Resultat och diskussion

Strukturer och energier för olika muterade modellsystem av KSI har undersökts längs tre reaktionssteg: För det första, abstraktion av C4-β-proton (ES → TS1 → EI1), för det andra, liten rotation av protonerad Asp-40 (EI1 → TS2 → EI2) och för det tredje, protondonation till C6-β-positionen av Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), som visas i Fig. 1. Den förutspådda energiprofilen för WT (fig. 2A) liknar den motsvarande experimentella profilen från Pollack och medarbetare (25). Det bör noteras att vid TS2 är substratet delvis neutraliserat eftersom de katalytiska resternas H-atomer närmar sig oxyanjonen (O3) i substratet och överskottselektronen överförs från substratet till de intilliggande katalytiska resterna genom H-bindningsvägarna. Substratet, Tyr-16/57 och Asp-103 delar således en negativ laddningsenhet, och deras laddningsfördelningar beror på protonaffiniteten och elektronaffiniteten hos de katalytiska resterna i mutanterna. Detta TS2-tillstånd med katalytiska rester står i kontrast till det utan katalytiska rester där substratet är negativt laddat med nästan en enhet.

Våra beräknade tredimensionella strukturer av EIs (komplexerade med equilenin i stället för steroid) stämmer nästan exakt överens med röntgenstrukturerna av PI(g′) och TI(g′). I den förutspådda strukturen för Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin-komplexet stämmer de två avståndsvärdena för d(O3-Or) för Tyr-16 och Asp-103 (2,54 respektive 2,55 Å) väl överens med röntgendata (2,6 ± 0,1 Å för båda när det gäller PI och 2,58 ± 0,08 Å respektive 2,62 ± 0,07 Å när det gäller TI) (32, 33, 36). Eftersom de beräknade strukturerna optimerades utan begränsningar tyder överensstämmelsen mellan experimentella och teoretiska geometrier på att nyckelresterna i enzymet har nästan maximala interaktioner med substratet utan att det uppstår spänningar.

Det har gissats att TI:s aktiva plats i lösning kan ha den dyadiska strukturen (Asp-99… Tyr-14… ekvilenin) (29), som skiljer sig från TI:s och PI:s röntgenstrukturer (32, 33). Ett nyligen genomfört NMR-experiment för PI/equilenin har dock visat att i PI(D40N)/equilenin uppträder en karakteristisk stark nedåtriktad resonans vid 16,8 ppm och en svag resonans vid 13,1 ppm (36), vilket liknar fallet med TI/equilenin från grupperna Mildvan (29) och Pollack (25). Detta resultat visas också av våra ab initio-beräkningar av Tyr-16/57 + Asp-103 + equileninkomplexet, där den starka downfieldresonansen vid 16,5 ppm tilldelas Tyr-16. Experimentet visar också att i mutanten D103L + D40N uppträder en stark resonans i det nedre fältet (som tilldelas Tyr-16), medan den starka resonansen försvinner i mutanten Y16F + D40N. Detta experiment utesluter alltså tydligt den dyadiska strukturen där den starka down-field-resonansen tilldelades Asp-103, som är H-bunden till Tyr-16 (36).

De absoluta hastighetskonstanterna kan undersökas med hjälp av de beräknade aktiveringsbarriärerna. På B3LYP/6-31+G*- och MP2/6-31+G*-nivåerna är aktiveringsbarriären för WT av KSI något underskattad, jämfört med den experimentella barriären (10 till ≈11 kcal/mol) som rapporterats av Pollack och medarbetare (46). När hänsyn tas till KSI:s dielektriska mediumeffekt (31) är dock aktiveringsbarriären för WT 8,2 kcal/mol, vilket stämmer väl överens med det experimentella värdet. En liten underskattning med 2-3 kcal/mol skulle kunna förklaras med en noggrannare beräkning och ett mer komplett modellsystem som inkluderar apolära rester runt den aktiva platsen. I motsats till den absoluta aktiveringsbarriären är de relativa aktiveringsbarriärerna mellan olika mutanter och därmed reaktionsmekanismen ganska konsekventa oavsett beräkningsnivå på grund av annulleringseffekten mellan olika modellsystem med liknande miljöer. Genom att använda relativa aktiveringsbarriärer mellan olika mutanter fick vi således fram den relativa reaktiviteten (förhållandet mellan den kinetiska hastighetskonstanten för en mutant och den för WT) eller log(kcat/kcat(WT)) med antagandet att överföringen från ES till TS1 är det hastighetsbestämmande steget längs reaktionsvägarna (se fotnoten i tabell 1). MP2-beräkningar förstärker de resultat som erhållits på B3LYP-nivå. De förutspådda värdena för log(kcat/kcat(WT)) stämmer väl överens med de värden som uppmätts för PI (32-35) och TI (25-28, 31) (tabell 1). Med tanke på att den mycket homologa tredimensionella strukturen (tertiär och kvartär) och miljön på den aktiva platsen för TI liknar PI:s, förväntas de katalytiska reaktionerna i de två KSI:erna gå till på samma sätt.

Fig. 2 visar profilerna för energier och H-bindningsavstånd för olika mutanter längs reaktionsvägen. De övergripande energiprofilerna (ΔE) (fig. 2A) är nästan symmetriska med avseende på TS2. Barriärerna för det första och tredje steget är likartade. Det andra steget, som har en liten barriär (≈1 kcal/mol), kan inte vara hastighetsbestämmande eftersom det endast innebär en liten förskjutning av H-atomen genom en minimal rotation (med endast några grader eftersom Asp-40 är starkt lutande mot substratplanet) kring en C-C-bindning (eller C-H-bindning i figurerna 1 och 3). Reaktionen kan därför praktiskt taget betraktas som en tvåstegsmekanism. Resterna katalyserar det första steget genom att (delvis) donera en proton till substratet (som en syra), medan det tredje steget katalyseras genom att (delvis) ta emot en proton från substratet (som en bas). Se H-bindningarnas interoxygenavstånd och det excentriska avståndet för en delad proton från O3:s och Or:s mittpunkt, där det positiva/negativa värdet anger att protonen befinner sig nära resterna/substratet.

För sura rester med lägre protonaffinitet (pA i gasfasen eller pKa i det dielektriska mediet) skulle aktiveringsbarriären vara lägre för det första steget och högre för det tredje steget, medan basiska rester med högre pA eller pKa skulle ge en motsatt effekt. I enzymmekanismen i två steg erhålls följaktligen den optimala katalytiska kraften när enzymresterna spelar en dubbel roll som mycket stark protondonator/acceptor till/från substratet alternativt (som benämns amfisyra/baskatalysator eller proton/elektronbuffert) för den totala reaktionen. I enzymernas dielektriska medium erhålls den maximala katalytiska effekten när resternas och substratets pKas är lika stora. Denna situation står i kontrast till enstegsreaktioner där en stor skillnad i pKa ökar reaktiviteten (47, 48). Villkoret med lika pKas mellan rester och substrat för maximal katalytisk effekt stämmer överens med kravet på att resterna i enzymet ska ha likvärdiga pKas med substratet för att bilda maximala SSHB:er (4-7, 15, 23, 24). I KSI:s tvåstegsreaktionsmekanism spelar således SSHB:erna som amfisyra/baskatalysatorer tillsammans med partiella protonförflyttningar och laddningsomfördelningar en avgörande roll för att starkt stabilisera EI:erna med ≈15 kcal/mol i reststyrd stabiliseringsenergi och i reaktionsvägsberoende interoxygenavståndsförkortning i förhållande till ES-tillståndet .

Den restdrivna stabiliseringsenergin ΔΔEa är i viss mån korrelerad till ΔdES om inte protonöverföringen sker från rest till substrat (dvs, om inte ΔrH ligger i ett negativt område i figur 2C). Därför kan stabiliseringen vid EIs och TSs korreleras till förkortningen av H-bindningsavståndet, och därmed H-bindningsstyrkan, i förhållande till ES-tillståndet. Det vill säga, de normala (eller vanliga) H-bindningarna (mellan neutrala partners) vid ES tenderar att bli SSHB-bindningar (som involverar joniska arter) vid EIs och TS2. Dessa korta bindningar bör således vara ansvariga för en del av den residualdrivna energisänkningen. När det gäller protonöverföringen är potentialen vid ES en enkel brunn för alla mutanter, medan potentialformen (nära EIs eller TSs) i det område där ΔrH är nära noll (dvs. runt TS1/EI1 för c och EI1/TS2 för e och f i fig. 2C) har vissa kännetecken av en dubbelbrunn. För ett litet absolut värde på ΔrH (<≈0,5 Å) (fig. 2C) visar sig barriären för protonöverföring vara mycket liten i vår beräkning, och därför kan protonöverföringarna i potentialen av dubbelbrunnstyp inte ensamma förklara den drastiska sänkningen av aktiveringsbarriären. Faktum är att fall g, där potentialens egenskaper av typen dubbelvälta nästan försvinner med liten protonöverföring, visar en större energisänkning än fall f, som innebär protonöverföring i en potential av typen dubbelvälta. Å andra sidan bör det noteras i figur 2 D och E att ΔdES inte längre förkortas utan förlängs något efter protonöverföringarna, medan ΔΔEa fortfarande sänks. Enbart förkortningen av H-bindningslängden (dvs. ΔdES) kan alltså inte förklara den drastiska barriärsänkningen vid TS och EI (dvs. ΔΔEa). Barriärsänkningen vid TSs och EIs måste således förklaras av ytterligare interaktionskrafter, som kommer att diskuteras i termer av molekylära orbitala (MO) interaktioner mellan substrat och rester (som inbegriper laddningsöverföringsinducerade elektroniska omarrangemang eller laddningsomfördelningar).

Ifall det finns två konkurrerande rester som i f och g, resulterar den kumulativa stabiliseringen av EIs/TSs i en mer förbättrad kcat. Denna effekt är dock något subadditiv (dvs. mindre än summan av stabiliseringsenergierna för varje rest) som ett resultat av den minskade proton-återkallande kraften hos oxyanjonen för varje rest på grund av den andra resistensens närvaro. Denna subadditivitet tyder på att SSHB:erna skulle inbegripa laddningsöverföringar och polarisering (dvs. inducerade elektrostatiska interaktioner) och eventuellt partiell kovalent bindning. Stabiliseringen av EI och TS i närvaro av katalytiska rester beror i själva verket huvudsakligen på delokalisering av den överskottselektron som finns på den aktiva platsen genom laddningsöverföring och polarisering, vilket kommer att framgå nedan. De effektiva populationsladdningarna (49) för substratets naturliga bindningsorbitaler i fallen a, c-e och f vid TS1 är -0,57, ≈-0,43 respektive -0,37. Således är substratets negativa laddning mer reducerad i närvaro av två katalytiska rester. Denna minskning beror på överföringen av överskottselektronen från substratet till de katalytiska resterna med stor elektronaffinitet, som spelar en buffertroll för överskottselektronen. Även om Asp har en starkare elektronåterkallande förmåga än Tyr, har Tyr en lägre elektronaffinitet än Asp. Tyr är således lika effektiv som eller något effektivare än Asp när det gäller att sänka aktiveringsbarriären. Stabiliseringen av TS och EI i närvaro av katalytiska rester är starkt korrelerad med energisänkningen av överskottselektrontillståndet , eftersom utrymmet för att rymma överskottselektronen förstoras med katalytiska rester utöver substratet. Denna energisänkning är direkt relaterad till osäkerhetsprincipen; ju mindre lokaliserad överskottselektronen är, desto mer stabiliserad är den.

De beräknade kemiska skiftningarna (δ) visar sig vara något korrelerade med det minsta värdet av d(O3-Or) för samma antal H-bindningar , medan närvaron av den andra H-bindningen ökar δ på grund av den ökade avskärmningseffekten. På grundval av våra resultat kan ett stort värde på δ ofta vara en bra indikator på SSHB, men δ är endast delvis korrelerat med kcat. Denna korrelation minskar särskilt för stor δ (>16 ppm) eller litet absolut värde på ΔrH (<0,5 Å), eftersom kcat:s beroende av δ har ifrågasatts (50).

Den sänkta aktiveringsbarriären i närvaro av katalytiska rester är väl förstådd från MO-analysen (fig. 3). Den slående skillnaden i TS2 MO-energinivåer mellan a och g beror på kvantkaraktären hos den överskottselektrontäthet som ackumuleras på substratet genom deprotonering av Asp-40. Den resulterande stabilisering som erhålls genom att en del av elektrontätheten försvinner till de katalytiska resterna beror på den osäkerhetsprincip som nämndes tidigare och som liknar vad som observeras när en överskottselektron interagerar med vattenkluster (51, 52), vilket talar för ett rimligt stort hålrum. Närvaron av de katalytiska resterna (som spelar laddningsbuffrande roll genom partiell elektronöverföring från substratet till de katalytiska resterna) minskar således drastiskt laddningsuppbyggnaden på oxyanjonen. Denna stabilisering av EIs och TSs stöds i huvudsak av SSHBs. Denna effekt förstärks kraftigt i närvaro av både Asp-103 och Tyr-16/57. MO-energierna i fall g är således mycket lägre än i fall a. Dielektriskt medium-effekten hos enzymet är inte så drastisk som den katalytiska restsubstans-effekten som inbegriper elektronöverföring. Partiella protonshuttles och laddningsomfördelningar som främjas av SSHB är således mer ansvariga för att sänka TS och EI än enzymets dielektriska effekt. Följaktligen är den katalytiska effekten resultatet av en gynnsam kombination av vinster från icke-inducerade elektrostatiska energier och MO-interaktionsenergier (polarisering, laddningsöverföring och kovalent bindningsenergi). Medan den förstnämnda effekten är ett resultat av de partiella protonshuttles på grund av närvaron av laddade H-bindningar (och därmed relaterad till SSHB:s styrka), är den sistnämnda effekten huvudsakligen ett resultat av elektronisk delokalisering på grund av de katalytiska resterna, som spelar en buffertroll för en överskottselektron. MO-interaktionens energivinst är nära relaterad till den extra enzym-substratinteraktion som främjas av SSHB.

Stabiliseringsenergin kan således representeras som summan av den förstärkta energin hos den laddade H-bindningen (som involverar joniska arter) hos EIs/TSs i förhållande till den normala H-bindningen (mellan neutrala partners) hos ES och MO-interaktionens energivinst på grund av laddningsomfördelningar som involverar elektronförlust till de katalytiska resterna. Eftersom de två energitermerna inte är lätta att separera är det svårt att uppskatta varje term. Vi utvärderar dock dessa termer i fall d med hjälp av följande metod. Från jämförelsen av energierna för EI1 i förhållande till ES i frånvaro och närvaro av Tyr-16 (Y16) är stabiliseringsenergin för EI1 genom Y16 8,7 kcal/mol. För att undersöka bidraget från den icke-inducerade elektrostatiska interaktionen (som inte inkluderar den elektrostatiska induktionseffekten av substratet + Asp-40 (D40) på resterna Y16) till stabiliseringen utförde vi beräkningarna av ES och EI1 i det fall då Y16 ersätts av en spökrest som endast består av dess laddningar i det naturliga bindningsorbitalet (NBO) (Y16q), som beräknades för en enda molekyl Y16 i avsaknad av substrat + D40. Därefter är den icke-inducerade elektrostatiska interaktionsenergivinsten (eller preorganisationsdrivna elektrostatiska energivinsten) 4,4 kcal/mol, som är ansvarig för ökad bindningsstyrka hos den laddade H-bindningen (dvs. själva SSHB). Skillnaden i stabiliseringsenergi mellan den fullständiga kvanteffekten genom Y16 och den icke-inducerade elektrostatiska effekten genom Y16q (4,3 kcal/mol) bör alltså komma från den inducerade elektrostatiska interaktionsenergin, den kovalenta energin osv. Den inducerade elektrostatiska interaktionen omfattar polarisations- och laddningsöverföringseffekter. För att få fram den inducerade elektrostatiska energiförstärkningen fick vi först fram Y16:s atomladdningar (Y16qind), vilket inkluderar induktionseffekten i närvaro av substratet + D40. Därefter utförde vi beräkningarna av ES och EI1 i det fall då Y16 ersätts av en spökrest (Y16qind) som endast består av dess atomära punktladdningar. Eftersom denna stabiliseringsenergi är 8,2 kcal/mol är den inducerade elektrostatiska energivinsten från interaktionen mellan substrat + D40 och Y16 3,8 kcal/mol. Energivinsten genom laddningsöverföring och polarisering är således stor och jämförbar med den icke-inducerade elektrostatiska energivinsten. Resterna Y16 spelar viktiga katalytiska roller som laddningsbuffert för att dra tillbaka och behålla en stor del av den överflödiga negativa laddningen i substratet samt för motsvarande elektroniska laddningsomfördelning under reaktionen. Denna inducerade elektrostatiska energi uppstår från MO-interaktionsenergin genom den kvantmekaniska elektroniska laddningsinteraktionen mellan den katalytiska resterna (Y16) och substratet + D40 (dvs. den SSHB-drivna substrat-residue-interaktionsenergin). Slutligen kan det återstående energibidraget på 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol till största delen motsvara den icke-elektrostatiska kovalenta energin. Denna energi är ganska liten, vilket ytterligare bekräftas av vår MO-analys som visar att den icke-elektrostatiska orbitalöverlappningen i själva SSHB inte är signifikant.

I enzymer som involverar en tvåstegsreaktionsmekanism är ett substrat inte helt negativt laddat, utan delvis anjoniskt med elektrondissipation till de katalytiska resterna. Således visar sig i detta fall stabiliseringsenergiökningen (≈10 kcal/mol vid EI1) som drivs av SSHB i förhållande till den normala H-bindningen inte vara liten . Om SSHB-energin utvidgas till att omfatta substratresidueinteraktioner på grund av laddningsomfördelningar i både substrat och rest, är det stabiliseringsenergin som är summan av den förorganisationsdrivna SSHB-energin och den SSHB-drivna MO-interaktionsenergin. Om vi emellertid endast tar hänsyn till styrkan hos själva SSHB:n är ökningen av bindningsenergin mycket mindre (till ≈5 kcal/mol).