Den centrala dogmen inom molekylärbiologin är DNA→RNA→Protein. För att syntetisera ett visst protein måste DNA först transkriberas till messenger RNA (mRNA). mRNA kan sedan översättas vid ribosomen till polypeptidkedjor som utgör proteinernas primära struktur. De flesta proteiner modifieras sedan genom en rad posttranslationella modifieringar, inklusive proteinveckning, bildande av disulfidbryggor, glykosylering och acetylering, för att skapa funktionella, stabila proteiner. Proteinuttryck avser det andra steget i denna process: syntesen av proteiner från mRNA och tillägget av posttranslationella modifieringar

Lär dig mer molekylärbiologi i vår e-bok Plasmider 101!

Forskare använder olika tekniker för att styra proteinuttryck för experimentella, biotekniska och medicinska tillämpningar. Forskare kan visualisera proteiner in vivo genom att märka dem med fluorescerande proteiner för att studera lokalisering eller rena proteiner för att studera deras struktur, interaktioner och funktioner. Proteiner kan också renas för användning inom molekylärbiologisk forskning (t.ex. kan polymeraser och andra enzymer renas och användas för att manipulera DNA) eller inom medicinen (t.ex. insulin).

Proteiner måste, till skillnad från DNA som relativt enkelt kan syntetiseras, framställas med hjälp av komplexa blandningar som härrör från celler eller med hjälp av levande celler. Det finns flera typer av uttryckssystem som används för produktion och rening av proteiner. Dessa inkluderar däggdjurs-, insekts-, bakterie-, växt-, jäst- och cellfria uttryckssystem.

Den generella strategin för proteinexpression består i stort sett av att transfektera celler med valfri DNA-mall och låta cellerna transkribera, översätta och modifiera det protein som är intressant för dig. Modifierade proteiner kan sedan extraheras från lyserade celler med hjälp av proteintaggar och separeras från föroreningar med hjälp av olika reningsmetoder. Beslutet om vilket uttryckssystem som ska användas beror på flera faktorer:

1. Proteinet du försöker uttrycka
2. Hur mycket protein du behöver
3. Dina planer för nedströmstillämpningar

I det här blogginlägget kommer vi att sammanfatta några av de vanligaste uttryckssystemen, inklusive deras fördelar och förbehåll som du bör tänka på innan du väljer ett system.

Mammalian expression systems

Mammalian cells är ett idealiskt system för uttryck av däggdjursproteiner som kräver flera posttranslationsmodifieringar för korrekt proteinfunktion. De flesta DNA-konstruktioner som utformats för däggdjursuttryck använder virala promotorer (SV40, CMV och RSV) för robust uttryck efter transfektion. Däggdjurssystem kan uttrycka proteiner både övergående och genom stabila cellinjer. Båda metoderna ger höga proteinutbyten om transfektionen lyckas.

Vissa däggdjurssystem gör det också möjligt att kontrollera när ett protein uttrycks genom användning av konstitutiva och inducerbara promotorer. Inducerbara promotorer är mycket användbara om en önskad proteinprodukt är giftig för cellerna i höga koncentrationer. Trots sina fördelar kräver däggdjursuttryckssystem krävande cellodlingsförhållanden jämfört med andra system.

Insektsuttryckssystem

Insektsceller kan också användas för att producera komplexa eukaryota proteiner med rätt posttranslationella modifieringar. Det finns två typer av insektsuttryckssystem; baculovirusinfekterade och icke-lytiska insektsceller.

Baculovirus-expressionssystem är mycket kraftfulla för rekombinant proteinuttryck på hög nivå. Dessa system möjliggör högt uttryck av mycket komplexa, glykosylerade proteiner som inte kan produceras i E. coli- eller jästceller. Det enda problemet med baculovirus-system är att den infekterade värdcellen så småningom lyseras. Celllysen stoppar proteinproduktionen, men det finns icke-lytiska system för insektscellexpression (sf9-, Sf21- och Hi-5-celler) som gör det möjligt att kontinuerligt uttrycka gener som är integrerade i insektscellens arvsmassa. Båda dessa typer av insektsexpressionssystem kan skalas upp för produktion av stora mängder protein.

Några nackdelar med insektscell-expressionssystem är bland annat att virusproduktion kan vara ganska tidskrävande och att insektsceller kräver krävande odlingsförhållanden som liknar däggdjurs-expressionssystem.

Bakteriella uttryckssystem

När man vill producera stora mängder protein snabbt och billigt, är en bakteriell värdcell nästan alltid svaret. E. coli är definitivt en av de mest populära värdcellerna för proteinuttryck med flera stammar som är specialiserade för proteinuttryck. Proteinuttryck i bakterier är ganska enkelt; DNA som kodar för ditt intressanta protein sätts in i en plasmiduttrycksvektor som sedan transformeras till en bakteriecell. De transformerade cellerna förökar sig, induceras till att producera det aktuella proteinet och lyseras sedan. Protein kan sedan renas från cellresterna.

Det finns flera populära DNA-vektorer som kan användas för att producera stora mängder protein i bakterieceller: t.ex. vektorerna pET, pRSET, Gateway pDEST och pBAD. Proteinuttryck från var och en av dessa vektorer styrs av en annan promotor vilket resulterar i olika nivåer av uttryck från varje vektor; lägre uttryck kan krävas om ditt protein är giftigt för E. coli. Av alla vektorer ger pET, under kontroll av T7 lac-promotorn och inducerad av laktos, den högsta nivån av proteinuttryck.

Trots deras användarvänlighet är det viktigt att notera att bakterier vanligtvis inte kan producera funktionella däggdjursproteiner med flera domäner eftersom bakterieceller inte är utrustade för att lägga till lämpliga posttranslationella modifieringar. Dessutom blir många proteiner som produceras av bakterier olösliga och bildar inklusionskroppar som är svåra att extrahera utan hårda reagenser och tålamod.

Växtuttryckssystem

Plantor är ett billigt och lågteknologiskt sätt att massuttrycka rekombinanta proteiner. Många celler från olika typer av växter som majs, tobak, ris, sockerrör och till och med knölar av potatis har använts för proteinuttryck.

Plantsystem har många av samma egenskaper och bearbetningskrav som uttryckssystem för däggdjursceller, inklusive majoriteten av komplexa posttranslationella modifieringar. Extraktion och rening av rekombinanta proteiner från växter kan dock vara dyrt och tidskrävande eftersom växtvävnader i sig är biokemiskt komplexa.

För att kringgå dessa problem har forskare utnyttjat den naturliga utsöndringen av biokemikalier och proteiner genom växtrötter. Att märka rekombinanta proteiner med en naturligt utsöndrad växtpeptid gör det lättare att komma åt och rena ett önskat protein. Trots att det är en ganska ny teknik har växtceller använts för att uttrycka ett stort antal proteiner, inklusive antikroppar och läkemedel, särskilt interleukiner.

Yeast-expressionssystem

Yeast är ett utmärkt uttryckssystem för att generera stora mängder rekombinanta eukaryota proteiner. Även om många arter av jäst kan användas för proteinuttryck är S. cerevisiae den mest tillförlitliga och ofta använda arten på grund av dess användning som modellorganism inom genetik och biokemi.

När forskare använder S. cerevisiae placerar de ofta rekombinanta proteiner under kontroll av den galaktosinducerbara promotorn (GAL). Andra vanligt förekommande promotorer är de fosfat- och kopparinducerbara promotorerna PHO5 respektive CUP1. Jästceller odlas i väldefinierade medier och kan lätt anpassas till jäsning, vilket möjliggör storskalig och stabil produktion av proteiner.

I allmänhet är jästuttryckssystem enklare och billigare att arbeta med än däggdjursceller och kan ofta modifiera komplexa proteiner till skillnad från bakteriesystem. Jästceller har dock en långsammare tillväxthastighet än bakterieceller och odlingsförhållandena måste ofta optimeras. Jästceller är också kända för att hyperglykosylera proteiner, vilket kan vara ett problem beroende på vilket protein du väljer.

Cellfria uttryckssystem

I cellfria uttryckssystem sätts proteiner samman in vitro med hjälp av renade komponenter i transkriptions- och översättningsmaskineriet. Dessa inkluderar ribosomer, RNA-polymeras, tRNA, ribonukleotider och aminosyror. Cellfria uttryckssystem är idealiska för snabb sammansättning av mer än ett protein i en reaktion. En stor fördel med dessa system är deras förmåga att sammansätta proteiner med märkta eller modifierade aminosyror som är användbara i olika tillämpningar i efterföljande led. Cellfria uttryckssystem är dock dyra och mycket tekniskt utmanande att använda.

Alyssa D. Cecchetelli är forskare på Addgene. Hon disputerade vid Northeastern University och är särskilt intresserad av cellsignalering och kommunikation. Hon älskar att kunna hjälpa forskarvärlden att dela plasmider.

Allmänna resurser

• Thermofisher Protein Expression Systems
• Rekombinant proteinexpression i Escherichia coli: framsteg och utmaningar
• Produktion av rekombinanta proteiner i växters rotexsudat