Däggdjurens könskromosomer har specialiserade roller i manlig (XY) och kvinnlig (XX) könscellsutveckling (1). Könskromosomavvikelser är den vanligaste genetiska orsaken till mänsklig infertilitet (2). Vid könskromosomtrisomierna Klinefelter (XXY) och dubbelt Y (XYY) syndrom störs spermatogenesen av överskott av X- respektive Y-gener (2). XYY-män är vanligen fertila på grund av spontan förlust av den extra könskromosomen (mosaikism). Hos XXY-män är mosaikism mindre vanligt. Spermauttag från testiklar har möjliggjort reproduktion hos vissa unga Klinefelter-män, men är mindre framgångsrikt hos äldre patienter (3, 4). XXY- och XYY-individer utan XY-kimceller är infertila.

För att studera SCT-infertilitet genererade vi vuxna XXY- och XYY-möss som bar de fluorescerande reportertransgenerna Blimp1-mVenus (BV) och Stella-ECFP (SC) (5) för att övervaka differentiering av pluripotenta stamceller till primordiala könscellsliknande celler (PGCLCs) (6). XXY-hannar skapades genom parning av en vildtyphona med en hane med könskromosomvariant som producerar XY-innehållande spermier (fig. S1). Generering av XYY-möss kräver arv av en Y-kromosom från båda föräldrarna. Vi använde därför en faderns ärvda Y-kromosom av vildtyp och en moderns ärvda Yd1-kromosom som inte uttrycker den testikelbestämmande Sry (fig. S1) (7). Som tidigare visats (8, 9) återskapade spermatogenesens fenotyp i båda modellerna den hos SCT-människor, med stopp i prospermatogonialstadiet hos XXY-möss och vid pachynema hos XYY-möss (fig. S2). Spermatogenesen var normal hos euploida XY BVSC-transgena syskon.

Nästan etablerade vi fibroblaster från SCT och kontroll XY- och XX-möss (fig. 1A). DNA- fluorescens in situ-hybridisering (DNA-FISH) för X-genen Slx och Y-genen Sly bekräftade att passage 4 (P4) SCT- och kontrollfibroblaster hade behållit sina ursprungliga könskromosomkomplement (fig. 1B och fig. S3A). Fibroblasterna omprogrammerades till inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) (10) på ett doxycyklin (Dox)-inducerbart sätt. DNA-FISH utfördes i resulterande P2 iPSCs (fig. 1A).

En hög andel av SCT-deriverade iPSC-linjer uppvisade könskromosomförlust. Från XXY-möss observerade vi XY-, XX- och XO iPSC-linjer (fig. 1, C och E). Incidensen av förlust var likartad för X- och Y-kromosomerna (P = 0,062, Mann-Whitney-test). Från XYY-möss observerade vi XY- och XO iPSCs (fig. 1, D och E). Förlusten av Y-kromosomen hos XYY-hannar inträffade med en liknande frekvens som den som observerades för X- och Y-kromosomen tillsammans hos XXY-hannar (P = 0,089, Mann-Whitney-test). Vi jämförde sedan förekomsten av könskromosomförlust mellan SCT-derivat och euploida XY- och XX-derivat iPSCs. Könskromosomförlust var vanligare i SCT- än euploida iPSC:er som härstammar från SCT (fig. 1E), oavsett vilken gräns som användes för att definiera könskromosomförlust (fig. S12D).

Könskromosomförlust skulle kunna inträffa under omprogrammering av SCT-celler eller under iPSC-förökning till P2, vilket kanske skulle ge en proliferationsfördel för de resulterande euploida cellerna. Könskromosominstabilitet har faktiskt observerats i pluripotenta stamceller (11, 12). För att testa den senare hypotesen analyserade vi könskromosomstabiliteten mellan P2 och P6 i iPSC:er med mycket föräldraliknande (>90 %) komplement (fig. S4A). Vi observerade förlust av könskromosomer i XX- och XXY iPSC-linjer (P < 0,01 respektive 0,05; Wilcoxon signed-rank test) men inte i XY- och XYY iPSC-linjer (P = 0,21 respektive 0,66; Wilcoxon signed-rank test). Ingen iPSC-linje uppvisade dock mer än en 15-procentig minskning av föräldrakomplementet (fig. S4B). Dessutom var könskromosomförlusten mellan P2 och P6 inte trisomibaserad (fig. S4B). SCT-avledda euploida XY iPSC:er uppvisade inte heller någon proliferativ fördel jämfört med XXY- eller XYY iPSC:er (fig. S5). Eftersom SCT-fibroblaster också var karyotypiskt stabila (fig. 1B och fig. S3A) induceras sannolikt kromosomförlust under iPSC-reprogrammering och skiljer sig därmed från könskromosominstabilitet i pluripotenta stamceller (11, 12). Vi hänvisar till fenomenet som trisomibaserad kromosomförlust (TCL).

Vi fastställde därefter om euploida XY iPSC som härrör från SCT-fibroblaster skulle bilda funktionella spermier. Vi valde ut mycket euploida (≥80 % av cellerna XY) P6 iPSCs som anpassats till Dox-fritt medium (fig. S6). För våra XYY-experiment användes endast XY iPSC-linjer som behöll vildtypen Y snarare än Yd1-kromosomen för PGCLC-experiment (fig. S7). Karyotypering bekräftade att alla SCT-avledda XY iPSC-linjer och en kontroll XY iPSC-linje var euploida (fig. S8). Dessa iPSC-linjer differentierades (6) genom ett epiblastliknande tillstånd för att skapa PGCLC-aggregat som var positiva för BV och SC (fig. 2A). BV-positiva PGCLC (tabell S1) isolerades genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) (fig. 2B) och transplanterades in i könscellsbristande W/Wv (Kit-mutant) testiklar (13).

Spermatogenesen hos mottagarna utvärderades 9 till 10 veckor efter transplantationen. Teratom, som observeras efter iPSC-derivat PGCLC-transplantation (6), förekom i 29 % av XXY-derivat och 50 % av XYY-derivat transplanterade linjer (fig. S9). Återskapande av spermatogenesen, som avslöjades genom närvaron av spermatogena kolonier (fig. 2C) och genom histologi (fig. 2D), observerades för alla XXY- och XYYY-avledda iPSC-linjer som användes (tabell 1). Således kan SCT-avledda XYY iPSCs differentiera till könsceller in vitro och fullborda spermatogenesen efter transplantation.

Vi frågade oss om spermier som skapats via transplantation kunde stödja reproduktion. Intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) med hjälp av spermier från två XXY- och två XYYY-deriverade XY iPSC-linjer (fig. 2E och fig. S10A) genererade zygoter som utvecklades till tvåcellsembryon in vitro (effektivitet 76.7 till 87,3 %) (fig. 2F, fig. S10B och tabell S2) och grovt normala avkommor när de transplanterades till mottagare (effektivitet 46,9 till 59,4 %) (fig. 2G, fig. S10C och tabell S2). Genotypning med polymeraskedjereaktion bekräftade att avkomman härstammade från de transplanterade PGCLC:erna (fig. S10D). Valpar från XXY- och XYYY-avledda iPSC-linjer uppvisade en jämförbar tillväxt med dem som härstammade från kontroll XY iPSCs (fig. S10E). Det är särskilt värt att notera att de XXY- och XYYY-avledda valparna hade euploida (XY eller XX) komplement (fig. S11). Tre mogna hanar och tre honor från varje XXY- och XYYY-avledd iPSC-linje parades med varandra, och alla var fertila (fig. 2H och fig. S10F). Således ger spermier från SCT-deriverade XYY iPSCs upphov till kromosomalt normala, friska och fertila avkommor.

Vi undersökte om TCL är specifik för trisomi av könskromosomer. Eftersom musmodeller med trisomi för en komplett autosom inte finns tillgängliga (14) upprepade vi våra experiment i hanar med Tc1 transkromosomiska möss, en modell för Downs syndrom med en accessorisk mänsklig kromosom 21 (hChr.21) (15). Tc1-möss bär på en hChr.21-införd neomycinresistenskassett, vars selektion minskar hChr.21-mosaikism (15). Vi anrikade därför först vuxna Tc1-fibroblaster för närvaro av hChr.21 med hjälp av neomycinanalogen G418 (fig. 3A). DNA-FISH visade att den stora majoriteten (≥96 %) av Tc1-fibroblasterna behöll hChr.21 (fig. 3B och fig. S3B). Dessa Tc1-fibroblaster omprogrammerades utan G418-selektion och de resulterande iPSC:erna analyserades vid P2. Tio av de 16 iPSC-linjer som genererades (62,5 %) uppvisade förlust av hChr.21 i ≥10 % av cellerna (fig. 3, C och D, och fig. S12D). Efter avlägsnande av G418 bibehölls däremot hChr.21 i Tc1-fibroblaster som odlats under samma period som användes för iPSC-reprogrammering (18 dagar) och i P6 iPSC-linjer som hade mycket föräldralösa (>90 % hChr.21-positiva) komplement vid P2 (fig. S12, A och B). Vi drar slutsatsen att förlusten av hChr.21 i Tc1-celler främjas av omprogrammering snarare än av avlägsnande av G418 och därför att TCL också påverkar en accessorisk kromosom.

Nästan frågade vi om TCL förekommer i mänskliga celler. Fall av kromosomförlust har observerats under mänsklig trisomisk cellkultur (16, 17), men dess prevalens och relation till omprogrammering har inte analyserats systematiskt. Vi valde mänskliga Klinefelters syndrom, Downs syndrom och euploida XY- och XX-fibroblastlinjer som uppvisar minimal mosaikism (fig. S13, A och D), omprogrammerade dem och bestämde kromosomkomplementen hos de resulterande iPSC-linjerna. Vi observerade XY- och XX iPSC från fibroblaster med Klinefelters syndrom och euploida iPSC från fibroblaster med Downs syndrom (fig. S13, B, C, F och G). Kromosomförlust var vanligare i trisomiska än i disomiska celler, vilket visar att TCL också förekommer under mänsklig omprogrammering. Frekvensen av högt euploida iPSC-linjer var dock lägre än den som observerades i trisomiutsprungna iPSC från mus (fig. S13, F till H).

Vi har visat att TCL producerar euploida iPSC från SCT och autosomalt trisomiska möss och patienter (fig. S12E). Hos möss kan de resulterande ”korrigerade” iPSC:erna bilda funktionella spermier, vilket möjliggör produktion av kromosomalt euploid avkomma från infertila SCT-individer. TCL kompletterar befintliga iPSC-terapier för kromosomavvikelser (17-21). De mekanismer som orsakar TCL är okända. Cellulär stress i samband med omprogrammering kan selektera mot trisomiska celler och möjliggöra uppkomsten av euploida celler. Vi observerade mindre frekventa TCL i mänskliga celler än i musceller (fig. S12D och S13H). Även om de är sällsynta kan TCL erbjuda behandlingar för infertila SCT-patienter för vilka alternativa tillvägagångssätt är misslyckade. Den kliniska användningen av mänskliga könsceller som framställts in vitro bör dock noggrant övervägas etiskt och juridiskt (22-24). Dessutom måste fullständig spermatogenes in vitro utvecklas för att undvika risken för teratombildning till följd av könscellstransplantation.

TCL gör det också möjligt att producera kvinnliga iPSC från män, vilket ger potential för genetisk dissektion av sexuella dimorfismer (25). Genom att skapa isogena iPSC-linjer som endast skiljer sig åt med avseende på deras könskromosomer kan könsskillnader som identifieras under iPSC-sjukdomsmodellering tillskrivas X- eller Y-kromosomala effekter.