom immunoanalyser med specifika monoklonala antikroppar för att bedöma det hemostatiska tillståndet hos dessa patienter.
Syftet är att fastställa varför vissa patienter uppvisar trombotiska episoder medan andra förblir mer benägna att blöda, trots att deras plasmaprotrombinbioaktivitet bibehålls på kliniskt acceptabla nivåer. Dessutom kan Gla-deficienta protrombiner utgöra en annan markör för leverdysfunktion.