PCR av mecA-genen

Ett 188-bp-fragment inom mecA-genen och ett 178-bp-fragment inom S. aureus-specifika Sa442-genen amplifierades för isolat 1 och 2 i separata reaktioner på en LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) med hjälp av SYBR-gröna med primers Mec-S och Mec-A respektive Sa442-F och Sa442-RS, enligt tidigare beskrivning (5). mecA-positiva isolat genererar en smältningstemperatur för SYBR-gröna på 79 °C. Sa442-positiva isolat genererar också en SYBR-grön smälttemperatur på 79 °C. S. aureus ATCC 29213 (mottaglig för oxacillin) och S. aureus ATCC 43300 (oxacillinresistent) användes som kontroller för Sa442-genen och som negativa respektive positiva kontroller för mecA-genen. Till skillnad från kontrollerna genererades ingen mecA- eller Sa442-produkt för isolat 1 och 2. En ytterligare PCR utfördes för att upptäcka ett större 533 bp-fragment av mecA-genen (4). Ingen produkt genererades i isolat 1 och 2 eller S. aureus ATCC 29213, men en produkt av förväntad storlek genererades från S. aureus ATCC 43300. 16S rRNA-genen, som användes som positiv kontroll, amplifierades från alla stammar (data visas inte).

Precis och snabb upptäckt av meticillinresistens hos S. aureus är en viktig funktion för det kliniska mikrobiologiska laboratoriet (20). Medan detektion av mecA-genen med PCR är guldstandarden har PBP2a-latexagglutinationstestet visat sig vara ett enkelt och snabbt test, med goda prestandaegenskaper för att detektera meticillinresistens hos både S. aureus och koagulasnegativa stafylokockarter, oaktat behovet av föregående induktion i vissa fall (1, 21). PBP2a-testet använder latexpartiklar som sensibiliserats med monoklonala antikroppar mot PBP2a (11). Specificiteten för detta test uppges närma sig 100 % (18, 19). Även om det inte finns några rapporter om prestanda för PBP2a-latexagglutinationstester för S. intermedius-isolat har falskt positiva PBP2a-resultat noterats för två S. warneri-isolat, ett vid 1 minut och det andra vid 6 minuter, som båda var mecA-PCR-negativa med en oxacillin-MIC på ≤0,5 μg/ml (21). Enligt tillverkarens bipacksedel är falskt positiva reaktioner i allmänhet svaga agglutinationer som ofta är negativa vid upprepad testning med en färsk kultur. Vi fann dock att våra två isolat var upprepade gånger positiva efter flera subkulturer, varav en var starkt positiv. S. intermedius ATCC 29663-stammen var faktiskt negativ med PBP2a-testet men skilde sig också fenotypiskt från de två kliniska stammarna med avseende på positiv mannitoljäsning, β-laktamasnegativitet och penicillinkänslighet (resultat visas inte).

Koagulaspositivitet används vanligen för att tillskriva klinisk betydelse och patogenicitet till isolat av Staphylococcus spp. Medan S. aureus är den vanligaste koagulaspositiva stafylokocken som isolerats i det kliniska laboratoriet, är S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae och vissa stammar av S. hyicus också koagulaspositiva (1). Laboratorier använder ofta en kombination av tester för att påvisa fritt koagulas eller klumpningsfaktor med och utan protein A för att identifiera koagulaspositiva stafylokocker. S. intermedius-isolat är positivt för fritt koagulas men negativt för protein A, och 14 % av isolaten har en klumpningsfaktor, vilket skulle förklara det positiva glidkoagulaset och den svagt positiva BACTi Staph latex för isolat 1 (6). Som tidigare beskrivits fann vi att positivitet för pyrrolidonylarylamidas är ett snabbt sätt att fastställa att en koagulaspositiv stafylokock inte är S. aureus (10). Vi anser att våra fall tyder på att den verkliga förekomsten av S. intermedius vid sårinfektioner hos människor troligen underskattas, eftersom alla koagulaspositiva stafylokocker ofta klumpas ihop med S. aureus (17). I avsaknad av definitiv identifiering av S. intermedius med fenotypiska eller biokemiska metoder har sekvensering av 16S rRNA-genen visat sig vara användbar för taxonomisk klassificering av Staphylococcus- och Macrococcus-arter (8).

En första studie 1989 visade att 72 % av S. intermedius-isolat från gingiva från hundar och sårinfektioner orsakade av hundar var mottagliga för penicillin, och att ingen var resistent mot oxacillin (16). En nyare studie visade att oxacillinresistens är ett ökande problem hos S. intermedius-isolat, med 60 till 85 % högre oxacillinresistensnivåer noterade för isolat från nos, ögon och abscesser hos hundar jämfört med isolat från andra platser (7). I den första människoinfektionen på grund av meticillinresistent S. intermedius, där den var orsaken till lunginflammation, var oxacillin-MIC 32 μg/ml (3). Båda våra isolat var resistenta mot penicillin och var β-laktamaspositiva; oxacillin-MIC för dessa isolat var 0,125 μg/ml. Penicillinresistensen hos dessa isolat, i avsaknad av oxacillinresistens med en negativ mecA-PCR och känslighet för kombinationer av β-laktam/β-laktamashämmare, kan förklaras av det positiva resultatet av β-laktamasanalysen. Gortel et al. bekräftade med hjälp av en primeruppsättning riktad mot ett 533 bp-fragment av mecA-genen att mecA-genen ger meticillinresistens hos stafylokocker isolerade från hundar (4). Dessa forskare fann att bland 10 koagulaspositiva stafylokockstammar som bar på mecA var 9 S. aureus och 1 S. intermedius. De antog att skillnaden i prevalens av meticillinresistens hos S. intermedius jämfört med S. aureus berodde på en skillnad i mecA-reglering mellan arterna eller på avsaknaden av intensivt antibiotiskt selektionstryck på S. intermedius (4). Även om det inte finns några specifika NCCLS-tolkningskriterier för andra koagulaspositiva stafylokocker än S. aureus, har resultaten av testning av oxacillinkänslighet med fenotypiska och genotypiska metoder (PCR av mecA-genen med hjälp av två primerset som riktar in sig på 188- och 533-bp-fragment), i kombination med låga MIC-värden för oxacillin jämfört med dem som tidigare rapporterats för oxacillinresistenta S. intermedius-isolat (MIC > 4 μg/ml), fastställs att isolat 1 och 2 i denna studie är oxacillinkänsliga (3, 4).

Det är väl accepterat att meticillinresistens hos S. aureus huvudsakligen beror på förvärvet av ytterligare ett penicillinbindande protein, PBP2a, som kodas av mecA-genen. Ett sökande efter ursprunget till mecA-genen ledde till identifiering av en möjlig evolutionär föregångare i S. sciuri, en kommensal hos djur. MecA-homologen i S. sciuri uppvisade 79,5 % DNA-sekvenslikhet med mecA-genen från S. aureus och 88 % aminosyraidentitet med PBP2a. MecA-homologen i S. sciuri ger inte resistens mot meticillin i naturen. Couto et al. identifierade dock meticillinresistenta S. sciuri-isolat från människor, där överexpression av mecA-homologen till följd av införande av ett IS256-element uppströms från den strukturella genen eller förändringar av en enda nukleotid i promotorregionen resulterade i produktion av ett protein som funktionellt liknar PBP2a (2). I likhet med S. sciuri-isolat kan de S. intermedius-isolat som beskrivs här innehålla en mecA-homolog som kodar för ett PBP2a-liknande protein, som korsreagerar med PBP2a-latexagglutinationstestet men som inte ger meticillinresistens. Antigenisk mimik med ett helt orelaterat protein är också möjligt. I båda fallen hoppas vi kunna öka medvetenheten i det mikrobiologiska samfundet om att det finns kliniska isolat som kan utmana specificiteten hos PBP2a-latexagglutinationstestet.

Slutsatsen är att vi för första gången rapporterar falskt positiva PBP2a-resultat för två stammar av S. intermedius som, i kombination med ett initialt fel i tolkningen av fenotyptesterna, ledde till att de felaktigt identifierades som MRSA. Falskt positiva PBP2a-resultat kan leda till felriktade försök till infektionskontroll, onödig användning av antibiotika som vankomycin och en allmän ökning av sjukhuskostnaderna (20). Dessa fall understryker vikten av att aktivt söka efter avvikande laboratorietestresultat för att undvika rapporteringsfel. Noggrann artidentifiering av koagulaspositiva stafylokocker är nödvändig för att fastställa de kliniska isolatens patogenicitet, kliniska betydelse, känslighetsmönster och epidemiologi.