I vila passerar cirka 5 till 8 liter luft in och ut ur lungan per minut hos människor. Luften kan variera i syre- och koldioxidkoncentration, kan bära med sig allergener och ger olika grad av mekanisk sträckning av luftvägarna och gasväxlingsytorna. Dessa signaler uppfattas, vidarebefordras och bearbetas till fysiologiska resultat, t.ex. kontroll av lungblodtryck, immunförsvar och andningsrytm, men mekanismen är oklar. Pulmonella neuroendokrina celler (PNEC) finns i ett stort antal organismer från fiskar till däggdjur (1). I däggdjurslungan är PNEC de enda innerverade epitelcellerna i luftvägarna och utgör mindre än 1 % av den totala epitelcellspopulationen i lungorna (2). Även om det in vitro har visat sig att PNEC:s är inblandade i syreavkänning, tonus i bronkiala och vaskulära glatta muskler och immunreaktioner (1, 3) har dessa roller inte påvisats in vivo. En nyligen genomförd studie visade att genetisk ablation av PNEC hos vuxna inte äventyrade homeostasen eller reparationen av luftvägarna, vilket gör att man kan ifrågasätta dessa cellers betydelse in vivo (4). PNEC-patologier, särskilt en ökning av antalet PNEC, har dokumenterats i ett stort antal lungsjukdomar, inklusive astma, bronkopulmonell dysplasi, cystisk fibros, kronisk obstruktiv lungsjukdom, medfödd diafragmabråck, neuroendokrin hyperplasi i spädbarnsåldern, plötslig spädbarnsdöd och pulmonell hypertoni (5-8). I varje fall förblir det oklart om PNEC-ökningen är en orsak till eller en konsekvens av symtomen.

I muslungor finns de flesta PNEC i kluster av ~3 till 20 celler som kallas neuroepiteliala kroppar (NEB) (3, 9). Både solitära och klustrade PNEC innehåller täta vesiklar i kärnan som är fyllda med bioaktiva neuropeptider som kalcitonin genrelaterad peptid (CGRP) eller aminer som serotonin (1). Dessa frisätts som svar på stimuli, t.ex. förändringar i syrehalten. Neuropeptider och aminer har involverats i vissa av samma processer som PNEC (10-12), vilket ger upphov till möjligheten att de kan förmedla PNEC-funktionen. Ett orsakssamband har dock inte påvisats in vivo.

Vi inledde den aktuella studien för att avslöja de mekanismer som ligger till grund för kongenitalt diafragmatiskt bråck (CDH), ett födelsefel som är förknippat med avsevärd lungdysfunktion, bland annat ett förhöjt immunförsvar och pulmonell hypertension (13). I en genetisk musmodell av CDH upptäckte vi en defekt i form av misslyckad klustring av PNEC. Detta följs av en sekvens av händelser: en ökning av PNEC-neuropeptider, en ökning av immuninfiltrat och remodellering av lungstrukturen. Dessa resultat ger en in vivo-demonstration av PNEC-funktionen. Eftersom förändringar i antalet PNEC och tillhörande neuropeptider har dokumenterats i många lungsjukdomar, har våra resultat stora implikationer utöver CDH.

I människor har mutationer i Roundabout receptor (ROBO)-gener associerats med CDH (13, 14). För att studera lungdefekter i samband med CDH inaktiverade vi både Robo1 och Robo2 i endodermderivat epitel, inklusive lungan, med hjälp av Shhcre (hädanefter Shhcre;Robo-mutant) hos möss (15, 16). Även om dessa mutanter överlever uppvisar de minskad gasutbytesyta med början vid postnatal dag (P) 15 (fig. 1, A och B, och fig. S1). Vi utförde mikroarray följt av kvantitativ omvänd transkriptas-polymeraskedjereaktion (qRT-PCR) vid P7, före minskningen av gasutbytesytan. Femton av de 20 mest differentiellt uttryckta generna har varit inblandade i immunsvar, och alla är signifikant ökade, inklusive Ccl3, Cxcl2, Tnfa och Saa3 (fig. 1C). I överensstämmelse med denna signatur observerade vi ett förhöjt antal immunceller, inklusive neutrofiler, eosinofiler, makrofager och T-celler (fig. 1, D och E, och fig. S2). Dessutom finns det en ökning av andelen M2-makrofager och en minskning av andelen M1-makrofager (fig. S3). Dessa fynd tyder på att Shhcre;Robo-mutanter uppvisar förhöjd immunkänslighet, vilket efterliknar en vanlig CDH-komorbiditet (13).

Och även om Robo uttrycks i den alveolära regionen av lungmesenkymet (fig. S4) är dess uttryck i epitelet begränsat till sällsynta celler längs luftvägarna (fig. 1F). Kolmärkning med CGRP-antikropp visade att Robo-uttryckande epitelceller är PNECs (fig. 1G). För att bekräfta att Robo-gener krävs inom PNEC för funktion, inaktiverade vi Robo med hjälp av Ascl1creERT2 (17), en knock-in cre-drivrutin som ger PNEC-specifik aktivitet i lungepitelet (fig. S5). Vi fann att Ascl1creERT2;Robo-mutanter uppvisade både alveolär förenkling och makrofagökning, vilket återger Shhcre;Robo-fenotyperna (fig. S6). Dessa resultat visar tillsammans att Robo krävs specifikt i PNEC för att begränsa antalet immunceller och förhindra alveolär förenkling.

Vid embryonal dag (E) 13,5 var nyss specificerade PNEC solitära celler i både kontroll- och Shhcre;Robo-muterade lungor (fig. 2, A och B). Vid E15,5 hade en majoritet av PNECs aggregerats till NEBs i kontroll. PNEC:erna var dock inte grupperade i Shhcre;Robo-mutanter (fig. 2, C och D). Denna mycket penetrerande fenotyp kvarstod i postnatala lungor (fig. 2, E och F, och fig. S7). Det totala antalet PNEC-celler verkar opåverkat, vilket stöds av normalt uttryck av Ascl1 och andra PNEC-markörer (fig. S8). Oklusterade celler i mutanten förlorar sin kilform och är mer rundade (fig. S7 och S9). I motsats till kontrollerna, där solitära PNEC inte är innerverade (9), är dessutom ~33,3 % (31 av 93 celler) av oklusterade PNEC innerverade i mutanten (fig. 2F och fig. S9), vilket tyder på att PNEC-innervation inte är beroende av klusterbildning eller av Robo-funktionen i PNECs.

Ascl1creERT2;Robo-mutanter uppvisar också PNEC-unclustering (fig. S10). Denna fenotyp manifesterades även när Robo-inaktivering inducerades postnatalt, vilket sker efter NEB-bildningen. Tillsammans fastställer våra resultat att Robo krävs för PNEC-bildning och underhåll i NEBs.

Robo kan fungera antingen beroende eller oberoende av sin ligand, Slit (18). Analys av Slit-mutanter visar att medan PNEC-klusterbildning inte påverkas i någon av de enskilda mutanterna är den reducerad i Slit1;3-mutanter (fig. S11, A till D). Detta resultat tyder på att Robos funktion i denna process sannolikt är ligandberoende.

Slit och Robo fungerar främst för att förmedla cellulär repulsion och sällan attraktion (19). För att avgöra om Slit fungerar som en repellerande eller attraherande signal för Robo-uttryckande PNECs fastställde vi först var Slit-gener uttrycks. Kombinerad Slit1;2-GFP (grönt fluorescerande protein)-reporter avslöjade uttryck i endast cirka 1-3 PNECs inom stora NEBs, vilket ger upphov till möjligheten att de Slit1/2-uttryckande cellerna kan vara kärncellerna i klustret (fig. S11E). Detta tyder också på PNEC-subspecialisering inom ett kluster. Slit3-uttrycket är begränsat till det vaskulära glattmuskelcellskiktet som omger artärer, vilket löper längs huvudbronkerna där de flesta NEB:er finns (fig. S11, F och G). Tillsammans gav den nära närheten mellan Slit-uttryckande celler och Robo-uttryckande PNECs upphov till möjligheten att Slit-ligander kan utgöra en attraktiv ledtråd för PNECs.

För att testa detta såddes flödescytometrisorterade GAD1-GFP+ PNECs i den översta kammaren i en Boyden-cellmigrationsodlingsinsats. När Slit-protein tillsattes tillsammans med cellerna i den övre kammaren migrerade ~52 % färre (P = 8,5 × 10-4) PNECs till den nedre kammaren (fig. S12, J till I). Omvänt, när Slit-protein tillsattes till den nedre kammaren migrerade 18 % fler (P = 7,5 × 10-5) PNECs till botten (fig. S11, L till N). Dessa resultat tyder på att Slit-Robo driver PNEC-klustring till NEBs, troligen genom cellulär attraktion.

För att testa en möjlig koppling mellan PNECs och immunsvar testade vi uttrycket av neuropeptider som produceras av PNECs (1). Av de nio neuropeptidgener som undersöktes var fem signifikant uppreglerade i Shhcre;Robo-mutanter (fig. 3A). Färgning med antikropp mot CGRP visade att även om dess uttryck kvarstår i PNEC i mutanten, är färgningsintensiteten ökad och den är inte längre begränsad till den basala sidan av dessa celler (fig. S7 och S9). Vi noterar också att även om unclustering inträffade vid E15,5, observeras uppreglering av neuropeptider först efter födseln, förmodligen vid exponering för luft (fig. S12).

För att avgöra om ökningen av neuropeptider bidrar till immunsvaret fokuserade vi på CGRP eftersom dess transkript uppvisar den största ökningen av alla som analyserats (fig. 3A). Vi motverkade denna ökning genom att föda upp en mutantallel av Cgrp i Shhcre;Robo-bakgrunden (20). I Robo-kontroller förändrade förlusten av Cgrp inte antalet makrofager (fig. 3, B, D och F). I Shhcre;Robo-mutanter minskade dock förlusten av Cgrp signifikant antalet makrofager på ett dosberoende sätt (fig. 3, C, E och F). Vi fann också att förlust av Cgrp delvis vände den alveolära förenklingsfenotypen (fig. S13). Vi noterar att varken makrofagökning eller alveolär förenkling förhindrades helt och hållet, vilket tyder på att ökningen av andra neuropeptider kan bidra till nedströmsresultat. Tillsammans ger dessa resultat genetiska demonstrationer in vivo av att neuropeptider förmedlar PNEC-funktionen.

Då den normala alveologenesen inleds vid P4 (21), tyder det sena uppträdandet av alveolär förenkling vid P15 på att störning av alveologenesen kanske inte är en primär orsak. Även om ingen förändring av celldöd observerades vid P10 fanns det en tydlig minskning av elastin (fig. S14), vilket är en möjlig utlösande faktor för förenkling (22). Immunceller som makrofager uttrycker matrixmetalloproteinaser som bryter ner elastin (23). Dessutom observeras ökningen av makrofager före förenkling (fig. S1 och S2), vilket ökar möjligheten till ett orsakssamband. För att testa detta behandlade vi Shhcre;Robo och kontrolllungor med klodronat, ett hydrofilt läkemedel som utplånar makrofager (24). Behandling med början vid P5, före ökningen av immunceller, begränsade effektivt antalet alveolära makrofager till basnivå hos Shhcre;Robo-mutanter (fig. 4, A till E). Detta dämpade minskningen av elastin och förhindrade helt och hållet förenkling (fig. 4, F till J, och fig. S15). Tillsammans erbjuder dessa data in vivo demonstration av att ökade immuninfiltrat är ansvariga för alveolär förenkling och att båda är nedströms konsekvenser av PNEC-dysfunktion.

I den här studien presenterar vi genetiska bevis in vivo som visar att PNECs, trots att de är sällsynta, har en djupgående påverkan på postnatal lungfunktion. Även om PNEC-defekten är uppenbar redan vid E15,5 i Shhcre;Robo-mutanten, inleds de fysiologiska resultaten, som börjar med uppreglering av neuropeptider, efter födseln. Detta tyder på att effekten av PNEC är beroende av lungornas exponering för luft. Våra resultat beskriver således ett sätt för signaltransduktion där PNEC är känsliga reostater på luftvägsväggen som översätter miljömässiga signaler icke-cell-autonomt till immunsvar.

Våra resultat fastställer Robo1,2 som en uppsättning gener som kontrollerar PNEC-klustring till NEB. Det presenterar också Slit och Robo som aktörer i selektiv cellsortering i epitelet i ett däggdjursorgan. Inaktivering av Robo efter bildandet av NEB ledde också till att klusterbildningen upphörde, vilket tyder på att klustren upprätthålls aktivt. Även om Slit-Robo till stor del är kända för att förmedla cellulär avstötning tyder våra data på att de driver PNEC-klusterbildning genom cellulär attraktion. Robo-inaktivering ledde till förändrad innervation och förlust av basalbiaserad lokalisering av neuropeptider. Dessa förändringar kan ligga till grund för PNEC:s förändrade effekt nedströms.

En ökning av antalet PNEC har dokumenterats i ett stort antal lungassocierade sjukdomar, allt från sällsynta sjukdomar som CDH till vanliga tillstånd som astma (5-8). Vi noterar att Robo-mutantens PNEC-fenotyp skiljer sig från det ökade antalet PNEC. Båda är dock förknippade med en ökning av neuropeptider, som vi visar är potenta effektorer av PNEC-funktionen. Våra resultat förutsäger därmed att de dokumenterade PNEC-patologierna och ökningarna av neuropeptiderna snarare än att vara en passiv avläsning av sjukdomen kan fungera som aktiva bidragande orsaker till symtomen i ett stort antal luftvägssjukdomar.

.