Nästan leder bedömningen av spermatozoernas morfologi efter en femton minuters inkubation med DNas I till en statistiskt signifikant ökning av andelen normala spermatozoer från 5,468 % till 7,25 %, p = 0,0197, vilket illustreras i figur 6. Samtidigt minskade huvudets avvikelser från 81,75 % till 74,937 % (p=0,0004) medan halsens avvikelser minskade från 22,062 % till 19,343 % (p=0,0197). Svansavvikelser och cytoplasmatiska droppar följer samma mönster. Till följd av dessa förändringar i morfologin är det rimligt att observera en stor inverkan på teratozoospermiaindexet (TZI). Som framgår av figur 6 minskade det från 1,205 till 1,084 (p<0,0001).

Figur 6

4. Diskussion

I den här studien antog vi att spermans hyperviskositet har sitt ursprung i NETs. De presenterade uppgifterna visar att det är möjligt att smälta det extruderade DNA:t från NETs, vilket leder till att spermatozoernas motilitet förbättras. Den enzymatiska nedbrytningen av DNA från seminalplasma undersöktes i syfte att öka motiliteten hos spermatozoer och därmed göra dem lämpliga för användning i ART. Användning av DNase I efter att spermier har blivit flytande resulterade i en förbättring av både motilitet och morfologi hos spermier. Flera inkubationstidpunkter användes för att uppnå de bästa resultaten, som erhölls efter 15 minuters inkubation. Målet med studien var att förbättra utbytet av intrauterin insemination i kohorten av subfertila män vars spermier kännetecknas av hög viskositet, troligen på grund av hinder orsakade av extruderat DNA. Användningen av DNase I förbättrade dessutom den onormala morfologi som vanligtvis förekommer tillsammans med hög viskositet. Anrikningen av spermier utvärderades också enligt det slutliga antalet isolerade, både snabba och långsamt progressiva spermier.

Den statistiskt signifikanta förbättringen av spermiernas morfologi efter behandling med DNase I kan tyda på att dessa abnormiteter materialiseras efter ejakulationen och bibehålls på grund av hög viskositet. Med tanke på att hyperviskös sperma har minskad total antioxidantkapacitet , kan närvaron av spermatozoer i denna miljö inducera lipidperoxidation och DNA-skador och så småningom försämrad morfologi . Åtminstone några av dessa morfologiska avvikelser visade sig vara reversibla genom DNase I-behandling. Denna förbättring tyder på optimal tillämpning av ovanstående behandling i fall där det inte finns ett så stort krav på ett stort antal direktmotila spermatozoer, som vid intrauterin insemination, men där det finns krav på bästa möjliga morfologi, som vid antingen IVF eller ICSI-förfarandet för befruktning .

Våra resultat avslöjar att tillämpning av DNase I endast är effektiv i närvaro av hyperviskositet. Som figur 2(b) visar, i avsaknad av hyperviskositet gör DNase I-användning det inte. Specifikt under normal viskositet och oavsett spermatozoernas motilitet resulterade enzymdigestion inte i någon statistiskt signifikant skillnad i någon av de undersökta parametrarna. I kohorten med hyperviskös sperma resulterade tvärtom användningen av enzym i en förbättring av PR-motiliteten på ett statistiskt signifikant sätt, vilket framgår av figur 2 a). Dessutom fanns det inga skillnader i spermatozoernas motilitet och morfologiska återhämtning i HV-gruppen enligt svår eller måttlig viskositet även om antalet spermaprover med svår viskositet var lågt. Som framgår av figur 5 är dessutom den statistiskt signifikanta skillnaden efter DGC-beredning mellan gruppen med hög viskositet (HV-d) och gruppen med normal viskositet (w/oV-d) 0,0179, vilket tyder på att en förbättring kan uppnås. Dessutom, i samma figur, resulterade utbytet av den kombinerade behandlingen (HV-DNase-d) i en återhämtning av en procentandel PR-spermatozoer, som nådde upp till nivån för motsvarande spermatozoer hos män med hög viskositet (HV) före behandlingen, eftersom den slutliga procentandelen PR (29,782 %, HV-DNase-d) i det första fallet inte har någon statistisk skillnad från den initiala PR (26,478 %, HV före behandlingen), p=0,4480. Betydelsen av detta kombinerade tillvägagångssätt, även om det minskar utbytet jämfört med enbart DNasbehandling (p<0001 mellan HV-d och HV-DNase), underbyggdes av det faktum att densitetsgradientbehandlingen subtraherade från de återvunna spermiernas motsvarigheter i klasserna c) och d) och därmed renade dem. Däremot var motsvarande statistiska skillnad mellan utbytet av DGC-preparatet (HV-d, 18,519 %) och ”HV före behandling” (26,478 %) signifikant (dvs. p=0,0322).

Det skulle dessutom kunna ersätta den mekaniska behandlingen av hyperviskös sperma; det är alltså vanligt att den späds ut eller dras in i en hypodermisk nål och tvingas igenom för att övervinna den förhöjda viskositeten. Även om dessa metoder sannolikt inte är effektiva eftersom denna typ av behandling ökar ROS-produktionen . Dessutom är hyperviskositet negativt korrelerat med kromatinintegritet som defekt dekondensering, vilket redan har noterats .

I allmänhet har tillämpningen av DNase I i luftvägarna redan godkänts medicinskt av FDA i fallet med cystisk fibros . DNas är dessutom en naturlig komponent i spermaplasma vars roll förmodligen är att späda ut NETs som bildas i den kvinnliga reproduktionsbanan efter rekrytering av neutrofiler som svar på inflammation, och det föreslagna förfarandet är potentiellt medicinskt tillämpbart inom ART. Dess roll förstärks också av det faktum att dess frånvaro har negativa effekter på inseminationen hos primater.

Hyperviskositet orsakas troligen antingen av inflammation eller av någon dysfunktion i sädeskörtlarna, även om den exakta mekanismen inte är klar. Det kan vara förknippat med virusinfektioner i genitala trakter som tidigare visats av vårt laboratorium . Flera terapeutiska protokoll har tillämpats för att minska viskositeten hos sperma, men resultaten har sällan varit uppmuntrande . Metoder som överhydrering och prostatamassage har inte gett de förväntade resultaten. Användningen av proteolytiska enzymer som alfa-chymotrypsin gav hoppfulla resultat, men dess användning har inte antagits .

I en annan studie användes DNase I för att minska viskositeten, men de slutliga resultaten var inte framgångsrika i detta avseende. Författarna studerade inte kvalitativa spermieparametrar, dvs. motilitet. Dessutom var inkubationstiden mycket längre (en timme) än den vi föreslog (femton minuter), så den neutrala effekten på viskositeten kan möjligen tillskrivas den förlängda inkubationen av enzymet med spermaplasman.

Till sist, trots uppgifterna om att semens hyperviskositet har korrelerats med inflammation i de manliga könsorganen, dvs, sädesblåsor, vilket har lett till användning av antibiotika och antioxidanter, kunde dessa terapiformer behandla detta tillstånd endast i de fall där huvudfaktorn var inflammation. Vanligtvis orsakas det av olika faktorer som verkar synergistiskt och därför finns det ingen direkt orsakande terapi för hyperviskositet .

När de utsätts för inflammatoriska stimuli utövar neutrofiler, den huvudsakliga leukocytpopulationen i sperma, sin skyddande roll via inaktivering av bakterier genom fagocytos och efterföljande avdödning genom exponering för proteolytiska enzymer och ROS. Ett andra sätt för neutrofiler att neutralisera patogener är genom produktion av neutrofila extracellulära fällor (NETs) . NETs är tredimensionella fibrösa nätverk, huvudsakligen bestående av kromatin, som kan fånga och immobilisera mikroorganismer. NETs har visat sig vara känsliga för DNase men inte för proteasnedbrytning . Eftersom bildandet av NETs är DNA-baserat och seminalt DNas har visat sig smälta extruderat DNA och frigöra intrasslade spermatozoer, antog vi att användning av exogent DNas skulle kunna visa sig vara en värdefull behandling i fall av seminal hyperviskositet som huvudsakligen orsakas av förekomsten av extracellulärt, exponerat DNA från neutrofiler.

Från patofysiologisk synvinkel har konceptet som tillskriver hyperviskositet till inflammation nästan etablerats. De inflammatoriska reaktionerna omfattar NET-bildning från neutrofiler för att fånga upp mikroorganismer. Det är mycket troligt att spermatozoerna förbrukar mycket energi för att försöka frigöra sig från NETs och följaktligen är studiet av deras oxidations- och apoptotiska status av stor betydelse. Dessutom är den ”fångstverkan” som redan har beskrivits en följd av att spermatozoerna rör sig förebyggande på grund av att de är intrasslade i NETs.

I den här studien försökte vi lysera det extracellulära DNA:t i seminalplasma, som är den viktigaste komponenten i NETs, med DNase I i syfte att frigöra dem från NETs och återfå spermatozoernas kvalitetsparametrar, det vill säga motilitet och morfologi. Som figur 1 visar finns det dessutom en statistiskt signifikant skillnad mellan koncentrationen av WBC och viskositetsgraden. Den föreslagna behandlingen är begränsad till postjakulationsfasen och inte till den kliniska. Dessutom verifierades den ursprungliga hypotesen att spermiernas ökade viskositet var ett resultat av förekomsten av DNA i sperman, även om ytterligare studier behövs för att bekräfta denna hypotes. Med hänsyn till att rekryterade neutrofiler bildar NETs till inflammerade platser, antog vi att DNA i sperma kommer från neutrofiler. Även om vi inte har presenterat något direkt bevis som stöder detta antagande anser vi att den viktigaste möjliga källan till DNA enligt vår kunskap är neutrofilernas kromatin som extruderas vid inflammation.

5. Slutsatser

Våra studieresultat stöder slutsatsen att DNase I-behandling ger en statistiskt signifikant förbättring av spermiernas motilitet och morfologi. Den förbättrar grundläggande spermieparametrar för ART, dvs. motilitet och morfologi, endast när det gäller hyperviskös sperma. Dessutom tyder våra resultat på att en huvudorsak till SHV är bildandet av NETs och vi föreslår därmed den terapeutiska potentialen och nyttan av detta tillvägagångssätt.

Data Tillgänglighet

Data som används för att stödja resultaten i denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.

Etiskt godkännande

Alla förfaranden som utfördes i den här studien och som involverade mänskliga deltagare var i enlighet med de etiska normerna från Bioethics and Deontology Commission, National Kapodistrian University of Athens, Faculty of Medicine, som godkändes i januari 2014 (referensnummer: 1130).

Samtycke

Alla patienter gav sitt informerade samtycke innan de deltog i studien.

Intressekonflikter

Alla författare förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Författarnas bidrag

Angelos D. Gritzapis och Vassilis Tsilivakos utformade studien. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis och Vassilis Tsilivakos har gjort datainsamlingen, deltagit i utformningen av studien och utarbetat manuskriptet. Effrosyni Nosi utförde immunoanalyserna och Angelos D. Gritzapis utförde den statistiska analysen. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti och Vassilis Tsilivakos deltog i analys och tolkning av data. Alla författare läste och godkände den slutliga versionen av manuskriptet.

Acknowledgments

Detta projekt finansierades av Clinical Diagnostic Laboratory, Locus Medicus S.A.

.