Komparativ genomik

Först jämförde vi de 61 uruguayanska isolaten med hjälp av SNP-analys med P125109-genomet som referens. Denna analys visade att de två äldsta isolaten har mer än 600 SNP som skiljer sig från referensgenomet (607 och 652 för 31/88 respektive 08/89), medan alla övriga 59 isolat har mindre än tvåhundra SNP (från 60 till 166) (kompletterande tabell 1). Å andra sidan har alla uruguayanska genomer 17 SNPs som skiljer sig från P125109-genomet.

En fylogenetisk analys baserad på SNPs avslöjade förekomsten av två klasser som vi kallade E1 och E2 (fig. 1(b)) och som omfattar 57 av de 61 stammarna. Dessa 57 stammar tillhör den viktigaste S. enterica serovar Enteritidis MLST-sekvenstyp 11 (ST-11) och har samcirkulerat i landet sedan 1994. De återstående fyra isolaten (31/88, 8/89, 77/02 och 89/02) tillhörde inte någon av de två kladerna (figur 1 b). Vi har tidigare rapporterat att de två äldsta isolaten (31/88 och 8/89) tillhör MLST-sekvenstypen 1974 (ST1974) och att ST1974 härstammar från ST11 efter förvärvet av ett karakteristiskt profag8. De andra två isolaten, 77/02 och 89/02, tillhör ST11 som majoriteten av stammarna.

E1-kladen omfattar 21 stammar som sträcker sig över alla fem epidemiologiska perioder och som isolerades från livsmedel, djur eller infektioner hos människor. E2-kladen representeras i stället av 36 isolat, varav 34 isolerades under de perioder som var förknippade med epidemier (figur 1(a,b)). Därför är det rimligt att anta att E2 kan utgöra en linje som var ansvarig för S. enterica serovar Enteritidis-epidemierna i landet.

Vi har tidigare rapporterat en fylogenetisk analys av 203 stammar, som representerar intra-serovar-diversitet bland S. enterica serovar Enteritidis EBG4-isolat i hela världen, som inkluderade 6 av de 61 uruguayanska isolaten som användes i den aktuella studien8. Som vi nu har konstaterat är hälften av dessa 6 stammar E1 och hälften E2 (E1: 53/94, 206/99 och 214/02; E2: 8/02, 251/01 och 253/01), och var och en av dessa två grupper är nära besläktad med stammar från Europa och Nordamerika. Detta förhållande visas i kompletterande figur S1, som innehåller den tidigare rapporterade fylogenin med en zoom på den klad som bildas av dessa stammar. Detta tyder på att E1 och E2 kan ha ett brett cirkulationsmönster.

För att ytterligare stödja detta antagande utförde vi en ny fylogenetisk analys, denna gång med fokus på stammar isolerade i regionen, inklusive 12 från Argentina, 122 från Brasilien och samma 61 genomer från Uruguay (Fig. 2(a)). Intressant nog fann vi att alla dessa stammar klustrade på ett mycket likartat sätt som vi fann bland Uruguays isolat, dvs. E1-klustret innehåller nu stammar från Argentina och Brasilien medan E2-klustret innehåller stammar från Brasilien (103 i E1 och 62 i E2). Med tanke på det låga antalet genomer från Argentina som finns tillgängliga i EnteroBase kan vi inte utesluta möjligheten att linje E2 cirkulerade i detta land. Endast 30 stammar från alla tre länderna grupperade sig utanför E1 och E2, varav 24 isolerades före 1994 (fig. 2(a), kompletterande tabell 2). Sammantaget tyder våra resultat starkt på att E1- och E2-stammar introducerades i regionen omkring 1994 och har cirkulerat sedan dess i Uruguay, Brasilien, Argentina, Europa och Nordamerika, vilket stöder idén att båda utgör linjer av serovar Enteritidis.

(a) Fylogenetiskt träd av de 195 genomerna, inklusive 61 från Uruguay (vita blad), 12 från Argentina (ljusblå blad) och 122 från Brasilien (gula blad). Grenar från E1-linjen är färgade i blått. Grenar av E2-linjen är markerade med rött. Lanes till höger representerar med olika färger de alleliska varianterna för ycdX, pduD, hsdM, ybiO, yiaN, aas respektive aceA. Se färgtexter i (b). Skalstrecksenheterna representerar förändringar per variantplats. (b) Genutjämning för de olika allelvarianterna för ycdX, pduD, hsdM, ybiO, yiaN, aas respektive aceA. Generna visas som annoterade i det genom som innehåller varje variant och anpassas till referensen P125109. Skalan för anpassningen i baspar (bp) anges med horisontella staplar. SNP:er förknippade med varje variant i förhållande till referensgenomet redovisas i tabell 1. SNPs som orsakar icke-synonyma varianter är markerade som X → Y (i aminosyrakod med en bokstav) i förhållande till dess position i genen. Synonyma SNP:er är endast markerade i förhållande till sin position i genen (syn SNP).

Vi utförde sedan en komparativ genomikanalys i syfte att identifiera genetiska skillnader som är förknippade med linje E1 och E2, inklusive 165 genomer: 57 från Uruguay, 11 från Argentina och 97 från Brasilien (fig. 2(a)).

Alleliska varianter mellan E1- och E2-linjerna

Då vi inte hittade några skillnader i accessoriska arvsmassor mellan E1- och E2-linjerna letade vi efter SNP-skillnader mellan de 165 utvalda stammarna. Denna analys visade att de viktigaste skillnaderna mellan E1 och E2 finns i tre gener: ycdX, pduD och hsdM. Dessa gener är avbrutna i E1-genomerna jämfört med deras motsvarigheter i E2-genomerna. Dessutom hittade vi alleliska varianter i andra fyra gener, ybiO, yiaN, aas och aceA, som är specifika för varje släktled (fig. 2(a,b); tabell 1).

Alla de 103 E1-stammarna (11 från Argentina, 71 från Brasilien och 21 från Uruguay) uppvisar en insättning med 4 baspar i genen ycdX (SEN1912) jämfört med referensen och alla E2-stammar (tabell 1). Denna insättning introducerar ett för tidigt stoppkodon, vilket kan ge upphov till en pseudogen eller en trunkerad version av proteinet (figur 2(b) och tabell 1). YcdX-genen kodar för ett hydrolas som tillhör superfamiljen av PHP-proteiner, som innehåller en NH2-terminal php-domän (polymeras histidinolfosfatas). Denna domän är karakteristisk för DNA-polymeras III alfa-underenhet i bakterier och är involverad i proofreading-funktionen22. Det har föreslagits att YcdX är involverad i DNA-reparationsvägarna i E. coli och skulle kunna fungera som nukleas eller fosfatas i dessa vägar23. Nyligen fann Wang et al. två alleliska varianter för denna gen (icke-synonyma SNP) mellan isolat av S. enterica serovar Enteritidis med markant olika förmåga att överleva i äggvita24. Inoue et al. visade att mutation i ycdY (den intilliggande genen i ycdWXYZ-operonet) orsakade repression av svärmning i E. coli25.

Alla stammar från E2-linjen har samma alleliska variant för pduD-genen (SEN2039), medan 102 av de 103 stammarna från E1-linjen uppvisar en basersättning som introducerar ett stoppkodon, liknande den som observerats för ycdX (tabell 1). Den återstående stammen (dvs. 11/07 från Uruguay) saknar helt pduD-genen (figur 2 b och tabell 1). pduD kodar för ett propandioldehydratas, en del av pdu-operonet som kodar för alla de proteiner som krävs för katabolismen av 1,2-propandiol. Detta operon, som förvärvades genom lateral genöverföring i Salmonella26,27 , är stört i olika serovarer som orsakar invasiva extraintestinala infektioner hos människor, t.ex. Typhi och Paratyphi A bland andra28. Faber et al. rapporterade att funktionaliteten hos detta operon kan vara viktig för att konkurrera med tarmmikrobiota, eftersom 1,2 propandiol är en metabolisk produkt i den anaeroba tarmmiljön som kan användas av Salmonella när den kopplas till den anaeroba tetrathionatrespirationen29. Det föreslås att förmågan att använda 1,2 propandiol gör det möjligt att expandera patogenpopulationen i tarmen, vilket ökar utsöndringen i avföringen, vilket är en viktig faktor för epidemisk spridning29.

För övrigt har alla E2-stammar samma allelvariant för hsdM-genen (SEN4290), men bland E1-stammarna finns det flera varianter för denna gen (fig. 2(b) och tabell 1). De flesta E1-stammarna innehåller varianter av hsdM som skulle ge antingen en trunkerad version (4 av de 6 varianterna) eller en icke-synonym substitution av proteinet. Endast tre stammar i E1 (inklusive den uruguayanska 44/07) har samma variant som E2, vilket tyder på att det endast är i E1-stammar som hsdM är benägen att ackumulera mutationer (fig. 2(b)). HsdM-genen kodar för ett DNA-metylas som är involverat i restriktionsmodifieringssystemet (RM) av typ I i enterobakterier30,31. Tidigare rapporter kopplade restriktionsmodifikationssystem typ 2 till patogenicitet hos Salmonella på grund av epigenetiska effekter på virulensgenuttrycket32. Silva et al. visade att mutationer i RM-generna ger en försämrad fenotyp i musmodellen av invasiv salmonellos33. RM-system av typ 1 har också beskrivits som involverade i patogeniciteten hos Yersinia pseudotuberculosis34.

Med tanke på att E2 men inte E1 har intakta kopior av ycdX, pduD och hsdM, och med tanke på att dessa gener tidigare har involverats i Salmonellas patogenicitet, kan man anta att dessa tre gener kan vara relevanta för E2-stammarnas epidemiska förmåga. Vi letade också efter de alleliska varianterna i den globala fylogenin som representerar den intra-serovariska mångfalden (Supplementary Fig. 1 och ref. 8) och fann att den dominerande allelen är E2-allelen i alla fall, medan de störda varianterna är specifika för E1 (data ej visad).

Som nämnts ovan hittades ytterligare fyra gener ybiO, yiaN, aas och aceA med mindre sekvensskillnader mellan de båda stammarna. Dessa fyra gener uppvisar en enda variant i E2-stammarna medan E1 i stort sett är identiska med P125109-referensstammen.

Alla E2-stammar uppvisar en särskild allelvariant av ybiO-genen (SEN0772) på grund av en substitution som ger en Gly(601)→Arg i proteinet (fig. 2(a,b), tabell 1). YbiO-genen kodar för ett förmodat mekanoskänsligt kanalprotein som är involverat i osmotisk anpassning och som aktiveras av hypoosmotisk chock i E. coli35. Det har tidigare rapporterats att det finns två alleliska varianter för denna gen bland isolat av S. enterica serovar Enteritidis som har olika förmåga att överleva i äggvita24. För yiaN (SEN3494) (L-dehydroaskorbattransportörens stora permeasunderenhet, ett förmodat membranprotein) har alla E2-genom samma allel som skiljer sig i Gly(163)→Ala i förhållande till E1. På samma sätt har alla E2 samma variant för generna aas (2-acylglycerophosphoethanolamine acyltransferase/acyl-ACP synthetase, SEN2853) och aceA (isocitrate lyase, SEN3966). I E1 har de flesta stammarna en aas-gen som är identisk med referensgenen, och ett fåtal stammar har antingen en icke-synonym substitution (5 stammar) eller en synonym substitution (1 stam) (figur 2(a), tabell 1). På samma sätt är aceA-genen identisk med referensen i alla E1-genom utom ett.

Sammanfattningsvis fann vi att E2-allelerna för ybiO, yiaN, aas och aceA är specifika för denna härstamning.