PMC
TESTMETODER FÖR PHOTOTOXICITET OCH ALTERNATIVTESTMETODER FÖR Djur
Det är viktigt att se till att kemikalier är fotosäkra när människor riskerar att utsättas för exponering, vilket tydligt kan exemplifieras med läkemedel (20) eller kosmetika (21). För att utvärdera potentiell fototoxicitet hos en kemikalie har man infört olika testmetoder som sträcker sig från in silico(22), in chemico(23), in vitro till in vivo tester. In chemico-tester som ROS-generering (24), in vitro-tester som omfattar 3T3 NRU-test och 3D-epidermismodell samt in vivo-studier med marsvin, mus eller pigmenterade råttor har utvecklats och används rutinmässigt (25).
Ljuskälla för fototoxicitet. Ljuskällan för fototoxicitet är extremt viktig eftersom de våglängder som absorberas av testkemikalien (absorptionsspektrum) och ljusdosen (som kan uppnås inom en rimlig exponeringstid) bör vara tillräckliga för att framkalla fototoxicitet (26). Solsimulatorer som simulerar naturligt solljus anses vara den idealiska konstgjorda ljuskällan (fig. 5).
Den filtrerade solsimulatorns strålningseffektfördelning bör ligga nära den för dagsljus utomhus. Solsimulatorer är utrustade med xenonbågar eller (dopade) kvicksilvermetallhalogenidbågar. De bör också vara lämpligt filtrerade för att dämpa de mycket cytotoxiska UVB-våglängderna. Det spektrum som registreras under dessa filter bör inte avvika från standardiserat dagsljus utomhus (specifikation: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
Däremot kan andra UVA-ljuskällor som UVA-lampor också användas med en lämplig UV-dosimeter för att kontrollera intensiteten och våglängden. Ljusintensiteten (irradiansen) varierar beroende på källorna, och den bör kontrolleras regelbundet före varje fototoxicitetstest med hjälp av en lämplig bredbands-UV-mätare. UV-mätaren måste kalibreras före varje mätning. Bestrålningstiden beror följaktligen på ljuskällans intensitet (för en ljuskälla på 1,7 mW/cm2 krävs t.ex. 50 min exponeringstid för att uppnå 5 J/cm2). Bestrålningstiden varierar också beroende på testmetoderna. En dos på 5 J/cm2 (mätt i UVA-området) fastställdes vara icke-cytotoxisk men tillräckligt potent för att excitera kemikalier för att framkalla fototoxiska reaktioner i 3T3 Neutral Red Uptake Assay.
3T3 Test för neutralt rött upptag. 3T3 NRU-testet har officiellt godkänts av OECD och godkänts som OECD TG432 den 13 april 2004 (3). Detta test utvärderar fotocytotoxicitet genom att bestämma den relativa minskningen av cellens livskraft efter exponering för testartikeln i närvaro respektive frånvaro av UV/VIS-strålning. Beslutet att genomföra 3T3 NRU-fototoxicitetstestet fattas för de kemikalier som uppvisar absorptionsspektrum i UV/VIS-området när de löses upp i lämpligt lösningsmedel (17). Det har föreslagits att om den molära extinktions-/absorptionskoefficienten är mindre än 10 liter x mol-1 x cm-1 är det osannolikt att kemikalien är fotoreaktiv (t.ex. i en UV-kuvett med en 1 cm lång ljusväg skall OD för en 0,05 M-lösning vara mindre än 0,5 för att den skall betraktas som icke-fotoreaktiv enligt ekvationen ”absorbans = extinktionskoefficient x ljusvägslängd x koncentration”) (26). 3T3 NRU-testet uppvisar en mycket känslig men låg specifik prediktiv förmåga (en känslighet på 93 % och en specificitet på 84 %). 3T3 NRU-testet har många begränsningar. Det kan inte förutsäga andra skadliga effekter än foto(cyto)toxicitet som kan uppstå vid kombinerad verkan av en kemikalie och ljus, t.ex. fotogenotoxicitet, fotoallergi(fotosensibilisering) eller fotokarcinogenicitet. 3T3 NRU-testet används endast för faroidentifiering, medan dess användbarhet för bedömning av fototoxisk styrka inte är motiverad.I synnerhet saknar detta testsystem metabolisk aktivitet, vilket är avgörande för manifestationen av systemiskt exponerade kemikalier. För systemiskt exponerade kemikalier som kräver metabolisk aktivering som monokrotalin, riddelliin och heliotrin (pyrrolizidinalkaloider) (28) rekommenderas därför in vivo djurstudier (5,29).
Fundamental testprincip för 3T3 NRU är jämförelsen av cellens livskraft i närvaro eller frånvaro av UV/Vis-strålning som bestäms med vitalt färgämne, neutralt rött, som är ett svagt katjoniskt färgämne som lätt tränger igenom cellmembraner och ackumuleras intracellulärt i lysosomer av livskraftiga celler. Bascelllinjen är Balb/c 3T3-cellen, som är en musfibroblast som utvecklades från musembryon av G.T. Todaro 1968. Beteckningen 3T3 står för ”3-day transfer, inoculum 3 × 105 cells” i en 20 cm2 skål, och denna cell är relativt stabil, lättillgänglig och lätt att hantera (30). Dermal fibroblast är en av målcellerna för fototoxicitet, vilket ger en solid grund för användningen av 3T3-celler.
För att avgöra om testartikeln är fototoxisk eller inte i 3T3 NRU-assay ska koncentrationsresponsen erhållas i närvaro och i frånvaro av bestrålning. Photo-Irritation-Factor (PIF) eller Mean Photo Effect (MPE) ska beräknas (31). PIF är förhållandet mellan IC50 (koncentration som minskar cellens livsduglighet med 50 %) för obestrålad och bestrålad enligt fig. 7.
När IC50 inte kan erhållas beräknas MPE enligt följande ekvation
PIF < 2 eller en MPE < 0,1 förutsäger: ”ingen fototoxicitet”. En PIF > 2 och < 5 eller en MPE > 0,1 och < 0,15 förutsäger: PIF > 5 eller MPE > 0,15 förutsäger: ”trolig fototoxicitet” och PIF > 5 eller MPE > 0,15 förutsäger: ”trolig fototoxicitet”: ”
Erythrocythemolysetest. Cellmembran är sårbara för fotokemiskt genererade ROS och radikaler. UVA-inducerade skador på erytrocyter och resulterande hemolys (fotohemolys) används för att bedöma testartiklarnas fototoxiska potential (32). Röda blodkroppar från får (SRBC) inkuberas med kemikalier och bestrålas med UVA vid 20 J/cm2. Efter bestrålningen inkuberades SRBC i mörker i 2 timmar i rumstemperatur och sedan i ytterligare 1 timme vid 37 ℃, varefter hemolysen mättes med Drabkins reagens och mätning av UV-absorptionen vid 540 nm. Fototoxicitetens omfattning bedömdes genom frisättning av hemoglobin från SRBC, dvs. fotohemolytisk aktivitet enligt ekvation (33).
-
ADE: optisk densitet av exponerad läkemedelslösning med erytrocyter
-
AD: optisk densitet av exponerad läkemedelslösning utan erytrocyter
-
C: Optisk densitet av 100 % hemolytisk kontrollösning
Fototoxiska medel som ciprofloxacin, norfloxacin eller enoxacin ökar den fotohemolytiska aktiviteten signifikant över 20 % vid 100 μg/mL. Känsligheten, specificiteten och noggrannheten för detta test var 67 %, 73 % respektive 73 % för 24 kemikalier (8 doftämnen, 5 UV-absorbenter, 4 läkemedel, 4 antimikrobiella medel och 3 färgämnen) jämfört med in vivo testet på marsvin (34). Låg känslighet kan vara problematisk och dess prestanda är mycket sämre än 3T3 NRU-testet, vilket kan förklara den minskade användningen av detta test på senare tid.
In vitro mänsklig 3D-epidermismodell. För att övervinna begränsningarna hos in vitro-cellbaserade metoder undersöks 3D-rekonstruerade epidermismodeller för tillämpning på fototoxicitetstester (35,36). Testprincipen liknar i princip 3T3 NRU-testet, nämligen bedömningen av skillnaden i vävnadsviabilitet mellan närvaro och frånvaro av UV/VIS-strålning. En liknande prediktionsmodell med PIF och MPE kan användas (37). I 3D-epidermismodellen kan dock vattenolösliga material testas och en viss grad av metabolisk kapacitet bevaras i de primära keratinocyterna i det epidermala lagret, vilket kan tillämpas på toxiska ämnen som kräver metabolisk aktivering (38). Dessutom är det möjligt att mäta cytokinproduktion som IL-1β (Interleukin-1β) (39), cometanalys (40) och histologisk undersökning som kan beaktas i den fortsatta utvärderingen av fotoallergenicitet och fotokarcinogenicitet.
In vivo-metoder där marsvin, mus eller pigmenterade råttor används. Laboratoriedjur som möss och marsvin används för att simulera verkliga scenarier för fototoxicitet hos människor. Djuren exponeras för kemikalier lokalt eller systemiskt och bestrålas med lämplig UVA-dos (i allmänhet 10 J/cm2 för marsvinstestet och 20 J/cm2 för musetestet (41)). Värdering av erytem och ödem från 0 till 4 summeras och den maximala värderingen under 72 timmars observation räknas samman per djur för att skapa ett irritationsindex. Fototoxicitetsindex erhålls genom ekvationen ”Irritationsindex för UVA-strålad plats – Irritationsindex för icke-strålad plats” (42). Fototoxicitetsindex över 0,6 indikerar potentiell fototoxicitet. Alternativt kan örontjocklek mätas för att uppskatta ödem i musförsök. Dessa in vivo-tester återspeglar väl den patofysiologiska processen för fototoxicitet hos människor, men de djuroffer, kostnader och den tid som krävs för att genomföra testerna innebär många problem, särskilt i en tid då medvetenheten om djurens välbefinnande och etik är utbredd. Fototoxicitetstester som inte är baserade på djur blir alltmer populära för att lösa dessa problem (43).
Inchemiska metoder för utvärdering av fototoxicitet. Cellfria teströrsmetoder, nämligen in chemico, har undersökts för att bedöma fototoxicitet. Information om ljusabsorption och fotostabilitet hos testartikeln har analyserats för att förutsäga fototoxicitet (44). Genom att använda generering av reaktiva syrearter under fotoexcitering och efterföljande fotoreaktion kan en kemikalies fototoxiska potential utvärderas in chemico (12). Singulettsyre påvisas genom p-nitrosodimetylanilin (RNO)-blekning medan nitroblåttetrazoliumtest (NBT-formazanreaktion) används för att bestämma peroxidgenerering enligt nedanstående bild (24),
-
Singlet oxygen + imidazol
-
→ → oxiderad imidazol
-
+ RNO
-
→ RNO-blekning + produkter
ROS-genereringstest uppvisade en känslighet och specificitet på 90 % och 76 %.9 % för kosmetika och 100 % och 75 % för icke-kosmetiska kemikalier. DNA-strängbrytande aktivitet är ett annat sätt att utvärdera UV-inducerad fototoxicitet hos olika typer av kemikalier eller läkemedel in chemico genom att kvantifiera öppet eller slutet cirkulärt DNA. Detta test kräver inte heller levande celler eller vävnader, utan plasmid. Plasmid löses upp i buffert och blandas med testartiklarna. Efter att blandningen har bestrålats med UV-strålning utsätts proverna för elektrofores. Mängden av trasigt DNA analyseras med hjälp av fluorescensbaserad teknik. UV-inducerad fototoxisk förening resulterar i öppning av DNA-strängar och det är beroende av läkemedelskoncentrationen och UV-strålningsdosen (33). Dessa tester kräver inga levande celler eller vävnader som kan öka variabiliteten i testresultaten. Dessa metoder har dock begränsningar som omfattar bristande metabolisk aktiveringskapacitet, olämplighet för vattenolösliga material (oljor, fasta ämnen, geler, formulerade produkter) och oförmåga att förutsäga fotogenotoxicitet, fotoallergi (fotosensibilisering) eller fotokarcinogenicitet. Detta test är begränsat till faroidentifiering, inte till en bedömning av fototoxisk styrka.