Nytta av organiska syror producerade av Exiguobacterium sp. 12/1 vid neutralisering av alkaliskt avloppsvatten
Abstract
Syftet med den här studien var att undersöka betydelsen av organiska syror producerade av Exiguobacterium sp. stam 12/1 (DSM 21148) vid neutralisering av alkaliskt avloppsvatten som härstammar från dryckesindustrin. Denna bakterie är känd för att kunna växa i medium med pH så högt som pH 12,0 och för att neutralisera alkaliskt industriellt avloppsvatten från pH 12,0 till pH 7,5. Den inledande undersökningen av typen av funktionella grupper i mediet, som utfördes med hjälp av FT-IR-spektroskopi, avslöjade förekomsten av toppar som motsvarar karbonyl- och hydroxylgrupper, vilket tyder på att karboxylsyra eller relaterade metaboliska produkter frigörs. Identifieringen av den specifika karboxylgruppen, som utfördes med hjälp av RP-HPLC, avslöjade förekomsten av en enda topp i odlingssupernatanten med en retentionstid som mest liknade myrsyra. Koncentrationen av den syra som produceras på olika kolkällor studerades som en funktion av tiden. Även om syran fanns i samma slutkoncentration var syraproduktionen högst i medium som kompletterades med sackaros följt av fruktos och glukos. Kunskapen om bakteriens metaboliska produkter kan betraktas som ett första steg mot att förverkliga dess potential för storskalig biologisk sanering av alkaliskt avloppsvatten från dryckesindustrin.
1. Introduktion
Alkalifiler – mikroorganismer som har pH-optima för tillväxt vid eller över pH 9 – har fått ett stort genomslag i industriella tillämpningar. Biologiska tvättmedel innehåller enzymer, t.ex. alkaliska cellulaser och/eller alkaliska proteaser, som har producerats från alkalifiler . Alkalifiler har också utnyttjats för industriell framställning av enzymer som kan vara av specifik användning, t.ex. cyklodextrin genom alkaliskt cyklomaltodextringlukanotransferas och alkaliskt aktivt maltohexaosbildande α-amylas som används inom livsmedels-, kemikalie- och läkemedelsindustrin. Det har rapporterats att alkalibehandlad trämassa kan blekas biologiskt med hjälp av xylanas som produceras av alkalifiler . Fujiwara och medarbetare har rapporterat om användningen av ett alkaliskt proteas för att bryta ner den gelatinösa beläggningen på röntgenfilmer, varifrån silver kunde återvinnas. Alkalifila bakterier har också visat sin potential för biologisk nedbrytning av en rad olika organiska föreningar .
Därmed har alkalifila bakterier rönt stort intresse på grund av deras extracellulära enzymer och biokemiska egenskaper som alkalifili och alkalistabilitet. Deras bioenergetik har också undersökts i viss detalj , medan man vet lite om deras fysiologi, t.ex. intracellulära enzymer och metaboliter. Egenskaperna hos den mellanliggande metaboliska processen är viktiga eftersom de bidrar till att karakterisera bakterien, dess enzymsammansättning, cellernas metaboliska stadium och möjligheterna till metabolisk ingenjörskonst. Alkalifilers förmåga att kraftigt fluktuera pH-värdet i ett kolhydratinnehållande medium utnyttjades i tidigare arbeten för att neutralisera starkt alkaliskt avloppsvatten från dryckesindustrin med hjälp av Exiguobacterium sp. stam 12/1 . Släktet Exiguobacterium tillhör ordningen Bacillales som även omfattar medlemmar av släktet Bacillus. Exiguobacterium sp. 12/1 är en fakultativ alkalifil som växer optimalt vid pH 10 och kan neutralisera alkaliskt avloppsvatten så att det sjunker från pH 12,0 till pH 7,5. Man antar att bakterien släpper ut en eller flera sura metaboliska produkter för att neutralisera det starkt alkaliska externa mediet. Det är dock viktigt att karakterisera vilken typ av metaboliter som släpps ut i det extracellulära mediet. Här studerar vi produktionen av organiska syror som en möjlig mekanism för alkalineutralisering. Sådana typer av studier kommer att vara nödvändiga innan storskaliga tillämpningar av bakterien för neutralisering av alkaliskt avloppsvatten från dryckesindustrin kan utvecklas.
Den viktigaste kolkällan i avloppsvatten från läskedrycksindustrin är sackaros (disackarid som innehåller glukos och fruktos), vilket också är den största bidragande faktorn till dess biokemiska syrebehov (BOD) . Det genomsnittliga BOD-värdet för avloppsvatten från läskedrycksindustrin varierar mellan 600 och 4 500 mg/L, vilket motsvarar 673-5052 ppm sackaros. En litteraturstudie av metaboliska produkter från ett stort antal bakterier som växer på enkla sockerarter tyder på att bakterierna kan använda dessa enkla sockerarter för att generera organiska syror. Detta bekräftas ytterligare av analysen av extracellulära metaboliska produkter från andra alkalifila Bacillus-arter. Den viktigaste organiska syra som producerades på kolkälla sackaros i dessa studier visade sig vara ättiksyra. Myrsyra är en vanlig metabolit hos neutrofila bakterier under anaeroba förhållanden, medan B. circulans var. alkalophilus producerar upp till 2 g/l av den även i aeroba kulturer. Andra flyktiga syror som propionsyra, smörsyra, isobutyrsyra och isovaleriska syror är typiska för stammarna Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus och Bacillus sp. 17-1. Isobutyrsyra och isovaleriska syror har rapporterats i medierna hos flera neutrofila baciller . Men dessa syror, liksom propion- och smörsyra, anses härröra från aminosyror baserat på studier på Clostridium sp. . Mjölk- och pyruvsyror produceras ganska ofta av neutrofila baciller , men produktion av bärnstenssyra av Bacillus är sällsynt . Etanol har inte påvisats i alkalifila baciller även om det är en typisk produkt från glukosodlingar av många neutrofila baciller . Alkaliska tillväxtförhållanden kan således påverka produktionen av neutrala metaboliter . I denna studie har vi använt högpresterande vätskekromatografi med omvänd fas för att studera typ och koncentration av syror som produceras av Exiguobacterium sp. stam 12/1 under neutralisering av medium med högt pH som innehåller olika typer av kolkällor.
2. Material och metoder
2.1. Stam och odlingsförhållanden
Exiguobacterium sp. 12/1-kulturen erhölls från DSMZ (DSM 21148) och bibehölls som glycerolförråd. Alkaliskt basmedium (ABM) innehållande (alla koncentrationer i g/L): pepton, 1; jästextrakt, 0,5; glukos, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (de tre sista komponenterna tillsattes till det autoklaverade mediet från separat steriliserade lösningar) användes för rutinmässig odling av stam 12/1 vid 37 °C. För IR- och RP-HPLC-analys odlades bakterien vid 37°C, 200 rpm i minimalt saltmedium (MSM) innehållande (alla koncentrationer i mM): K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; EDTA-dinatriumsalt, 0,3; ZnSO4-7H2O, 0,01; MnSO4, 0,02; CuSO4-5H2O, 0,004; FeSO4-7H2O, 0,1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 och 1 % (w/v) av en av följande kolhydrater: glukos, fruktos eller sackaros (alla komponenter tillsätts från separat autoklaverade koncentrerade stamlösningar). Mediets slutliga pH justerades till 10,5 med hjälp av 1 N NaOH.
2,2. Analys av tillväxt och kultur pH
1 mL logfaskultur på ABM användes för att inokulera förkulturer (50 mL) (MSM innehållande 1 % socker). Den egentliga testkulturen (250 mL MSM i 500 mL Erlenmeyerkolv) inokulerades med hela förkulturen i mitten av logfasen (O.D. ~ 1,2). Varje kulturuppsättning bestod av tre kolvar. Provernas absorbans vid 650 nm användes som mått på bakterietillväxten. pH-värdet bestämdes i cellfria kulturprover vid rumstemperatur efter centrifugering 4000 ×g i 20 minuter.
2.3. FT-IR-analys
Kulturen skördades efter 60 timmars tillväxt och centrifugerades vid 4000 ×g i 20 minuter. För IR-analysen frystorkades kulturens supernatant och krossades till pulverform. Den pulveriserade supernatanten blandades sedan med kaliumbromid och blandningen pressades till en tablett. Slutligen analyserades tabletten med hjälp av FT/IR-4200-spektrometern (JASCO, Tokyo, Japan).
2.4. RP-HPLC-analys
Kulturen skördades vid olika tidpunkter och centrifugerades vid 4000 ×g i 20 minuter. För HPLC-analys filtrerades kulturens supernatant genom ett 0,22 μm-filter och 10 μl av det filtrerade provet injicerades i HPLC-kolonnen.
Analytisk standardkvalitet av myrsyra, ättiksyra, bärnstenssyra, propionsyra, mjölksyra och isobutyrsyra erhölls från Sigma. Standardlösningar (100 mg/mL eller 100 μL/mL) framställdes och förvarades vid 4 °C för vidare användning. Arbetsstandardlösningar (10 mg/mL eller 10 μL/mL) framställdes dagligen. Milli-Q-vatten (Millipore) användes för att bereda buffert- och lagerlösningar av varje förening och prover. Stamlösningarna, proverna och bufferten filtrerades genom cellulosamembranfilter Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA). Lösningsmedlen avgasades under vakuum före användning.
Analysen av organiska syror gjordes enligt metoden av Tormo och Izco . Analysen utfördes på ett Breeze-system (Waters, Mildford, MA, USA) bestående av en 1525 binär HPLC-pump, en 717 plus autosampler och en 2487 tvåkanals UV-detektor inställd på 210 nm, som styrdes med hjälp av en Breeze-programvara. Separationen utfördes på en Atlantis dC18-kolonn (Waters) 250 × 4,6 × 5 μm. 20 mM NaH2PO4 justerat till pH 2,20 med fosforsyra förbereddes dagligen och filtrerades genom 0,2 μm hydrofila membran (Millipore). Lösningsmedelsprogrammet använde två behållare som innehöll 1 % acetonitril i 20 mM fosfatbuffert justerad till pH 2,20 med fosforsyra (lösningsmedel A) och acetonitril (lösningsmedel B); flödeshastigheten var inställd på 1,5 mL/min vid rumstemperatur. Gradientprogrammet inleddes med 100 % av lösningsmedel A och efter 7 minuter ökades lösningsmedel B linjärt för att nå 7 % på 5 minuter. Från 12 till 19 min hölls hastigheten på 93 % av lösningsmedel A och 7 % av lösningsmedel B. Därefter ändrades hastigheten till startförhållandena för att jämna ut kolonnen i 15 min innan 10 μl av nästa prov injicerades igen.
3. Resultat
3.1. Analys av neutralisering på definierat medium
Minimalsaltmedium valdes för analys av organisk syra producerad av bakterien på grund av dess definierade karaktär och liknande kolkälla som avloppsvatten från dryckesindustrin. Bakterien fick växa i minimalt saltmedium kompletterat med olika kolkällor glukos, fruktos och sackaros. Figur 1 visar mediets tillväxtprofil och pH-egenskaper med tiden. Fruktos och sackaros gav en mycket snabbare neutralisering av mediet jämfört med glukos. Det slutliga pH som erhölls med glukos var också något högre än det som erhölls i fallet med sackaros- och fruktostillskottsmedium. Detta återspeglas också i tillväxtprofilen hos bakterien som odlats på de tre kolkällorna. Bakterierna växte snabbare i sackaros följt av fruktos och glukos.
(a)
(b)
(a)
(b)
Variation i pH (a) och O.D. (b) med tiden på MSM. Värdena representerar medelvärdet av tre upprepade mätningar och felstaplarna representerar standardavvikelsen.
3.2. Identifiering av funktionell grupp som finns i odlingssupernatanten
För att identifiera den funktionella breda funktionella gruppen i den metabolit som produceras av bakterien för att neutralisera alkaliskt avloppsvatten, utsattes den frystorkade odlingssupernatanten för FT-IR-spektroskopi. Två toppar som motsvarar karbonylgruppen (vid 1644,98 cm-1) och hydroxylgruppen (vid 3436,74 cm-1) fanns i spektrumet (tabell 1). Enligt litteraturstudien producerar bakterien sannolikt organiska syror som en metabolisk produkt som neutraliserar det alkaliska avloppsvattnet.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.3. Identifiering av bakteriens specifika metaboliska produkt
För att identifiera den organiska syra som produceras av bakterien utfördes HPLC i omvänd fas med hjälp av kända standarder för organiska syror som valts ut efter en litteraturstudie. Standarderna kördes både individuellt (figur 2 a) och i en blandning (figur 2 b) för att fastställa eventuella skillnader i retentionstid på grund av interferens från andra organiska syror i mediet. RT för organiska standardsyror i de två fallen visade sig vara likartad med en skillnad i retentionstid som inte översteg 0,09 enheter utom för propionsyra (tabell 2). Odlingssupernatanten analyserades med samma metod och visade sig bestå av en enda topp med en retentionstid som liknar den för myrsyra. Detta bekräftades ytterligare genom att spetsa supernatanten med standardmyrsyra vars topp överlagrade den av produkten i supernatanten (figur 2 d).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
RP-HPLC-kromatogram för enskilda organiska standardsyror (a), organiska standardsyror i blandning (b), odlingssupernatant (c) och odlingssupernatant spetsad med myrsyra.
3.4. Kvantitativ analys av bakteriens metaboliska produkt
För den kvantitativa analysen av kultursupernatanten kördes olika standardkoncentrationer av myrsyra, och toppområdet som motsvarar varje koncentration beräknades. Topparean plottades mot koncentrationen för att erhålla en standardkurva (figur 3). Denna standardkurva användes för att beräkna mängden syra som produceras med tiden på minimalsaltmedium kompletterat med olika kolkällor. Bakteriens kultursupernatant analyserades på ett tidsberoende sätt och utsattes återigen för HPLC-analys i omvänd fas. Det konstaterades att toppen av huvudprodukten i bakteriekulturens supernatant ökar med tiden. Syrans retentionstid liknar den för myrsyra. Studien av myrsyra producerad med olika kolkällor som en funktion av tiden visas i figur 4. Den största mängden syra producerades när MSM kompletterades med sackaros följt av fruktos och glukos.
Standardkurva för bestämning av koncentrationen av myrsyra i kultursupernatanten.
Variation i mängden organisk syra som produceras med tiden på MSM som kompletteras med olika kolkällor. Värdena representerar medelvärdet av tre upprepade mätningar och felstaplarna representerar standardavvikelsen.
4. Diskussion
Den viktigaste kolkällan i avloppsvattnet från dryckesindustrin är sackaros . För analysen av den metaboliska produkt som produceras under neutraliseringen valdes därför ett väldefinierat minimalt saltmedium som innehåller sackaros och de två ingående monosackarid-sockren-glukos och fruktos. Tillväxtegenskaperna hos stam 12/1 på minimala saltmedier kompletterade med de tre kolkällorna visar en effektiv neutralisering samtidigt med tillväxten (figurerna 1(a) och 1(b)). Sänkningen av pH-värdet i tillväxtmediet beror nödvändigtvis antingen på bildandet av syror eller på avlägsnandet av baser .
Produktionen av syror är väldokumenterad när det gäller bakterier som odlas på enkla sockerarter. Ämnesomsättningsprodukterna hos vissa alkalifila medlemmar av släktet Bacillus har studerats . Den viktigaste organiska syra som producerades på kolkälla sackaros i dessa studier visade sig vara ättiksyra. Genomsekvenserna av alkalifila Bacillus-arter – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans och Bacillus clausii- stöder också denna observation eftersom alla dessa arter har en fungerande omvandlingsväg från pyruvat till acetat. Myrsyra är en vanlig metabolit hos neutrofila bakterier under anaeroba förhållanden, medan B. circulans var. alkalophilus producerar upp till 2 g/l av den även i aeroba kulturer. Andra flyktiga syror som propionsyra, smörsyra, isobutyrsyra och isovaleriska syror är typiska för stammarna Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus och Bacillus sp. 17-1. Isobutyrsyra och isovaleriska syror har rapporterats i medierna hos flera neutrofila bakterier . Men dessa syror, liksom propion- och smörsyra, anses härröra från aminosyror baserat på studier på Clostridium sp. . Mjölk- och pyruvsyror produceras ganska ofta av neutrofila baciller , men produktion av bärnstenssyra av Bacillus är sällsynt . Etanol har inte påvisats i alkalifila baciller även om det är en typisk produkt från glukosodlingar av många neutrofila baciller . Alkaliska tillväxtförhållanden kan således påverka produktionen av neutrala metaboliter.
De första studierna av metaboliska produkter hos Bacillus sp. har utförts med hjälp av titrimetriska metoder. Den ökade buffertkapaciteten hos bakteriekulturens supernatant vid pH 5, vilket är det typiska området för protonering av karboxylsyror, användes för att anta att mediet innehåller karboxylsyror. I den här studien har vi använt FT-IR-spektroskopi för att fastställa den funktionella gruppen hos de föreningar som finns i odlingssupernatanten. FT-IR-spektrografen visade toppar som är karakteristiska för karbonylgruppen (vid 1644,98 nm) och hydroxylgruppen (vid 3436,74 nm) (tabell 1), vilket tyder på förekomsten av en kemisk art som består av hydroxyl- och karbonylgruppen och som med största sannolikhet är en karboxylsyra.
HPLC-metoden med omvänd fas användes för att analysera de organiska syror som finns i odlingssupernatanten. HPLC-förhållandena valdes för bästa rapporterade upplösning, dvs. pH 2,2 och 1 % acetonitril. HPLC-metoden med omvänd fas är fördelaktig på grund av användningen av billigare kolonner, enklare manipulation av analysparametrarna för att optimera separationen och analyser vid rumstemperatur . Metoden användes först för att beräkna retentionstiden för syrastandarder som valts ut enligt litteraturstudien. Ordningen av syrornas eluering under dessa förhållanden var densamma som i Tormo och Izco , men det fanns en variation mellan de retentionstider som observerades i denna studie och de som rapporterades i Tormo och Izco . Denna variation kan tillskrivas skillnader i HPLC-förhållandena, t.ex. temperatur 25-30 °C i denna studie jämfört med 24 °C ± 1 °C som rapporterades i Tormo och Iczo .
RP-HPLC av odlingssupernatanten visar närvaron av en enda topp med absorbans vid 211 nm, vilket är den karakteristiska absorptionsvåglängden för organiska syror. Supernatanten innehåller således en enda kemisk art som sannolikt är en organisk syra. Jämförelsen av retentionstiden för denna topp med retentionstiden för organiska standardsyror visar att retentionstiden mest liknar myrsyra. Denna observation bekräftades ytterligare genom att tillsätta myrsyra i odlingssupernatanten, vilket ökar produktens toppyta (figurerna 2 c och 2 d). Förekomsten av myrsyra i odlingssupernatanten stämmer överens med de metaboliska produkterna hos vissa alkalifila medlemmar av släktet Bacillus och vissa sackarolytiska anaeroba alkalifila bakterier som Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum och Amphibacillus tropicus .
Den maximala minskningen av pH-enheter per tidsenhet som hittills rapporterats för alkalifila bakterier är 0,13 enheter per timme för Bacillus circulans var. alkalophilus, vilket är ganska lågt jämfört med den minskning på mer än två enheter under den första timmen av inokulering som rapporterats i denna studie. Den stora pH-sänkningen tyder på att det bildas sura katabolismprodukter. Enbart pH-sänkningshastigheten tyder dock inte på att koncentrationen av syror ökar. Därför utfördes kvantitativ analys av bakteriens metaboliska produkt med hjälp av RP-HPLC. HPLC föredrogs framför GC eftersom en jämförelse av GC- och HPLC-metoder för bestämning av organiska syror i kultursupernatanter från alkalofila bakterier tyder på att medan upplösningen av syror med GLC var utmärkt, var den kvantitativa reproducerbarheten med HPLC bättre än med GLC . Som förväntat visade det sig att koncentrationen av producerad syra ökade med ökad inkubationstid (figur 4). Mängden syra fortsatte faktiskt att öka långt efter det att det lägsta pH-värdet hade uppnåtts. Detta stämmer överens med tidigare studier av syraproduktion hos fakultativa och obligat alkalifila Bacillus sp. där syraproduktionen fortsatte att öka även 30 timmar efter det att det lägsta pH-värdet uppnåtts. Den jämförande analysen av den metaboliska produkt som producerades i medier som kompletterades med olika kolkällor visar att även om syra fanns i samma slutkoncentration var syraproduktionen högst i medier som kompletterades med sackaros följt av fruktos och glukos (figur 4). Detta stämmer överens med organismens tillväxtegenskaper i de medier som kompletterats med dessa sockerarter.
5. Slutsats
Exiguobacterium sp. stam 12/1 neutraliserar pH-värdet i det externa mediet genom produktion av kortkedjig organisk syra – myrsyra. Med tanke på den potentiella tillämpningen av storskalig biologisk sanering av alkaliskt avloppsvatten kan denna alkalineutraliseringsförmåga hos bakterien för avloppsvatten från dryckesindustrin betraktas som ett första steg mot utnyttjande av dess kommersialiseringspotential.
Ackord
N. M. Kulshreshtha erkänner University Grants Commission för forskningsstipendium. Författarna är oerhört tacksamma mot Council of Scientific and Industrial Research, Indien, för att ha tillhandahållit en R&D-plattform och faciliteter för denna forskning.