Modafinils effekter på beteende och parametrar för oxidativ skada i hjärnan hos Wistar-råttor
Abstract
Effekterna av modafinil (MD) på beteende och oxidativ skada på protein och lipid i hjärnan hos råttor utvärderades. Wistar-råttor fick en enda administrering genom gavage av vatten eller MD (75, 150 eller 300 mg/kg). Beteendeparametrar utvärderades i en öppen fältapparat 1, 2 och 3 timmar efter läkemedelsadministrationen. Tio-barbitursyre reaktiva substanser (TBARS) och proteinkarbonylbildning mättes i hjärnan. MD ökade den lokomotoriska aktiviteten vid den högsta dosen 1 och 3 timmar efter administrering. MD-administrering i dosen 300 mg/kg ökade besöken i centrum av öppet fält 1 timme efter administrering; 3 timmar efter administrering ökade dock alla administrerade MD-doser besöken i centrum av öppet fält. MD 300 mg/kg ökade lipidskador i amygdala, hippocampus och striatum. Dessutom ökade MD proteinskador i prefrontal cortex, amygdala och hippocampus; denna effekt varierar dock beroende på administrerad dos. Däremot minskade administrering av MD 75 och 300 mg/kg proteinskadan i striatum. Denna studie visade att MD-administration inducerar beteendeförändringar, som var beroende av den använda dosen. Dessutom verkade MD:s effekter på parametrar för oxidativ skada vara i specifika hjärnregioner och doser.
1. Introduktion
Modafinil (MD) är ett icke-amfetaminergt psykoaktivt läkemedel som ofta förskrivs för behandling av sömn, såsom narkolepsi, obstruktivt sömnapnésyndrom och sömnstörning vid skiftarbete . Dessutom är det väl beskrivet i litteraturen att MD förbättrar funktionen i ett antal kognitiva områden samt arbetsminne och episodiskt minne . Dessa effekter av MD på minnet har också beskrivits hos psykiatriska patienter, vilket tyder på att detta läkemedel är en utmärkt kandidat för behandling av kognitiv dysfunktion vid psykiatriska sjukdomar . Dessutom har klinisk forskning visat att MD förbättrar symtomen hos patienter med svår depression, bipolär sjukdom, schizofreni och ADHD (attention-deficit/hyperactivity disorder) .
Mekanismen för MD:s verkan är dåligt förstådd; det är dock känt att detta läkemedel har en viktig effekt på katekolaminer, serotonin, glutamat, gamma-aminosmörsyra, orexin och histaminsystem i hjärnan . Dessutom visar studier att MD hämmar dopamintransportören, vilket ökar den dopaminerga neurotransmissionen i vaksamhetskretsarna . Psykostimulantia som amfetamin, som också verkar på olika neurotransmittorsystem, har visat sig ha en uttalad effekt på beteendet, inklusive generering av rädsla, ångest och hyperaktivitet . MD är dock mindre relaterad till biverkningar som hyperaktivitet, ångest, nervositet eller rebound-effekter än de traditionella stimulantia .
Flera studier tyder på att administrering av psykostimulantia kan leda till oxidativ stress i råtthjärnan. Hjärnan är särskilt sårbar för produktion av reaktiva syrearter (ROS) eftersom den metaboliserar 20 % av kroppens totala syrehalt och har en begränsad mängd antioxidantkapacitet . Kronisk administrering av psykostimulerande medel som metylfenidat, m-amfetamin och d-amfetamin hos råttor ledde till ökad superoxidproduktion, oxidativa skador på protein, lipid och DNA samt förändringar i enzymernas antioxidanter och mitokondriernas andningskedjekomplex .
Syftet med denna studie var därför att utvärdera effekten av MD på beteende och parametrar för oxidativ stress i hippocampus, prefrontal cortex, amygdala och striatum hos råttor.
2. Experimentella metoder
2.1. Djur
Föremålen var vuxna manliga Wistar-råttor (vikt 250-350 g) från vår uppfödningskoloni. Djuren hölls som fem stycken i en bur med mat och vatten tillgängligt ad libitum och hölls i en 12 timmars ljus/mörkercykel (ljuset tändes klockan 7:00 på morgonen) vid en temperatur på °C. Alla experimentella förfaranden utfördes i enlighet med godkännandet från den lokala etiska kommittén för användning av djur vid Universidade do Extremo Sul Catarinense. Alla experiment utfördes vid samma tidpunkt under dagen för att undvika cirkadiska variationer.
2.2. Läkemedel och farmakologiska förfaranden
Den MD (Libbs Farmacêutica Ltda) hängdes upp i fordonet-fordonet: 1 % metylcellulosa i vatten. Lösningarna bereddes omedelbart före användning och skyddades från ljuset under försökstillfället. Den suspenderade lösningen var under omrörning under hela injektionsperioden. Kontrollgruppen fick fordonet.
2.3. Experimentell utformning
Det totala antalet råttor som användes i detta experiment var 40 ( djur per grupp). Djuren fick en engångsdos MD (75, 100 eller 300 mg/kg kroppsvikt) i en volym på 1 ml/kg, administrerad genom gavage. Kontrollgruppen fick en volym på 1 mL/kg av vätskan. Lokomotorisk aktivitet mättes 1, 2 och 3 timmar efter injektionen, och råttorna avlivades genom halshuggning direkt efter uppgiften på öppet fält.
2.4. Lokomotorisk aktivitet
Lokomotorisk aktivitet bedömdes med hjälp av öppenfältsuppgiften enligt tidigare beskrivning . Denna uppgift utfördes i ett 40 × 60 cm stort öppet fält omgivet av 50 cm höga väggar, tillverkade av brun plywood, med golvet indelat i 9 lika stora rutor med svarta linjer. Djuren placerades försiktigt på den vänstra bakre rektangeln och lämnades fria att utforska arenan i 5 minuter. I testet på det öppna fältet bedömdes följande beteendeparametrar:
Kryssningar (lokomotorisk aktivitet/horisontell aktivitet): det totala antalet rutor som råttorna korsade under hela testperioden räknades.
Rearings (utforskande aktivitet/vertikal aktivitet): råttornas totala upprätthållande hållning under hela testperioden räknades.
Besök i mitten av det öppna fältet: det totala antalet besök i mitten av det öppna fältet räknades. En centrumkvadrat på cm definierades som fältets ”centrala” område.
2.5. Mätning av markörer för oxidativa skador
Råttor behandlades med MD eller vatten enligt beskrivningen ovan och avlivades genom halshuggning 3 timmar efter den sista injektionen och deras hjärnor avlägsnades och dissekerades för utvärdering av nivåerna av oxidativa skador i prefrontal cortex, amygdala, hippocampus och striatum. TBARS och proteinkarbonylbildningar mättes enligt tidigare beskrivning .
2.6. Tiobarbiturinsyra reaktiva substanser (TBARS)
Bildningen av TBARS under en syra-uppvärmningsreaktion mättes som ett index för ROS-produktion, vilket i stor utsträckning har antagits som en känslig metod för mätning av lipidperoxidation, enligt tidigare beskrivning . I korthet blandades proverna med 1 mL triklorättiksyra 10 % (TCA) och 1 mL tiobarbitursyra 0,67 % (TBA) och värmdes sedan i ett kokande vattenbad i 15 minuter. TBARS bestämdes genom absorbans vid 535 nm. Resultaten uttrycks som MDA-ekvivalenter (malondialdehyd) (nmol/mg protein).
2.7. Mätning av proteinkarbonyls
Den oxidativa skadan på proteiner bedömdes genom bestämning av karbonylgrupper baserat på reaktion med dinitrofenylhydrazin (DNPH) enligt tidigare beskrivning . I korthet fälldes proteiner genom tillsats av 20 % triklorättiksyra och löstes på nytt i DNPH och absorbansen avlästes vid 370 nm.
2.8. Statistisk analys
Alla analyser utfördes med statistikpaketet för samhällsvetenskap version 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alla data presenteras som medelvärde ± SEM. Skillnader mellan grupper i beteendeanalysen verifierades med hjälp av variansanalys med upprepade åtgärder för att få tillgång till tidsresponskurvan, följt av Tukey’s post hoc-test. För att kontrollera skillnader mellan grupper i biokemisk analys använde vi ANOVA, följt av Tukey’s post hoc-test. I alla experiment ansågs värden < 0,05 indikera statistisk signifikans.
3. Resultat
3.1. Beteendeanalys
För analysen av lokomotion (korsningar) (figur 1(a)) visade variansanalysen med upprepade åtgärder signifikanta skillnader för MD-administrering (F(3,35) = 7,91, ) och för beteendeupprepningar (F(2,7) = 54,82, ). Ytterligare analys med Tukey’s post hoc-test visade att MD vid 300 mg/kg ökade råttans spontana lokomotion jämfört med kontrollgruppen en timme efter administrering. Dessutom uppvisade kontrollgruppen, MD vid 75 mg/kg och MD vid 150 mg/kg ett minskat antal korsningar när de 3 timmar senare återexponerades för det öppna fältet, vilket tyder på att de vänjer sig vid miljön. Råttor som behandlats med MD med 300 mg/kg uppvisade dock ett minskat antal korsningar när de åter exponerades 2 och 3 timmar senare för det öppna fältet. Denna skillnad kan förklaras av den motoriska hyperaktivitet som framkallades 1 timme efter administrering av MD i dosen 300 mg/kg.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
För analysen av utforskande (bakåtsträvande) (figur 1(b)) visade den upprepade variansanalysen på signifikanta skillnader för beteendeupprepningarna (F(2,7) = 32,7, ). Ytterligare analys med Tukey’s post hoc-test visade att kontrollgruppen, MD vid 75 mg/kg och MD vid 150 mg/kg uppvisade ett minskat antal rearings när de återexponerades 3 timmar senare till det öppna fältet. MD vid 300 mg/kg minskade antalet bakåtsträvanden när de åter exponerades 2 och 3 timmar senare för det öppna fältet.
För analysen av besök i mitten av det öppna fältet (figur 1(c)) visade variansanalysen med upprepade åtgärder att det fanns signifikanta skillnader för MD-administrationen (F(3,34) = 15,70, ). Ytterligare analys med Tukey’s post hoc-test visade att MD vid 300 mg/kg ökade besöken till mitten av det öppna fältet jämfört med kontroll 1 timme efter administrering. Dessutom ökade MD i alla administrerade doser besöken i mitten av det öppna fältet 3 timmar efter administrering.
3.2. Biokemisk analys
Som framgår av figur 2(a) ökade TBARS-nivåerna signifikant i amygdala (F(3) = 4,18, ), hippocampus (F(3) = 44,9, ) och striatum (F(3) = 7,07, ) hos råttor som behandlades med MD vid 300 mg/kg jämfört med kontrollgruppen.
(a)
(b)
(a)
(b)
Som kan observeras i figur 2(b) upptäcktes en signifikant ökning av karbonylgenerering efter administrering av MD i prefrontal cortex (F(3) = 29,9, ) vid dosen 300 mg/kg och i amygdala (F(3) = 9,74, ) och hippocampus (F(3) = 17,99, ) vid 75 mg/kg. Omvänt minskade behandling med MD vid 75 och 300 mg/kg signifikant karbonylgenerering i striatum (F(3) = 21,93, ) jämfört med kontrollgruppen.
4. Diskussion
I denna studie observerade vi att en enda injektion av MD i en hög dos (300 mg/kg) inducerar hyperlocomotion hos råttor, som inte kvarstår 2 och 3 timmar efter administrering. Enligt våra resultat ökade MD signifikant den lokomotoriska aktiviteten och ökade striatala extracellulära dopaminnivåer hos rhesusapor . Young och medarbetare visade att MD ökade aktiviteten, uppväxten och jämnheten hos lokomotoriska banor hos C57BL/6J- och 129/SJ-möss. Dessa beteendeförändringar orsakade av MD var relaterade till ökat synaptiskt dopamin och sekundära åtgärder som förmedlas av dopaminreceptorer drd1 och drd4. Till skillnad från ovanstående studie, även om det finns en trend, observerar vi inte någon signifikant ökning av det utforskande beteendet efter MD-administrering. Denna diskrepans kan förklaras av skillnader i metodik, art och behandlingstid.
Här observerade vi att kontrollgruppen och MD i låga doser (75 och 150 mg/kg) minskade antalet korsningar och bakåtsträvande när de återexponerades 3 timmar senare till det öppna fältet, vilket tyder på habituering till miljön. MD i hög dos (300 mg/kg) minskade antalet korsningar och uppväxter när de återexponerades 2 och 3 timmar senare för det öppna fältet. Denna diskrepans kan förklaras av att 1 timme efter administrering av MD (300 mg/kg) ökade antalet korsningar avsevärt och att det fanns en tendens att öka antalet bakåtsträvande. Habituering till en ny miljö anses vara en av de mest elementära formerna av icke-associativ inlärning. Upprepad exponering för samma miljö inducerar en minskning av det utforskande beteendet, vilket kan ses som ett index för habituering .
En intressant upptäckt i den aktuella studien var att MD modulerade ångestrelaterat beteende. I testet med öppet fält var MD-behandlade råttor mindre ängsliga och tenderade till och med att utforska det aversiva centrumområdet mer än kontrollerna. MD vid 300 mg/kg ökade antalet besök i centrum av det öppna fältet 1 timme efter administrering. Dessutom ökade MD i alla administrerade doser besöken i centrum av det öppna fältet 3 timmar efter administrering. I litteraturen är studierna kontroversiella när det gäller MD:s effekt på ångest. Prekliniska studier har visat antingen inga effekter av modafinil på ångest eller en anxiolytisk effekt . På samma sätt visar MD i de kliniska studierna antingen en anxiolytisk effekt eller ingen effekt på ångest , medan andra visar en anxiogen effekt . Denna skillnad mellan studierna kan förklaras av variationen i de använda doserna (100 mg, 200 mg eller 400 mg) och i doseringsschemat (engångsdosering kontra kronisk dosering under en vecka eller mer). De anxiolytiskt liknande effekterna av MD kan förklaras av dess effekter på amygdala, som är en hjärnregion som är involverad i ångest, vid hotfulla stimuli. En tidigare studie visade att MD minskar amygdala-reaktiviteten vid skrämmande stimuli . Det är känt att amygdala är rik på katekolaminerga och serotoninerga projektioner , och då minskar troligen MD amygdala reaktivitet genom förändringar i intra-amygdala signalering till följd av förändringar i noradrenalin-, dopamin-, serotonin- eller GABA-systemen eller från en kombination av dessa effekter.
Förutom att framkalla beteendeförändringar är det väl beskrivet i litteraturen att psykostimulerande medel orsakar oxidativ skada i både djurmodeller och hos människor . Våra resultat visar att MD ökar oxidativa skador på lipider och proteiner i hjärnan hos råttor. TBARS-nivåerna ökade i amygdala, hippocampus och striatum hos råttor som behandlats med MD i hög dos (300 mg/kg). Dessutom observerade vi en ökning av karbonylbildningen efter administrering av MD i den prefrontala cortexen vid dosen 300 mg/kg och i amygdala och hippocampus vid 75 mg/kg. Studier visar att MD hämmar dopamintransportören, vilket ökar den dopaminerga neurotransmissionen . Den ökning av den extracellulära dopaminkoncentrationen som MD framkallar kan framkalla överproduktion av den toxiska metaboliten dopaminoxidation , vilket leder till oxidativa skador på proteiner och lipider i hjärnan hos råttor. I litteraturen finns inga studier som bedömer hjärnskador efter administrering av MD; dessa studier är dock mycket viktiga med tanke på att tillgängligheten till MD, t.ex. som alerthetshöjande, minnesförbättrande och trötthetsdämpande läkemedel, för friska människor ökar .
Omvänt minskade behandling med MD (75 och 300 mg/kg) karbonylbildningen i striatum jämfört med kontrollgruppen. Vissa studier har visat MD:s striatala neuroprotektiva potential. Tidigare studier visar förbättrad överlevnad av 1-metyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinförgiftade dopaminerga neuroner i striatum efter MD-behandling, i en djurmodell av Parkinsons sjukdom . Raineri och medarbetare har visat att administrering av MD dämpade metamfetamininducerad neurotoxicitet i striatum hos möss, vilket tyder på en möjlig skyddande roll för MD i denna hjärnregion. MD har visat sig förbättra inlärningen hos metamfetaminberoende patienter . De resultat som presenteras här tyder på att MD-administration kan uppvisa antioxidativa egenskaper i striatum; MD:s skyddande effekt på striatum är dock fortfarande okänd. Striatum integrerar glutamatergiska inflöden från cortex och thalamus med dopaminerga afferenter från mellanhjärnan . Dopaminsignalering spelar en framträdande roll för striatalberoende inlärning och för synaptisk plasticitet hos de medelstinna projektionsneuronerna . Rossato och medarbetare visade att infusion av D1-receptoragonisten ökade nivåerna av BDNF (brain-derived neurotrophic factor) och därmed den synaptiska plasticiteten. Således kan MD främja synaptisk plasticitet genom att aktivera det dopaminerga systemet och följaktligen skydda striatum mot oxidativ skada.
Sammanfattningsvis kan vi visa att (1) MD inducerar hyperaktivitet vid hög dos (300 mg/kg) 1 timme efter administrering, som inte kvarstår 2 och 3 timmar efter administrering. (2) MD visade anxiolytiska effekter hos råttor och ökade antalet besök i centrum av det öppna fältet. (3) MD inducerade oxidativ skada på lipid och protein i råttans hjärna; den oxidativa skadan beror dock på den analyserade hjärnregionen och dosen MD som administrerats. (4) Slutligen kunde MD skydda striatum mot oxidativ skada på protein. Försiktighet måste iakttas vid tolkningen av resultaten. För det första mättes inte antioxidantförsvaret; eftersom detta är den första studien som undersöker MD:s inverkan på oxidativ stress, erkänner vi att det kunde ha hjälpt till att tolka resultaten. Men för det andra administrerades MD till friska råttor; effekterna av MD på den oxidativa skadan i djurmodeller av psykisk ohälsa kan visa andra resultat.
Intressekonflikter
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av denna artikel.
Acknowledgments
Laboratory of Neurosciences (Brasilien) är ett av centren för det nationella institutet för translationell medicin (INCT-TM) och en av medlemmarna i Center of Excellence in Applied Neurosciences of Santa Catarina (NENASC). Denna forskning stöddes av bidrag från CNPq, FAPESC, Instituto Cérebro e Mente och UNESC. João Quevedo är CNPq Research Fellow och Roger B. Varela, Wilson R. Resende och Amanda V. Steckert är innehavare av ett CAPES-studieresurs; Samira S. Valvassori är innehavare av CNPq-studieresurser.