Isozymer av hexokinas från däggdjur: struktur, subcellulär lokalisering och metabolisk funktion | Journal of Experimental Biology
Typ I-isoenzym
Som framgår av fig. 1 fungerar hexokinas som den port genom vilken Glc kommer in i alternativa metaboliska vägar. Ändå är det förmodligen säkert att säga att hexokinas mest allmänt betraktas som ett glykolytiskt enzym, och glykolytisk metabolism anses i allmänhet vara en cytoplasmatisk process. Det var därför anmärkningsvärt att, till skillnad från andra glykolytiska enzymer, hexokinasaktivitet (som nu är känd för att vara typ I-isoenzym) främst påträffades i ”partikulära fraktioner” av hjärnhomogenat (Crane och Sols, 1953). Senare arbete (Johnson, 1960; Rose och Warms, 1967; se även Wilson, 1995) visade att det partikulära hexokinaset var associerat med mitokondrier, och mer specifikt med det yttre mitokondriemembranet (Rose och Warms, 1967; Kropp och Wilson, 1970).Bindningen är kritiskt beroende av en hydrofob N-terminal sekvens (Polakis och Wilson, 1985) som selektivt riktar in typ I-isozymet på mitokondrier (Gelb et al, 1992; Sui och Wilson, 1997) och som under bindningen infogas i den hydrofoba kärnan i det yttre mitokondriella membranet (Xie och Wilson, 1988). Porin (även kallat ”DVAC”, akronym för ”voltagedependent anion channel”) utgör den kanal genom vilken metaboliter passerar det yttre mitokondriella membranet, och identifierades som det yttre mitokondriella membranprotein som interagerar med hexokinas (Felgner et al., 1979; Lindén et al., 1982; Fiek et al., 1982). Dessutom finns det bevis som stöder uppfattningen att bindning av hexokinas sker företrädesvis till porin som är lokaliserat i kontaktytor, områden där det finns intim kontakt mellan det inre och yttre mitokondriella membranet (Dorbani et al., 1987;Kottke et al,
De klassiska studierna av Johnson (1960) och Rose och Warms (1967) följdes snart av rapporter om mitokondriebundet hexokinas från andra normala vävnader, förutom hjärnan, samt från olika tumörceller (för referenser, se Wilson, 1985, 1995). Den potentiella fysiologiska betydelsen av denna förening av ett ”glykolytiskt” enzym med mitokondrier, den primära platsen för oxidativ ämnesomsättning, har varit föremål för många spekulationer. Redan tidigt, och särskilt efter det att man insåg att det ”hexokinasbindande proteinet” i det yttre mitokondriemembranet var identiskt med porin, och att hexokinas därmed skulle kunna vara placerat nära den punkt där ATP skulle lämna mitokondrierna (och ADP återinträda i dem), Spekulationerna var till stor del inriktade på möjligheten att denna närhet skulle kunna främja ett intimt metaboliskt samspel mellan intramitokondriell oxidativ fosforylering som en källa till substrat-ATP och Glc-fosforylering av det mitokondriellt bundna hexokinaset. Detta hade faktiskt övervägts av Rose och Warms (1967), men kunde inte stödjas av deras experimentella resultat. Efterföljande arbeten av andra (för referenser se Wilson,1985,1995), som använde mitokondriellt bundet hexokinas från olika källor, gav dock bevis för att mitokondriellt bundet hexokinas hade ”förmånlig” eller ”privilegierad” tillgång till intramitokondriellt genererad ATP.
Arbetet i vårt laboratorium har gett en fast grund för uppfattningen att hexokinas som är bundet till aktivt fosforylerande hjärnmitokondrier verkligen är tätt kopplat till en intramitokondriell del av substrat-ATP som genereras av oxidativ fosforylering. Det experimentella stödet för denna slutsats har beskrivits i en rad publikationer (Beltrandel Rio och Wilson, 1991, 1992a, b; de Cerqueira Cesar och Wilson, 1995, 1998, 2002; Hashimoto och Wilson, 2000). Det är inte möjligt att göra en fullständig genomgång av detta arbete i detta sammanhang, men vi kommer att lyfta fram några av de viktigaste resultaten för att visa på de olika experimentella metoder som har använts i dessa studier och som alla har lett till samma slutsats.
De första studierna (BeltrandelRio och Wilson,1991,1992a,b)gjordes med spektrofotometriska metoder där ATP-produktion genom olika intramitokondriella processer (oxidativ fosforylering, adenylatkinasreaktion, kreatinkinasreaktion) och Glc-fosforylering genom hexokinas kopplades till NADPH-produktion, som övervakades vid 340 nm, genom användning av lämpliga kopplingsenzymer. Grundtanken var att man genom att jämföra Glc-fosforyleringshastigheten med hastigheten för ATP-produktion från olika källor skulle kunna härleda den relativa betydelsen av olika intramitokondriella ATP-bildande processer som en källa till substrat-ATP för hexokinas. Slutsatsen är att när oxidativ fosforylering pågår är varkenadenylatkinas eller kreatinkinas en betydande källa till substrat-ATP. Dessutom utnyttjades endast en bråkdel av det ATP som producerades av oxidativ fosforylering av hexokinas, vilket ledde till att det i det extramitokondriella mediet fortsatte att öka när den oxidativa fosforyleringen fortsatte. Hastigheten för Glc-fosforylering ökade dock inte stadigt som svar på den fortsatta ökningen av extramitokondriellt, trots att den senare var jämförbar med Km för ATP som sågs med tillsatt extramitokondriellt ATP i avsaknad av oxidativ fosforylering, dvs. hexokinaset skulle inte ha blivit ”mättat” med extramitokondriellt ATP som substrat (fig. 2). Detta tyder starkt på att det inte var extramitokondriellt ATP som användes som substrat.
Glukos (Glc) fosforylering till glukos-6-fosfat (Glc-6-P) avmitokondriellt bundet hexokinas med exogen ATP eller med ATP som genereras av oxidativ fosforylering. Hastigheten för Glc-fosforylering bestämdes med en ekvivalent, som antingen tillsattes exogent i avsaknad av oxidativ fosforylering (trianglar) eller genererades av oxidativ fosforylering (cirklar). Från båda källorna var den undermättande, med en hastighet av Glc-fosforylering som låg långt under den som observerades när ATP-nivåerna ökades akut genom tillsats av mättande nivåer av exogent ATP (fyrkanter). Återges med tillstånd från BeltrandelRio och Wilson (1991).
Fortre stöd för detta gavs av resultat som de som visas i fig. 3. Här övervakades Glc-fosforylering efter initiering av oxidativ fosforylering genom tillsats av ADP, med ökande koncentrationer av extramitokondriell ATP närvarande från början. Som förväntat enligt klassisk Michaelis-Mentenkinetik ökade den initiala hastigheten för Glc-fosforylering med ökande extramitokondriell ATP. Med tiden uppnåddes dock en stabil Glc-fosforyleringshastighet som var oberoende av mängden kvarvarande extramitokondriell ATP. Dessa resultat tolkades som att det mitokondriellt bundna hexokinaset inledningsvis använde sig av extramitokondriellt ATP, men att initieringen av oxidativ fosforylering ledde till ett byte av substratpreferens, varvid hexokinaset blev beroende av ett intramitokondriellt ATP-avsnitt som bestämdes av den oxidativa fosforyleringens hastighet och som var oberoende av extramitokondriellt ATP.
Glukosfosforylering (Glc) av mitokondriebundet hexokinas, med ATP som genereras genom oxidativ fosforylering i närvaro av ökande koncentrationer av exogent ATP. ATP-produktion genom oxidativ fosforylering inleddes genom tillsats av ADP vid angiven tidpunkt. Glc-fosforylering kopplades till NADPH-produktion, som övervakades genom absorbans vid 340 nm (A), i närvaro av ett överskott av glukos-6-fosfat (Glc-6-P)-dehydrogenas. Koncentrationerna av exogent ATP, som fanns vid tidpunkten för ADP-tillsatsen, var 1,1, 0,66, 0,22 och 0 mmol l-1 för kurvorna A-D. Observera att det stabila tillstånd som uppnåddes var oberoende av den ursprungliga extramitokondriella . Återgivet med tillstånd från BeltrandelRio andWilson (1992b).
Trots att ATP-produktionen började nästan omedelbart efter initiering av oxidativ fosforylering genom tillsats av ADP, fanns det en markant fördröjning i initieringen av Glc-fosforylering av det mitokondriebundna hexokinaset (Fig. 3D) innan man uppnådde en steady state-hastighet som höll i sig under en längre period. Denna inledande fördröjningsperiod tolkades som den tid som krävdes för att fylla en intramitokondriell avdelning med ATP som genererats av oxidativ fosforylering och från vilken det mitokondriellt bundna hexokinaset hämtade sitt substrat ATP. Hämning av elektrontransporten genom tillsats av KCN resulterade i en uppenbar frisättning av ATP, förmodligen från det intramitokondriella kompartmentet, och egenskaperna hos detta ”kompartment” (fyllningens kinetik, koppling till intramitokondriell ATP-produktion osv.) stämde väl överens med de förväntningar som baserades på denna tolkning (BeltrandelRio och Wilson,1991,1992a,b).Tyvärr är överensstämmelse med förväntningarna inte en ofelbar vägledning för att avgöra vad som är sant, och det ”uppenbara frigörandet av ATP” visade sig senare vara en artefakt (Laterveer et al.,1993).), vars källa fortfarande inte är klarlagd och som inte kunde reproduceras i senare arbeten (deCerqueira Cesar och Wilson, 1998). Trots detta nedslående och pinsamma bakslag stöddes grundkonceptet att koppla mitokondriellt bundet hexokinas till ett intramitokondriellt kompartment av ATP av andra bevis och har klarat senare experimentella tester.
En metod för dubbel isotopmärkning utvecklades som ett alternativ till de spektrofotometriska förfarandena (deCerqueira Cesar och Wilson, 1995). 14C-märkt Glc användes som substrat för hexokinas och 32Pi som substrat för ATP-syntes genom oxidativ fosforylering. Förhållandet32P/14C i Glc-6-P gav således ett mått på den specifika aktiviteten hos det substrat ATP som används av hexokinas. Förhållandet32P/14C i Glc-6-P som produceras av mitokondriellt bundet hexokinas jämfördes med det som produceras av jästhexokinas, som inte binder till mitokondrier och därför nödvändigtvis använder extramitokondriellt ATP som substrat. Kinetiken för märkning av de ATP-pooler som används som substrat av mitokondriebundet hexokinas och jästhexokinas var påfallande olika, vilket återigen stämmer överens med uppfattningen att det mitokondriebundna hexokinaset inte använde extramitokondriellt ATP som substrat, utan snarare använde sig av en intramitokondriell avdelning av ATP som tillfördes genom oxidativ fosforylering.Till exempel (fig. 4) resulterade tillsats av ett överskott av 31Pi, vilket påtagligt minskade den specifika aktiviteten hos det 32P-ATP som syntetiserades genom oxidativ fosforylering, i en snabb minskning av 32P/14C-förhållandet av Glc-6-P som producerades av jästhexokinas med hjälp av extramitokondriellt ATP. Däremot skedde en fördröjning och därefter en något långsammare minskning av 32P/14C-kvoten av Glc-6-P som produceras av mitokondriellt bundet hexokinas. De senare observationerna var återigen förenliga med uppfattningen att det mitokondriella hexokinaset använde en intramitokondriell avdelning av ATP som inte var fritt balanserad med extramitokondriellt ATP.
Effekt av att tillsätta ett överskott av omärkt Pi på32P/14C-förhållandet av glukos-6-fosfat (Glc-6-P) som bildas avmitokondriellt bundet hexokinas eller icke-mitokondriellt bundet jästhexokinas.Oxidativ fosforylering inleddes med 32Pipärvarande som substrat för oxidativ fosforylering, och Glc som substrat för hexokinas. Vid 3 minuter tillsattes överskott av 31Pi, vilket minskade den specifika aktiviteten av ATP som senare producerades av oxidativ fosforylering. Detta resulterade i en brådskande minskning av 32P/14C-förhållandet för Glc-6-P som bildas av jästhexokinas (fyrkanter) med extramitokondriell ATP som substrat, men en mycket långsammare minskning av 32P/14C-förhållandet för Glc-6-P som bildas av hexokinas som är bundet tillmitokondrierna (öppna cirklar). Fyllda cirklar, totalt Glc-6-P producerat av mitokondriellt bundet hexokinas. Återges med tillstånd från de Cerqueira Cesar och Wilson (1995).
Ett annat experimentellt tillvägagångssätt baserades på en jämförelse mellan det mitokondriellt bundna hexokinaset och det obundna jästenzymet (de Cerqueira Cesar och Wilson, 1998, 2002). Den bakomliggande logiken illustreras i figur 5. En fast mängd hjärnmitokondrier med bundet hexokinas blandas med ökande mängder mitokondrier från råttlever som inte innehåller något bundet hexokinas. Både hjärn- och levermitokondrier är aktivt fosforylerande och därför ökar ATP-produktionen i systemet i takt med att mängden levermitokondrier ökar. Koncentrationen av extramitokondriellt ATP hålls undermättad, dvs. ÅKm hexokinas med extramitokondriellt ATP som substrat (i avsaknad av oxidativ fosforylering). Om det mitokondriellt bundna hexokinaset använder extramitokondriellt ATP som substrat förväntas en progressiv ökning av Glc-fosforyleringshastigheten när ATP-produktionshastigheten ökar genom tillsats av ökande mängder levermitokondrier. I själva verket är detta inte vad som observerats; snarare påverkas inte Glc-fosforyleringshastigheten av det hexokinas som är bundet till demitokondrierna nämnvärt av ökningen av ATP-produktionen (fig. 6). Däremot ses den förväntade ökningen av Glc-fosforyleringshastigheten om det mitokondriella hexokinaset ersätts med en likvärdig mängd jästhexokinas. Dessa resultat är alltså återigen förenliga med uppfattningen att mitokondriebundet hexokinas använder intramitokondriellt ATP, som är inneboende i de mitokondrier som hexokinaset är associerat med, men som är oberoende av eventuella ökningar av intramitokondriellt ATP som härrör från de hexokinasfria levermitokondrierna.
Schematisk framställning av den experimentella strategin för att jämföra utnyttjandet av extramitokondriellt ATP av mitokondriellt bundet hexokinas eller obundet jästhexokinas. (A) Mitokondriellt bundet hexokinas (HK) är representerat i mitten av panelen, med ytterligare mitokondrier, som innehåller lite eller inget bundet hexokinas, i mer perifera regioner.För det senare användes mitokondrier i råtthjärnan som hade utarmats på hexokinas genom behandling med glukos-6-fosfat, vilket orsakar frisättning av demitokondriellt bundet hexokinas, i tidigare experiment. I senare experiment användes dock mitokondrier från råttlever som i isolerad form inte innehåller bundet hexokinas. Extramitokondriell ATP fördelas i hela det extramitokondriella utrymmet. (B) Analog situation, men med en motsvarande mängd icke-mitokondriellt bundet jästhexokinas (YHK) i stället för det mitokondriellt bundna hexokinaset. Den grundläggande strategin är att bestämma hastigheten för glukosfosforylering med en fast mängd bundet eller obundet hexokinas när hastigheten för extramitokondriell ATP-produktion ökas genom tillsats av ett ökande antal mitokondrier utan bundet hexokinas. Återges med tillstånd från de Cerqueira Cesar och Wilson (2002).
Fosforylering av glukos (Glc) av mitokondriebundet och obundet hexokinas med ökande ATP-produktion från oxidativ fosforylering. Hastigheten för Glc-fosforylering (v̇) uttrycks i förhållande till den maximala fosforyleringshastigheten (V̇), som bestäms med mättande nivåer av exogen ATP i frånvaro av oxidativ fosforylering. Hastigheten för produktion av Glc-6-P av icke-mitokondriellt bundet jästhexokinas (cirklar) är nära korrelerad med hastigheten för ATP-produktion. Däremot är hastigheten för Glc-fosforylering av mitokondriellt bundet hexokinas (fyrkanter) okänslig för ökande nivåer av extramitokondriellt ATP som produceras av mitokondrier som inte innehåller hexokinas, vilket är förenligt med uppfattningen att det mitokondriellt bundna enzymet är begränsat till intramitokondriellt ATP, som produceras av mitokondrierna som enzymet är bundet till, som substrat. Återges med tillstånd från de Cerqueira Cesar och Wilson (1998).
Finnligen kommer ytterligare bevis för uppfattningen att mitokondriellt bundet hexokinas kan skilja mellan intra- och extramitokondriellt ATP genom att undersöka hämning av Glc-6-P-analogen, 1,5-anhydroglucitol-6-P (1,5-AnG6P). I avsaknad av oxidativ fosforylering och med extramitokondriell ATP som substrat är 1,5-AnG6P en ganska potent hämmare som konkurrerar med ATP (fig. 7) (Hashimoto och Wilson, 2000). När ATP tillförs genom oxidativ fosforylering är 1,5-AnG6P däremot mycket mindre effektivt som hämmare. Det är uppenbart att ATP från oxidativ fosforylering inte är likvärdigt med extramitokondriellt ATP. Liknande resultat har nyligen rapporterats med hjälp av det itokondriella hexokinaset från hjärna från nötkreatur (de Cerqueira och Wilson, 2002).
Hämning av mitokondriebundet hexokinas av glukos-6-fosfatanalogen, 1,5-anhydroglucitol-6-P (1,5-AnG6P), med intramitokondriellt genererat (öppna cirklar) eller extramitokondriellt (fyllda cirklar) ATP-substrat. Återges med tillstånd från Hashimoto och Wilson (2000).
Kort sagt är den nuvarande uppfattningen att i avsaknad av oxidativ fosforylering kan mitokondriellt hexokinas lätt använda extramitokondriellt ATP, enligt klassisk Michaelis-Menten-kinetik. Under aktiv oxidativ fosforylering är dock det mitokondriebundna enzymet kopplat till en intramitokondriell pool av ATP, och hastigheten för Glc-fosforylering är nära korrelerad med hastigheten för oxidativ fosforylering.Det verkar svårt att tro att mitokondrier i normal vävnad någonsin befinner sig i ett helt icke-fosforylerande tillstånd. Förändringar i hastigheten? Ja, naturligtvis, beroende på fluktuationer i energibehovet. Men helt utan fosforylering? Förmodligen bara under de värsta – och i slutändan dödliga – omständigheterna. Av detta följer att under normala förhållanden är Glc-fosforyleringshastigheten nära samordnad med de slutliga oxidativa stegen i Glcmetabolismen i mitokondrierna, med tillhörande produktion av ATP genom oxidativ fosforylering. Som tidigare påpekats (BeltrandelRio och Wilson, 1992a) kan en sådan samordning säkerställa att Glc introduceras i den koglykolytiska metabolismen i en takt som motsvarar de slutliga oxidativa stadierna, vilket undviker produktion av neurotoxiskt laktat (Marie och Bralet, 1991) samtidigt som nettoflödet genom de cytoplasmatiska och mitokondriella delarna av vägen säkerställs i en takt som är tillräcklig för att tillgodose energibehovet (fig. 8).
Koordinering av de glykolytiska och oxidativa faserna i glukosmetabolismen (Glc). Hastigheten för Glc-fosforylering av mitokondriellt bundet hexokinas, med intramitokondriellt genererat ATP som substrat, är korrelerad med hastigheten för oxidativ fosforylering. Denna mekanism föreslås säkerställa samordning av Glc-fosforylering, det inledande steget i den glykolytiska metabolismen, med de slutliga oxidativa stegen (tricarboxylsyracykeln, med tillhörande elektrontransport och oxidativ fosforylering; fetstilade böjda pilar) som sker i mitokondrierna, vilket gör att man undviker att potentiellt giftigt laktat byggs upp.
Det är inte känt hur denna anmärkningsvärda förändring i substratspecificitet (intramitokondriell kontra extramitokondriell ATP) framkallas av oxidativ fosforylering, men det står klart att konformationen hos det mitokondriellt bundna enzymet påverkas av mitokondriell membranpotential samt andra faktorer som är relaterade till mitokondriell funktion, Detta tyder på ett intimt samspel mellan det inre (genom vilket membranpotentialen finns) och det yttre (till vilket hexokinas är bundet) membranet i denna organell (Hashimoto och Wilson, 2000).Konformationsförändringar som påverkar de delar av molekylen som är involverade i bindningen av substratet ATP har tidigare postulerats (de Cerquiera och Wilson, 1998) som ansvariga för förändringar i substratspecificiteten.