Dynamisk mekanism för transkriptionsapparaten som iscensätter tillförlitliga svar på aktivatorer

jun 20, 2021

admin

Matematisk karakterisering av TA:s dynamik

Dynamiken i TA dikteras av hur dess komponenter är rumsligt och tidsmässigt organiserade på promotorn. Eftersom TA kan anta många olika konfigurationstillstånd och tillståndsutvecklingen i huvudsak är stokastisk, med många molekyler och komplexa interaktioner, använder vi teorier om statistik och sannolikhet för att undersöka TA:s dynamik. För enkelhetens skull antar vi att koncentrationerna av transkriptionsassocierade arter, t.ex. GTF:er, förblir konstanta runt modellgenen och att de molekylära interaktioner som involverar promotorn befinner sig i dynamisk jämvikt. Termen ”dynamisk jämvikt” innebär inte att alla molekylära interaktioner är reversibla, utan kräver bara att TA efter en viss tid ska återfå sitt nuvarande tillstånd. En modellgen och alla arter runt omkring den utgör ett system. Ovanstående antaganden innebär att ett sådant system befinner sig i ett stabilt tillstånd. Låt oss betrakta en statistisk ensemble som består av ett stort antal sådana i huvudsak identiska system, där varje system utvecklas oberoende av varandra. Antalet system är tillräckligt stort så att alla möjliga konfigurationstillstånd för TA kan täckas av denna ensemble. Det vill säga, varje tillstånd som en enskild gen genomgår kartlägger tillstånden hos andra gener i ensemblen och andelen gener i ett särskilt tillstånd X (t.ex. gener med sina förstärkare bundna av aktivatorer), P(X), förblir konstant över tiden. På motsvarande sätt, om en enskild gen observeras när som helst, är sannolikheten för att genen befinner sig i tillståndet X också P(X). I denna mening är det en slumpmässig händelse i vilket tillstånd en enskild gen befinner sig.

För den minimala modellen (fig. 1a) definierar vi alla konfigurationstillstånd i TA som en universell mängd Ω och de olika tillstånden med samma nyckelegenskaper som följande delmängder (fig. 1b). A anger att förstärkaren är bunden av en aktivator. S betecknar att kärnpromotorn är bunden av proteinerna i SCF. M betecknar att ett nascent mRNA befinner sig i dräktighet (inklusive processen från PIC-bildning till Pol II:s flykt till elongation). J betecknar att den enhancerbundna aktivatorn är kopplad till SCF, PIC eller OPC genom mediatorn. Eftersom eukaryotisk transkriptionsinitiering kräver närvaro av SCF på kärnpromotorn4,12, M⊂S. Enligt definitionerna är J⊂AS. I uppsättningen MJ är M och A samtidiga, dvs. de enhancerbundna aktivatorerna kan direkt påverka Pol II:s verkan genom Mediatorn. Transkriptionsinitiering under direkt reglering av aktivatorer beskrivs således av uppsättningen MJ, medan den basala, aktivatoroberoende transkriptionsinitieringen ingår i uppsättningen M-J. Sannolikheten för ett nascent mRNA under dräktigheten, dvs. sannolikheten för att ett mRNA genereras, är

där q är en konstant som representerar den basala transkriptionsinitieringen och Aj är en delmängd av A (se S1 i den kompletterande informationen för detaljer). I Aj är de enhancerbundna aktivatorerna skyldiga att kontakta den SCF-, PIC- eller OPC-anslutna mediatorn. Ekvation (1) karakteriserar förhållandet mellan mRNA-produktion och TA:s dynamiska egenskaper.

Kodar koncentrationen av transkriptionsaktivatorer

I samband med distinkta arkitekturer av promotor-kromatinet i olika transkriptionsstadier kan de enhancer-bundna aktivatorerna utföra olika funktioner, t.ex. främja histonacetylering och rekrytera GTF:er4,5,15. Specifikt omfattar uppsättningen Aj de enhancerbundna aktivatorer som ansvarar för att hantera det basala transkriptionsmaskineriet och kontrollera transkriptionsinitiering. Dessutom är aktiviteterna hos dessa aktivatorer också förknippade med kodningen av den nukleära koncentrationen av aktivatorer, för är den enda faktorn i ekvation (1) som beror på koncentrationen av aktivatorer. Här undersöker vi dynamiken hos sådana aktivatorer.

Aktivatorer rör sig snabbt i kärnan och sannolikheten att de når förstärkaren är proportionell mot deras nukleära abundans9. Låt oss betrakta en tidsperiod under vilken de aktivatorer som är involverade i uppsättningen Aj binder till och sedan avlägsnar sig från förstärkaren under m (m = 1, 2, 3, …) cykler. Vi definierar den tidsmässiga beläggningsgraden RTOR för dessa aktivatorer som , där och betecknar bindnings- och avbindningstiden för den j:e cykeln. För det fasta antalet na av aktivatorer i kärnan har vi

där aon och aoff är benägenhetsfunktionerna för bindning respektive obindning (se S2 i den kompletterande informationen för närmare uppgifter). aon är en funktion av na, medan aoff är oberoende av na. Ekvation (2) visar att när m ökar konvergerar mot ett deterministiskt värde, som är en monotont ökande funktion av na (fig. 1c-d och fig. S1; detta är en allmän egenskap och kan tillämpas på fall där antalet kognata bindningsställen på förstärkaren är större än ett (se ekvationer S13-S18)). Denna konvergens innebär att även den tidsvarierande koncentrationen av aktivatorer kan kodas av RTOR, förutsatt att aktivatorerna cyklar på och av förstärkaren tillräckligt ofta under ett tidsfönster med nästan oförändrad koncentration. Det finns faktiskt aktiva mekanismer för att skilja sig från varandra som garanterar att aktivatorerna cyklar snabbt9,19,20,21,22. Bindningstiden uppskattades ligga inom intervallet sekunder till tiotals sekunder9,10. Dessutom bevisades det på den endogena CUP1-genen att denna snabba cykling är funktionell10. Förmodligen kodar RTOR för koncentrationen av transkriptionsaktivatorer. Å andra sidan, under den tidsperiod då aktivatorerna cyklar till och från enhancern m gånger, är sannolikheten för att enhancern hittas bunden av en sådan aktivator . Eftersom genomsnittet av över ensemblen också är f(na) har vi

De begränsande villkoren som säkerställer tillförlitliga transkriptionella svar

Med tanke på stokasticiteten i förekomsten av transkriptionshändelser krävs det, för att uppnå ett tillförlitligt transkriptionellt svar, att RTOR-koden, som i rätt tid representerar koncentrationen av aktivatorer, med hög trovärdighet omvandlas till mängden transkriptioner. Om P(S), och alla var lika med 1, skulle den exakta informationstransduktionen genomföras. I det följande presenterar vi de villkor under vilka dessa tre faktorer kan vara tillräckligt stora för att säkerställa tillförlitliga transkriptionssvar i närvaro av slumpmässiga fluktuationer (figurerna S2 och S3 ger intuitiva förklaringar till detta underavsnitt).

Ekvation (3) innebär att koncentrationen av aktivatorer inte kan kodas i tillräcklig utsträckning utan att SCF:n finns kvar på promotorn. SCF bör således samlas snabbt när kromatinarkitekturen tillåter det och vara mycket stabilare än de enhancerbundna aktivatorerna (villkor I). En sådan stabilitet hos SCF har observerats experimentellt och bindningstiden för TBP (TATA-bindande protein, SCF:s kärnkomponent) på promotorn kan vara upp till 20 minuter i mänskliga celler11. För är Aj en förutsättning för att J ska inträffa. Eftersom RTOR bestäms av de enskilda korta bindningstiderna för aktivatorer bör J inträffa omedelbart efter det att Aj inträffat (fig. S3). Annars går informationen om RTOR till stor del förlorad eller utnyttjas till och med felaktigt för att styra transkriptionsinitiering (observera att J är en förutsättning för M). För att korrekt överföra RTOR-koden bör därför mediatorn agera genom att vänta på att binda de cyklande aktivatorerna och överföra informationen genom allosteri23,24,25 (villkor II). Detta beror på att andra typer av molekylära interaktioner, t.ex. fria kollisioner, inte exakt kan överföra informationen om aktivatorernas bindningstid. En sådan allosterism hos mediatorn stöds av tidigare arbete26. bestämmer hur den information om RTOR som ärvs av J omvandlas för att styra mängden transkript. Eftersom RTOR är beroende av aktivatorernas intermittenta bindning kräver ett stort att transkriptioner under de korta bindningsperioderna ska produceras i ganska snabb takt (fig. S2) (villkor III). Denna egenskap verifieras också genom beräkningsskattningar av de experimentella uppgifterna (se S3 i den kompletterande informationen). Därför kan alla tre villkoren uppfyllas på ett naturligt sätt.

Den dynamiska mekanismen för aktivatorreglerad transkription

De ovanstående tre begränsningsvillkoren bestämmer tillsammans hur TA fungerar. Det uppstår upprepade gånger ett tillstånd där ett relativt stabilt klämliknande utrymme bildas mellan mediatorn och förstärkaren (fig. 2; enligt villkor I och II). Eftersom SCF experimentellt visades vara inte särskilt stabil11 , konstrueras detta utrymme tillfälligt. Det klämliknande utrymmet drar till sig fria aktivatorer och skalar sedan snabbt av dem, där RTOR bestäms av aktivatorernas koncentration (enligt ekvationerna (2-3)). När en aktivatormolekyl kommer in i detta utrymme uppstår allosteri i mediatorn, vilket resulterar i en förenklad omständighet för GTF:erna och andra relaterade proteiner att utföra sina funktioner. Följaktligen kan Pol II:erna initiera/återinitiera transkriptionen mycket snabbt (enligt villkor II och III), med RTOR som styr mängden transkriptioner.

Denna mekanism tyder på att de molekylära interaktionerna som involverar promotorn lyder under eleganta dynamiska principer enligt följande. Medan det klämliknande utrymmet bildas tillfälligt är det mycket stabilare än de aktivatorer som sätter sig i det. Aktivatorerna kan cykla in och ut ur utrymmet många gånger även under korta episoder då deras koncentration nästan förblir oförändrad; koncentrationen av aktivatorer kan således representeras av RTOR i tid. Eftersom mediatorn överför informationen via allosteri och hastigheten för transkriptionell reinitiering är mycket större än aktivatorernas cykelhastighet, används RTOR-koden effektivt för att styra mRNA-syntesen. Med ett ord är det klämliknande utrymmet den strukturella grunden för tillförlitliga transkriptionella reaktioner. Snarare än att vara ett hinder utnyttjas den stokastiska karaktären hos de molekylära interaktionerna fullt ut för att inducera transkription på ett tillförlitligt sätt; detta beror till stor del på olika omfattningar av stabiliteten hos komponenterna i TA, som sträcker sig över flera storleksordningar. Ovanstående argument stöds av experimentella data och de typiska tidsskalorna är följande: halveringstiden för det klämliknande utrymmet är cirka 5 minuter11 , aktivatorernas ockupationstid i utrymmet ligger inom intervallet sekunder till tiotals sekunder10 , allosteri inträffar vanligen inom en tid av millisekunder till högst 1 sekund23,24,25 och det tar bara flera sekunder att återuppta en transkription (se S3 i den kompletterande informationen).

Validering av mekanismen genom numeriska simuleringar

För att ytterligare verifiera den föreslagna dynamiska mekanismen bygger vi en förenklad stokastisk modell för gentranskription med fysiologiskt realistiska parametrar (se fig. S4 och S4 i den kompletterande informationen för detaljer). Denna modell skildrar de viktigaste tillståndsövergångarna i TA och beskriver också enkelt den relaterade kromatindynamiken, vilket gör det möjligt att karaktärisera transkriptionssvaret på transkriptionsaktivatorer. I det följande betecknar ”input” och ”output” kärnkoncentrationen av aktivatorer respektive mängden genprodukter, mRNA eller protein.

Först utforskar vi den tidsmässiga utvecklingen av antalet cellulära mRNA vid konstanta inputnivåer (fig. 3a). Noterbart är att mRNA produceras på ett burst-liknande sätt, vilket överensstämmer med den rådande uppfattningen14,27,28,29,30,31,32. Vid låga inmatningsnivåer transkriberas den ena allelen medan den andra är tyst i en diploid cell och därmed är burstfenomenet uppenbart. För inflöden på hög nivå bryter dock båda de två allelerna ofta ut så att summan blir nästan konstant. Detta tyder på att fenotypen med ihållande förhöjda transkriptionella svar kan observeras vid höga inmatningsnivåer14.

En nyligen genomförd experimentell analys utesluter möjligheten att kromatinmiljön spelar en central roll när det gäller att forma transkriptionella utbrott32. Här visar vi att en burst av transkript har sitt ursprung i en ihållande reinitiering av Pol IIs när det klämliknande utrymmet är upptaget av aktivatorerna (fig. 4). Det vill säga, initieringen av mRNA är i sig självt burst-liknande. Utbrottet är inte bara ett brus, utan en direkt manifestation av RTOR-koden, som representerar koncentrationen av aktivatorer och styr mRNA-produktionen.

För det andra undersöker vi det genomsnittliga inmatnings-/utmatningsförhållandet för transkriptionellt svar. Det genomsnittliga utflödet liknar en Hill-funktion av inmatningen, som i stor utsträckning används inom systembiologin för att modellera genuttryck3,33,34 (fig. 3b). Kurvan för standardavvikelsen SDout för utgången i förhållande till ingången är ungefär klockformad (fig. 3c). Intensiteten av det inneboende bruset, definierat som förhållandet mellan SDout och medelutgången35 , är omvänt korrelerad med inflödet (inslaget i fig. 3b). Dessutom är ovanstående egenskaper okänsliga för små fluktuationer i inmatningen (dvs. extrinsiskt brus) (fig. S5), vilket tyder på att det transkriptionella svaret på brus är robust. Alla dessa resultat stämmer väl överens med de experimentella mätningarna i både Saccharomyces cerevisiae36 och Drosophilaembryon37. I synnerhet är den vänstra sidan av SDout-kurvan lägre än dess högra sida; denna egenskap överensstämmer nästan kvantitativt med de experimentella uppgifterna37 (se S5 i den kompletterande informationen för ytterligare diskussioner). Däremot skulle avvikelser från de dynamiska principer som föreslagits ovan (inklusive de omständigheter under vilka aktivatorernas cykling är långsam, ställningskomplexet/klampliknande utrymmet inte är stabilt, eller/och hastigheten för transkriptionell reinitiering är låg) minska TA:s förmåga att reagera på ett tillförlitligt sätt på inmatningen (Fig. S6).

Det inmatnings-/utmatningsförhållande som observerats i Drosophila-embryon troddes förverkligas genom att maximalt utnyttja gränsen för de molekylära interaktionerna37,38,39. Egenskaperna hos sådana mikroskopiska interaktioner integreras för att makroskopiskt manifesteras som SDout. SDout-kurvan är fortfarande klockformad överlag jämfört med SDin-kurvan (jfr fig. 1d). Det innebär att RTOR-kodens signatur kan överföras direkt till utgången. Detta bekräftar att aktivatorernas tidsmässiga beläggningsgrad verkligen utnyttjas för att reglera transkriptionen och att mediatorn överför informationen genom allosteri. Å andra sidan är SDout-kurvan asymmetrisk, där den högra sidan är högre än den vänstra. Orsaken är uppenbar. När inmatningen är mycket hög är förstärkaren bunden av aktivatorerna nästan hela tiden och därmed återspeglar fluktuationerna främst SCF:s dynamiska egenskaper och transkriptionens återinitiering av Pol II:s transkription. Våra ytterligare simuleringar visar att den högra sidan av SDout-kurvan sjunker när SCF:s stabilitet eller hastigheten för transkriptionell reinitiering ökas; det är först när man ökar deras styrka bortom de fysiologiska områdena som kurvan kan bli symmetrisk (fig. S6F). Detta verifierar också att både P(S) och verkligen är tillräckligt stora. Därför bör egenskaperna hos SDout slutgiltigt bevisa den mikroskopiska transkriptionella mekanismen.

För det tredje undersöker vi fördelningen av mRNA-nivåer över en stor cellpopulation som utsätts för samma input (fig. 3d). För små inflöden är sprängningsfenomenet särskilt tydligt och de flesta celler har inga eller få mRNAs. Detta stämmer överens med den experimentella observationen27,30,31. Men fördelningen blir gradvis normal när insatsen ökar. För aon/aoff >1 blir fördelningen skarpare när insatsen ökar. Dessa resultat väntar på experimentell identifiering.

För det fjärde simulerar vi transkriptionssvaret på en periodiskt varierande insats. Den mikroskopiska processen på en promotor är ganska dynamisk och stokastisk, med olika komponenter i TA som uppvisar olika stabiliteter (fig. 3e). Mängden mRNA kan dock följa insatsen. Dessa resultat stämmer väl överens med de resultat som FRAP avslöjat, dvs. att TA är en mycket dynamisk apparat8,10,11,22. Å andra sidan avslöjar simuleringar av kromatinimmunuttag (ChIP), som karakteriserar den tidsmässiga utvecklingen av fördelningen av olika tillstånd av promotorn bland en cellpopulation, en stark regelbundenhet i fördelningarna (fig. 3f). Mönstren för både aktivatorer som binder till enhancern och SCF och Pol II som binder till promotorn följer inmatningen. mRNA-transkriptioner produceras i fas med inmatningen, medan histoner ockuperar promotorn i en omvänd fas. Alla dessa resultat stämmer väl överens med de experimentella resultaten22,40. Därför kan de observerade diskrepanserna mellan resultaten från FRAP- och ChIP-experiment bero på olika upplösningar vid mätningarna. ChIP-mätningar integrerar molekylära interaktioner både tidsmässigt och över cellpopulationen, medan FRAP mer noggrant återspeglar de omedelbara interaktionerna. Dessutom är det transkriptionella svaret på den tidsvarierande insatsen robust mot yttre brus men känsligt för sammansatta insatssignaler, och avvikelser från de dynamiska principerna (t.ex. i fall med låg cykelhastighet för aktivatorer, instabila ställningskomplex/klampliknande utrymme eller/och låg hastighet av transkriptionell reinitiering) skulle minska svarsförmågan (se figurerna S7 och S8)