Proteiner måste interagera med andra proteiner för att bilda funktionella komplex. I många fall kan man inte förstå proteinernas funktion i cellerna utan information om proteinets struktur och kunskap om i vilket komplex proteinet befinner sig.1, 2 Detta är till exempel av yttersta vikt för proteiner som modulerar epigenetisk information på DNA. Nästan alla dessa kromatinmodifierande proteiner kräver intensiv interaktion med metaboliska enzymer som tillhandahåller de kofaktorer som behövs för histonacetylering, deacetylering eller metylering och demetylering.3-5 Detta visar på behovet av att studera ett visst proteins komplexa miljö för att analysera dess funktion och aktivitetstillstånd. Korslänkning av proteiner i kombination med analys genom masspektrometri (XL-MS) är en idealisk metod för att få information om proteinstrukturen och sammansättningen av proteinkomplex.6-9 För XL-MS krävs specialiserade kemiska reagenser, tvärbindare, som kan koppla samman proteinrester som befinner sig i nära anslutning till varandra, t.ex. i ett komplex.10, 11 Karaktäriseringen av de tvärbundna peptiderna med hjälp av masspektrometri är dock en formidabel utmaning av två anledningar. För det första måste man identifiera tvärbindningar genom att analysera fragmentjoner från inte bara en utan två sammanlänkade peptider, vilket gör MS2-spektren mycket komplicerade. För det andra har de tvärbundna peptidarterna endast en mycket låg abundans och ingår i en peptidblandning som till överväldigande del domineras av icke tvärbundna peptider. I många fall leder detta till en dramatisk informationsförlust som försvårar en korrekt identifiering av korslänkar och därmed en interactomanalys. Några tvärbindningsreagenser har utvecklats, som introducerade MS-spaltbara grupper och möjligheten till XL-anrikning för att ta itu med dessa problem.12-18

Här rapporterar vi utvecklingen av en ny tvärbindningsreagens som är anrikningsbar och har klyvningsegenskaper som möjliggör noggrann tvärbindningsidentifiering. Den utformade cliXlink (1) visas i figur 1. Det cellpermeabla reagenset (figur 1 A och figur S1 i stödinformationen) har två succinimidylesterenheter som kan reagera med nukleofiler i proteiner och som är placerade med ungefär 9 Å mellanrum, vilket gör det möjligt att fixera korta avstånd för att få strukturell information om proteiner och att fånga upp proteiner som befinner sig nära varandra. Effektiv MS-klyvbarhet säkerställs av den väletablerade sulfoxidgruppen, som kan klyvas under lågenergi kollisionsinducerad dissociation (CID) före peptidfragmentering. Dessutom gör en alkynenhet det möjligt att fästa en anrikningsenhet, t.ex. biotin, på de tvärbundna platserna med hjälp av CuAAC-reaktionen.19

Tillämpningen av tvärbindaren kan följa det arbetsflöde som visas i figur 1 B. Det innebär att reagens 1 tillsätts till ett komplext proteom, vilket fixerar avståndsinformationen i nativt tillstånd för peptider som befinner sig i nära anslutning till varandra och bevarar den genom hela det vidare arbetsflödet för MS-analys. Fastsättning av affinitetsgruppen för anrikning sker efter tvärbindningen för att undvika störningar från skrymmande anrikningsgrupper. Genom att modifiera de tvärbundna peptiderna på proteinnivå kan överskott av småmolekylära reagenser lätt avlägsnas genom acetonutfällning. Detta följs av enzymatisk nedbrytning av proteinerna. De tvärbundna peptiderna märks på detta sätt, t.ex. med biotin, vilket gör det möjligt att anrika dem. Därefter analyseras de med hjälp av masspektrometri. Eftersom de enskilda peptidmassorna i en tvärbindning inte är omedelbart tillgängliga är det svårt att fastställa tvärbindningen, särskilt i komplexa prover. Detta kräver användning av MS-spaltbara reagenser som underlättar MS2-identifiering genom att bilda specifika fragmentjoner.20, 21 I bästa fall bör reagensen också möjliggöra MS3-experiment, vilket kräver att tvärbindaren klyvs före peptiderna. Detta gör att peptiderna kan separeras för individuell MS3-baserad identifiering. Vårt reagens 1 innehåller β-vätgasatomer på båda sidor av sulfoxiden, så att fragmenteringen sker i två riktningar, vilket visas i figur 1 C. Detta leder till en ren separation av peptiderna (α, β) och genererar två fragment för varje peptid: ett alken- och ett sulfensyrefragment; det senare bildar en thial vid vattenförlust. Detta ger två masspar med ett karakteristiskt Δm/z≈32. Viktigt är att vi observerade att fragmenteringsväg a (figur 1 C) dominerade. För α-peptiden är därför alkenfragmentet och för β-peptiden thialfragmentet de viktigaste klyvningsprodukterna. På grund av de asymmetriska klyvningsegenskaperna behålls större delen av signalintensiteten på ett fragment per peptid, vilket bör ge utmärkt känslighet i MS3-experiment.

Syntesen av reagens 1 är enkel (schema 1). Utgångspunkten är den oxiderade disulfiddimeren av homocystein 2, som behandlas med 4-pentynonsyra för att ge disulfid 3. Reduktiv klyvning av disulfiden och alkylering av de genererade tiolerna med metyl 3-bromopropionat ger upphov till sulfidförening 4. Saponifiering av båda metylestrarna till 5 och omvandling av 5 till aktiverad bissuccinimidylester 6, följt av oxidation av thioetern till sulfoxid, ger reagens 1 med en total avkastning på 16 %. Det är särskilt viktigt att reagensen är mycket ren och att de reaktiva esterenheterna finns på plats på båda sidor. Partiell hydrolys måste undvikas. Detta säkerställdes genom en slutlig fällningsrening. Reagens 1 löstes i en blandning av etylacetat och diklormetan och fälldes efter tillsats av hexaner.

Vi undersökte därefter MS-egenskaperna hos 1. För detta ändamål tillsatte vi 1 till det vanligen använda modellproteinet, bovint serumalbumin (BSA). Vi följde det arbetsflöde som beskrivs i figur 1 B utan att utföra anrikningssteget. Kort sagt, efter tillsats av 1 till proteinlösningen och reaktion i 1 timme vid rumstemperatur och fysiologiskt pH fällde vi proteinet med aceton, resuspenderade det i buffert (se stödinformation) och smälte proteinet därefter med en blandning av trypsin och Lys-C.

Den erhållna peptidblandningen avsaltades med C18 Tip-kolonner och analyserades med hjälp av HPLC-MS2 (figur 2). Figur 2 A visar två tvärbundna BSA-peptider (α+β) som exempel. Efter att ha bestämt den intakta tvärbindningens exakta massa (m/z 677,1; figur 2 B) utförde vi både CID- och HCD-fragmentering på prekursorn för att utvärdera fragmenteringsegenskaperna (figur 2 C). Mer selektiv CID-fragmentering (resonansexcitering av tvärbindningsjonen; figur 2 C, övre spektrum) vid en låg normaliserad kollisionsenergi på 25 % ger, som förväntat, endast en liten uppsättning intensiva signaler. Två framträdande signalpar, med Δm/z 32 (Δmrep), erhålls på grund av crosslinkerfragmentering, vilket resulterar i ett thial- (α-/β-thial) och alken- (α-/β-alken) fragment för varje peptid. Som tidigare nämnts är fragmenteringsväg a (figur 1 C) att föredra, vilket leder till en asymmetrisk intensitetsfördelning. Den dominerande bildningen av de förväntade intakta, separerade peptiderna gör följaktligen reagensen lämplig för mer sofistikerade MS3-experiment.

För vår studie använde vi HCD-fragmentering. Denna metod ger samtidig klyvning av tvärbindare och bildning av de peptidfragment som krävs för identifiering (figur 2 C, nedre spektrum). För att underlätta igenkänning av tvärbindning/peptid är det viktigt att HCD-fragmenteringen fortfarande ger alken- och thialfragmenten. HCD-data gör det därför möjligt att identifiera peptider med MS2.

Med hjälp av denna metod analyserade vi data med den fritt tillgängliga mjukvaran MeroX, med strikt filtrering av alla identifieringar av korslänkar (poäng >50, false discovery rate (FDR) 1 %) och med krav på närvaro av minst tre av fyra joner från de två karakteristiska massparen.23, 24 Utan att utnyttja möjligheten till CuAAC-baserad anrikning kunde vi identifiera 61 unika BSA-korslänkar i en enda mätning (figur 2 D).25 Detta resultat är representativt för de mätningar som utförts med renad BSA i vårt laboratorium. Dessutom avbildade vi de tvärbindningar som finns i BSA-kristallstrukturen och noterade att majoriteten av de uppmätta avstånden var rimliga. Viktigt är att tvärbindningarna visar ett genomsnittligt Cα-Cα-avstånd mellan de tvärbundna aminosyrorna på 22,1 Å och en avståndsfördelning som är i perfekt överensstämmelse med vad som förväntas för tvärbindning med ett reagens som rymmer de aktiva estrarna med cirka 9 Å (figur 2 E och S2)26 och med hänsyn till sidokedjelängder och proteinets molekylära dynamik.27 Korslänkning skedde mestadels mellan två Lysrester (49 %), men vi upptäckte även Lys-Thr (30 %), Lys-Ser (13 %) och Lys-Tyr (8 %) kopplingar, vilket stämmer överens med succinimidylestrarnas reaktivitet (figur 2 F).28

Denna framgång gjorde det möjligt för oss att validera det nya korslänkningsmedlet i en mer komplex miljö. Vi ville särskilt visa det extra värdet av den CuAAC-baserade anrikningsmöjligheten. För detta experiment korslänkte vi återigen BSA-proteinet (10 μg), fällde det med aceton, löste upp det korslänkade proteinet på nytt och utförde därefter klickreaktionen (figur S3 A) genom att tillsätta 7 (figur 3 A) och CuSO4/tris(3-hydroxipropyltriazolylmetyl)amin (THPTA) följt av en reducering av CuII till CuI vid tillsats av natriumaskorbat. Efter 1 timme i rumstemperatur utförde vi ytterligare en acetonutfällning för att avlägsna överskott av biotinazid. Därefter tillsatte vi trypsin och Lys-C för digestion.

Dessa peptider kombinerade vi därefter med en proteindigest som erhållits från ett HEK-celextrakt (435 μg protein; figur 3 B). Detta skapar en massiv bakgrund av icke-korslänkade peptider. Om vi nu analyserade tvärbindningarna inom denna stora bakgrund (figur 3 C) identifierade vi endast ett mycket litet antal tvärbindningsspektralmatchningar (medelvärde CSMs=5,0), unika tvärbundna platser (medelvärde unika XLs=3,7) samt monolänkar (medelvärde=5,3), där en succinimidylester hydrolyserades före reaktionen med proteinet. Om vi utförde anrikningen med streptavidinbelagda magnetpärlor förbättrades dock antalet identifieringar av korslänkar dramatiskt. Efter inkubering av peptidblandningen med magnetpartiklarna, omfattande tvättning (6×) av pärlorna med buffert (se stödinformation) och mild, reduktiv klyvning av disulfiden för att frigöra de ”fångade” tvärbindningarna och därmed avlägsna biotingenheten (figur S3 B), upptäckte vi nu i genomsnitt 95,0 CSM:er och 37,0 unika XL:er tillsammans med 184,3 monolänkar. Antalet identifierade unika XLs var lägre än för den renade BSA (figur 2 D), vilket kan förklaras av ineffektivitet i CuAAC-reaktionen eller interferens från den icke-korslänkade komplexbakgrunden. Detta resultat visar dock att vår nya tvärbindare, 1, kan berika tvärbundna peptider i ett stort överskott av omodifierade peptider, vilket underlättar analysen av komplexa prover med få tvärbindningar. Ursprungligen var vi skeptiska till den asymmetriska strukturen hos 1. Uppgifterna visar dock att ett stort antal korslänkar trots detta identifieras.

Sammanfattningsvis kombinerar vår nya tvärbindare 1 följande fördelar: För det första är reagensets storlek idealiskt lämpad för att få värdefull distansinformation för strukturell proteomik. Dessutom är molekylen cellpermeabel och alkynenheten orsakar inga större störningar i tvärbindningsreaktionen. Den robusta och effektiva sulfoxidfragmenteringen förenklar dessutom identifieringen av korslänkar. Möjligheten att funktionalisera peptider som är tvärbundna med 1 genom klickkemi gör det möjligt att använda olika modifieringar och anrikningsstrategier som gör det möjligt att analysera tvärbindningar med låg förekomst. Sammanfattningsvis banar vårt reagens 1 nu väg för komplexa interactomanalyser med hjälp av MS2- och MS3-experiment.

Intressekonflikter

Författarna förklarar inga intressekonflikter.