Genomsekvensering, sammansättning och annotering

Vi har sekvenserat O. sinensis från Nyingchi-distriktet i Tibet, Kina. Vi utförde en WGS-analys med nästa generations sekvenseringsplattformarna Roche 454 och Illumina HiSeq 2000. Detta genererade rena sekvensdatamängder på ~5,4 Gb, vilket gav ungefär 45,1-faldig genomtäckning respektive (kompletterande tabell S1). Vi uppskattade att genomstorleken är ~124,08 Mb och ~119,8 Mb baserat på flödescytometri och 17-mer-djupfördelning av sekvenserade läsningar, respektive (kompletterande figurer S1-2 och kompletterande tabell S2). O. sinensis-genomet sattes först samman från Roche 454 long reads med hjälp av Newbler16 , följt av scaffolding av förmonterade contigs med Illumina mate pair sequencing reads med hjälp av SSPACE17. Detta gav slutligen en genomsamling på ~116,4 Mb som täcker ~97 % av den uppskattade genomstorleken och innehåller 156 scaffolds (>2 Kb) med ett ScafN50-värde på ~3 Mb och 9 141 contigs (N50 = 21 423 bp) (tabell 1 och de kompletterande tabellerna S3-4). För att validera kvaliteten på genomsammansättningen anpassade vi först allt DNA och alla uttryckta sekvenstaggar (ESTs) av O. sinensis som finns tillgängliga i de offentliga databaserna och fick kartläggningsfrekvenser på 98,85 % respektive 95,33 % (kompletterande tabell S5). För det andra mappade vi alla rena Roche 454 long reads (~1,84 Gb) till de sammansatta genomsekvenserna och visade en nästan perfekt anpassning med en mappningsgrad på 99,01 % (kompletterande tabell S5). För det tredje visade de transkript vi samlade en god anpassning till det samlade genomet; av 11 742 transkript kartlades 91,29 % (transkripttäckning ≥80 % och identitet ≥90 %; kompletterande tabell S5). Slutligen utvärderade vi fullständigheten hos vår O. sinensis-samling med hjälp av BUSCO18. 94,0 %, 4,0 % och 1,8 % av de 1 315 förväntade Ascomycota BUSCO-konserverade generna identifierades som kompletta, fragmenterade respektive saknade i vår O. sinensis-samling (kompletterande tabell S5).

Vi genererade ~15,05 Gb RNA-sekvenseringsdata (RNA-Seq) som erhållits från sammanlagt sex bibliotek som representerar de tre viktigaste utvecklingsstadierna för att hjälpa till med genprediktion (kompletterande figur S4 och kompletterande tabeller S6,7). I kombination med ab initio-prediktion, protein- och EST-anpassningar, EvidenceModeler-kamning och ytterligare filtrering definierade vi 7 939 proteinkodande gener (tabell 1 och kompletterande tabell S8). Av dessa predikterade gener kunde ungefär 97,0 % och 71,51 % klassificeras funktionellt och stödjas av RNA-Seq-data, respektive (kompletterande tabeller S9-11). Med hjälp av BUSCO från Ascomycota-linjen fann vi vidare att 94,4 %, 3,6 %, 1,8 % och 0,2 % av generna var kompletta, fragmenterade, saknade och duplicerade, vilket tyder på en god kvalitet på vår genannotation (kompletterande tabell S11). Vi utförde också homologsökningar och annoterade gener för icke-kodande RNA (ncRNA), vilket gav 146 gener för transfer-RNA (tRNA), 33 gener för ribosomalt RNA (rRNA), 70 gener för små nukleära RNA (snoRNA) och 15 gener för små nukleära RNA (snRNA) (kompletterande figur S6 och kompletterande tabell S12). Annoteringen av upprepade sekvenser presenterade att transposabla element (TE) stod för cirka 74,67 % av det sammansatta genomet och 80,07 % av de råa läsningarna, vilket tyder på att ~5,45 % av det icke sammansatta genomet består av TE (kompletterande tabeller S13-14). GC-innehållet var 43,09 % i hela genomet och 61,49 % i kodande sekvenser (kompletterande figur S3; kompletterande tabeller S4 och S8). Vi annoterade 8 918 enkla sekvensrepetitioner som kommer att ge värdefulla genetiska markörer för att hjälpa framtida förädlingsprogram för kinesisk larvsvamp (kompletterande tabeller S15-16 och kompletterande figur S7).

Retrotransposon-driven genomexpansion och massiv borttagning av icke-kollinjära gener

En jämförelse av genomstorlekar visade att O. sinensis genom var nästan 3,4 gånger större än andra entomopatogena svampar i Hypocreales-familjen (Supplemental Table S17 och Supplemental Figure S8A). Upprepningssekvensanalys visade att denna expansion främst berodde på en snabb spridning av transposerbara element. Ungefär 74,67 % av O. sinensis genomsamling bestod av upprepade sekvenser (kompletterande tabeller S13-14), vilket är exceptionellt större än de som rapporterats i Metarhizium anisopliae (~0,98 %)19, Metarhizium acridum (~1,52 %)19, Cordyceps militaris (~3,04 %)20 och Beauveria bassiana (~2,03 %)21 (P < 4,822e-07) (kompletterande figur S8B). MULE-elementen var framför allt de mest förekommande och stod för ~1,6 % (~1,9 Mb) av O. sinensis-genomet och mer än 59 % av DNA-transposonerna i O. sinensis. Retrotransposoner, mestadels LTR-retrotransposoner (long-terminal repeat), utgjorde ~59,76 % av O. sinensis-genomet och storskalig spridning av dessa skedde ungefär för ~38 miljoner år sedan (MYA) (Supplemental Figure S9).

I kontrast till den snabba amplifieringen av LTR retrotransposoner som driver expansionen av O. sinensis genom är ett annat anmärkningsvärt drag den dramatiska förlusten av proteinkodande gener i O. sinensis-linjen i jämförelse med andra entomopatogena svampar. Jämfört med totalt 7 939 proteinkodande gener i O. sinensis fanns det i genomsnitt mer än 10 095 gener i andra entomopatogena svampar, t.ex. Metarhizium anisopliae (10 582)19, Metarhizium acridum (9 849)19, Cordyceps militaris (9 684)20, Beauveria bassiana (10 366)21 och Tolypocladium inflatum (9 998)22 (tabell 1). En sådan minskning av antalet gener framgår också av identifieringen av icke-kollinjära gener och den jämförande analysen av syntesblock mellan genomerna av O. sinensis och C. militaris. Vi identifierade sammanlagt 308 syntetblock som sträcker sig över nästan 72,7 % (~23,4 Mb i C. militaris jämfört med ~43,5 Mb i O. sinensis) av C. militaris-genomet (Fig. 1A; Supplemental Figure S10 och Supplemental Tables S18-19). Av dessa synteniska genomiska regioner fanns det en minskning av icke-kollinjära gener i O. sinensis (2 127) jämfört med C. militaris (3 259) men en ökning av upprepade sekvenser (23,8 Mb i O. sinensis jämfört med 0,40 Mb i C. militaris) (fig. 1B och kompletterande tabell S19). Funktionell annotering av de 2 468 gener som gick förlorade i O. sinensis visade att de huvudsakligen var involverade i aminosyrametabolism, såsom biosyntes av aminosyror (ko01230), arginin- och prolinmetabolism (ko00330) och tyrosinmetabolism (ko00350) (kompletterande figur S11 och kompletterande tabell S20). Noterbart är att nästan 81 % av upprepningssekvenserna i dessa 308 synteniska block var LTR retrotransposoner, varav 40,4 % var Gypsy retroelement (fig. 1B och kompletterande tabell S19). Molekylär datering uppskattade att denna speciella klass av LTR retrotransposoner amplifierades ~38 Mya, vilket stämmer överens med upphöjningen av Qinghai-Tibetanska högplatån (Fig. 1C).

Snabb evolution av genfamiljer som är relaterade till svampens patogenitet

Ett av de mest slående kännetecknen hos genomet hos O. sinensis är bristen på mycket homologa genpar. Av de förutspådda 7 939 proteinkodande generna delade inga par >90% aminosyraidentitet i kodande sekvenser och det fanns bara ett par som delade >80% aminosyraidentitet (Fig. 2A och Supplemental Table S21). Denna egenskap observerades också hos den närbesläktade C. militaris och ektomykorrhizasvampen Tuber melanosporum 23. Jämfört med andra entomopatogena svampar som B. bassiana och C. militaris var multigenfamiljerna i O. sinensis begränsade i antal och utgjorde endast 8,7 % av det förutsagda proteomet; de flesta genfamiljerna hade endast två medlemmar (kompletterande figur S12). Hastigheten för gentillväxt var påfallande lägre än den för genförlust, och bland de 7 800 genfamiljer som hittades i Hypocreales senaste gemensamma förfader (MRCA) tycktes 1 756 ha försvunnit i O. sinensis (Fig. 2B). Ett sådant kompakt genkodningsutrymme i O. sinensis-genomet antyder karaktären hos denna högt specialiserade svamp med en låg kapacitet att anpassa sig till flera miljösignaler.

För att förstå evolutionen av genfamiljer som är relaterade till svampens patogenicitet och höglandsanpassning till tuffa miljöer undersökte vi de funktionella egenskaperna hos genfamiljer som har genomgått expansioner eller sammandragningar hos O. sinensis. O. sinensis-genomet uppvisade en betydande expansion av genfamiljer som huvudsakligen är involverade i svamppatogenitet, inklusive peroxidasaktivitet (PF01328; P < 0.01), serinhydrolas (PF03959; P < 0,01), deuterolysinmetalloproteas (M35) peptidas (PF02102; P < 0,01) och cytokrom P450 (PF00067; P < 0,01) (kompletterande tabell S23). Intressant nog fann vi att de utökade genfamiljerna också är funktionellt berikade i Pfam-kategorin glukos-metanol-kolin (GMC) oxidoreduktas som är involverat i ecdysteroidmetabolismen vid ruggning hos insekter (Supplemental Table S23). Vid jämförelser med andra entomopatogena svampar observerades också genfamiljsexpansionen i O. sinensis-linjen med överrepresentation av Pfam-termer som antas vara relaterade till anpassning till låg temperatur (PF06772; P < 0,01) (kompletterande tabell S23).

Däremot var genfamiljer som uppvisade kontraktionsstatus huvudsakligen involverade i transportprocessen och energimetabolismen, såsom ABC-transportörer (PF00005; P < 0,01), aminosyrapermeas (PF00324; P < 0,01) och ATP-syntas (PF00306; P < 0,05) (kompletterande tabell S24). Bortsett från den dynamiska utvecklingen av dessa genfamiljer upptäckte vi dessutom 1 077 (~13,57 %) artspecifika gener i O. sinensis (fig. 2C). Av dem kunde 318 (~29,53 %) gener annoteras funktionellt och var signifikant anrikade i GO-kategorier associerade med stärkelsebindning (GO: 2001070; P < 0,01), patogenes (GO: 0009405; P < 0,01), patogenes (GO: 0009405; P < 0.01) och katabolisk process för cellväggsmakromolekyler (GO: 0016998; P < 0,01) (Supplemental Table S25) (Supplemental Table S25).

För att undvika infektion av svamppatogener producerar insektsvärdar ofta snabbt rikligt med reaktiva syrearter (ROS) för att direkt döda patogener. Som ett svar utvecklade patogenerna ROS-antioxidationsförsvarssystemet under evolutionen, där peroxidaser, som agerar som ROS-avskiljande enzymer, anses vara en av de mest framträdande och integrerade komponenterna24, 25. Bland de utökade generna i O. sinensis var peroxidasaktivitet en av de starkt berikade funktionella kategorierna (kompletterande tabell S23). Sökningar med dolda Markovmodeller (HMM) avslöjade 42 (~0,53 %) peroxidasgener i O. sinensis, vars antal var anmärkningsvärt större än i C. militaris (28) och jäst (21), vilket tyder på att en dubbelt så stor expansion av peroxidasgener potentiellt skulle kunna resultera i en stark kapacitet att hjälpa till med ROS-avgiftning i O. sinensis (Fig. 3A och kompletterande tabell S26). Bland dessa 42 peroxidasgener är haloperoxidas (haem) den vanligaste och står för ~16,67 % av de totala peroxidaserna som upptäcktes (fig. 3B). I motsats till andra närbesläktade svamparter som helt saknar det typiska 2-cysteinperoxiredoxinet har O. sinensis fortfarande kvar en kopia (fig. 3B). 2-Cys-peroxiredoxin har tidigare visats spela en roll för att reagera på olika nivåer av oxidativ stress i Vibrio vulnificus 26. En jämförande analys visade att den bevarade genen i O. sinensis tillhör Prx1-typen, som rapporterats vara funktionellt konserverad27 och uttrycks endast när cellerna utsätts för höga nivåer av H2O2 som genereras exogent26.

I motsats till infektionsmekanismen hos växtpatogener (PPs), som kräver kolhydrataktiva enzymer (CAZymes) för att bryta ned den komplexa växtcellväggen28, infekterar insektspatogener (IPs) vanligen sina värdar genom att penetrera kutikeln29. För att testa detta jämförde vi O. sinensis och fyra andra insektspatogener (M. anisopliae, M. acridum, C. militaris och B. bassiana) med de fyra växtpatogenerna (Fusarium graminearum, Magnaporthe grisea, Grosmannia clavigera och Botrytis cinerea) (kompletterande tabell S17). Våra resultat visade att insektspatogener hade fler proteaser (i genomsnitt 362 i IPs jämfört med 342 i PPs; P < 0,43) och proteinkinaser (i genomsnitt 151 i IPs jämfört med 119 i PPs; P < 0,0014) för att bryta ned insektskultikan jämfört med växtpatogener (kompletterande tabeller S27-29). Däremot hade växtpatogener fler CAZymes än insektspatogener för nedbrytning av växtcellväggar (i genomsnitt 161 i IPs jämfört med 231 i PPs) (kompletterande tabeller S30-32) (Supplemental Tables S30-32). Om man bortser från växtpatogener har O. sinensis anmärkningsvärt nog färre gener som kodar för proteaser (260) än andra insektspatogener, t.ex. M. anisopliae (437), M. acridum (361), C. militaris (355) och B. bassiana (396). Dock innehåller ~35 % av dessa proteaser som karakteriserats i O. sinensis en signalpeptid som med större sannolikhet har varit involverad i interaktioner mellan patogen och värd (kompletterande tabeller S10 och S34), vilket är större än hos andra entomopatogena svampar (i genomsnitt 20 %). I likhet med de andra insektspatogenerna minskade också flera cellulasfamiljer, inklusive GH7, GH45 och GH51, eller saknades i O. sinensis (Supplemental Table S30).

Vi undersökte också genuttrycksprofiler över de tre utvecklingsstadierna hos O. sinensis med längdförhållanden mellan svamp och insekt som nådde upp till ~1,20×, ~1,75× och ~2,20×. Resultaten visar att totalt 411 gener var differentiellt uttryckta (DEG) mellan de tre utvecklingsstadierna (Supplemental Figure S14). Funktionell annotering av dessa 411 DEG:er visade att de huvudsakligen var involverade i svampens patogenicitet, t.ex. glykosylhydrolaser familj 16 (PF00722; FDR < 0,01), cytokrom P450 (PF00067; FDR < 0,01) och major facilitator superfamily (PF07690; FDR < 0,05). Dessutom var gener som kodar för enzymer som är associerade med mitokondriell andningskedja också funktionellt anrikade, såsom NAD-beroende epimeras/dehydratasfamilj (PF01370; FDR < 0,01) och BCS1 N-terminal domain (PF08740; FDR < 0,01) (kompletterande tabell S33).

Positivt darwinistiskt urval tjänar som drivkrafter för svampens patogenicitet

Positivt urval har utan tvekan spelat en avgörande roll för evolutionen av olika organismer som lever i höghöjdsmiljöer på Qinghai-Tibetanska högplatån, och många av de fenotypiska egenskaperna uppvisar sannolikt sådana urvalssignaturer3,4,5. Av de 1 499 ortologer med hög konfidens som delas mellan O. sinensis och de andra 12 svamparterna, identifierades 163 positivt selekterade gener (PSG) i O. sinensis med hjälp av likelihood ratio-testet (LRT; P < 0,05) på grenplatsen (Supplemental Table S35). Av dem har en gen (OSIN3929; här benämnd OsPRX1) varit funktionellt involverad i peroxidasaktivitet (fig. 3C). Denna gen är en medlem av peroxiredoxinfamiljen med 1-cystein och mycket homolog till PRX1 (YBL064C) i S. cerevisiae 30. PRX1-gener i S. cerevisiae och två humanpatogena svampar, A. fumigatus och C. albicans, är funktionellt konserverade och krävs för avgiftning av oxidationsstöten i värdcellerna31, 32. Särskilt borttagning av PRX1 i den välkända rispatogenen Magnaporthe oryzae resulterade i en nästan fullständig förlust av patogenitet, vilket tyder på att detta peroxidas är nyckeln till växelverkan mellan värd och patogen27. Det är slående att flera gener som är involverade i värd-patogeninteraktioner, inklusive peroxisomal biogenes, proteinkinas och metallopeptidaser, också upptäcktes vara under positivt urval (fig. 3C).

Parningssystemets evolution

I ascomycetösa svampar styrs parningssystemet vanligen av lokus för parningstypen (MAT)33. Vår analys av genomsekvensering visade att O. sinensis inte bara hade MAT1-2-1 parningstypsgenen inom MAT1-2 idiomorfen utan också tre parningstypsgener (dvs. MAT1-1-1, MAT1-1-1, MAT1-1-2 och MAT1-1-3) inom MAT1-1 idiomorfen (Supplemental Figure S15B). Denna egenskap verifierades med hjälp av omsekvensering av hela arvsmassan av 31 naturliga populationer över nästan hela det geografiska området, vilket tyder på att O. sinensis verkligen är homotalisk (kompletterande figur S15A och kompletterande tabell S36). Egenskapen skiljer sig extremt mycket från dess närbesläktade svamppatogener, såsom Tolypocladium inflatum (MAT1-2)22, C. militaris (MAT1-1)20, B. bassiana (MAT1-1)21, M. anisopliae (MAT1-1)19 och M. acridum (MAT1-2)19, som är heterotalliska och endast har ett enda parningstypslocus. I likhet med den välkända homotaliska växtpatogenen Fusarium graminearum 34 avslöjade organisationen av dessa två MAT-locus i O. sinensis fusionsstatusen inom den idiomorfa genomiska regionen, som var särskilt berikad i LTR-retrotransponsoner. Splittringen mellan den homotalliska O. sinensis och den heterotalliska C. militaris uppskattades inträffa nästan 174,2 MYA (Supplemental Figure S13C), och utsattes för flera omvandlingar av parningssystemet från självinkompatibel till självkompatibel under loppet av dess evolutionära historia (Supplemental Figure S15C), vilket liknar det trådformiga ascomycete-släktet Neurospora 35.

Populationsdivergens baserad på latituder på Qinghai-Tibetanska högplatån

För att undersöka de genomomfattande relationerna och populationsdivergensen samlade vi in och resekvenserade 31 accessioner av O. sinensis över dess kända utbredningsområde, inklusive provinserna Qinghai, Sichuan, Yunnan och Gansu samt Tibet Autonomous Region på Qinghai-Tibetanska högplatån (Supplemental Figure S16 och Supplemental Table S37). Vi genererade totalt 183 miljoner parvis avslutade läsningar (~36,68 Gb sekvenser) med ett genomsnittligt djup på ~10,1× (rådata) (Supplemental Table S38). Från dessa data genererade vi en uppsättning av 816 960 singelnukleotidpolymorfismer (SNP) och 48 092 strikta indels (infogningar och borttagningar) för att bedöma släktskap mellan populationer av O. sinensis (kompletterande figurer S18-19 och kompletterande tabell S39). Majoriteten av de genomiska varianterna (71,1 %) kartlades i intergeniska regioner med en delmängd som kartlades i de kodande regionerna (23,3 % bestående av 101 997 synonyma och 88 224 icke-synonyma SNP:er med substitutionsförhållandet 0,86) (kompletterande figur S19 och kompletterande tabell S39). Det fylogenetiska träd som konstruerades med hjälp av SNP-datasetterna delade upp de 31 accessionerna i tre geografiskt skilda grupper som sträcker sig från regioner med låg latitud till hög latitud (Fig. 4A) – ett resultat som förstärktes av PCA med hjälp av den första och andra egenvektorn (Fig. 4B och Supplemental Figure S20A). Genom att variera antalet förmodade förfäderspopulationer (K) visade det sig att när K = 3 stämmer de tre distinkta grupperna överens med PCA och den fylogenetiska rekonstruktionen (fig. 4C och kompletterande figur S20B). Vissa accessioner från gruppen med låga latituder uppvisar starka tecken på blandning och är mer utspridda jämfört med de andra två grupperna, vilket tyder på en större genetisk mångfald som möjligen beror på gemensamma polymorfismer från förfäderna och/eller nyligen inträffade introgressionshändelser (Fig. 4D,E). Den uppskattade statistiken för populationsdifferentiering (F ST ) bland dessa tre latitudbaserade grupper avslöjade ytterligare den basala karaktären hos låglatitudregionen, särskilt populationer från Nyingchi-distriktet i Tibet, vilket ytterligare framgick av dess avsevärt förhöjda nukleotiddiversitet (π) inom gruppen och lägre populationsdifferentiering med de andra två höglatitudgrupperna. (Fig. 4C-F).

Vi undersökte vidare vilka gener som påverkades av olika nivåer av SNP-innehåll och icke-synonyma mutationer (Supplemental Table S40). Funktionell anrikningsanalys av de 100 främsta generna med högst SNP-innehåll och/eller icke-synonyma mutationer visar att de huvudsakligen är involverade i ämnesomsättningen av svampens sekundärmetaboliter, såsom polyketidsyntesdehydratas dehydratas (PF14765; FDR < 0,01), KR-domän (PF08659; FDR < 0,01) och kondensationsdomän (PF00668; FDR < 0,01). De funktionella kategorierna som är förknippade med fettsyrabiosyntesen var också berikade, t.ex. acyltransferasdomän (PF00698; FDR < 0,01) och beta-ketoacylsyntas (PF00109 och PF02801; FDR < 0,01) (kompletterande tabeller S41-42)

.