Cellodlingsreagenser

En glycerolförteckning av Human Akt1 ORF erhölls som vektor pENTR221 från GE Dharmacon (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600). Modifierad destinationsvektor (pcDNA/FRT/TO), som innehåller SH Tag, var en generös gåva från Dr. Matthias Gstaiger (Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zürich, Zürich, Schweiz). Flp-In TREx HEK293-celler (#R780-07), LR Clonase II-enzymblandning (#11791-100), pOG44-vektor (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) och Dynabeads Protein A (#100.02D) erhölls från Invitrogen. Xtremegene 9 (#06365787001) förvärvades från Roche. DMEM (#12430-054) och RPMI 1640 (#22400-089) kommer från GIBCO. Trypsin (#CC5027.010L) köptes från Genetics. Normal FBS (#SH30070.03) och Tet-screenad FBS (#SH30070.03T) anskaffades från Hyclone. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazole (#M1404-10MG), Propidiumjodid (#P4170-250 mg) och Lys C proteas (#P3428) erhölls från Sigma. SILAC-etiketter anskaffades från Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Proteashämmande cocktail (100X) (#78429) och Pierce anti-HA agarospärlor (#26182) erhölls från Thermo Scientific. MagStrep ”Type 2HC”-pärlor (nr 2-1612-002) kom från IBA BioTagnology. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, Indien syntetiserade HA-peptiden . Nitrocellulosemembran (#RPN303E) köptes från GE Healthcare. Trypsinproteas (#4370282) anskaffades från AB Sciex. Full range rainbow protein molecular weight marker (#RPN800E) kom från Amersham. siRNAs, Dharmafect Transfection Reagent (#T-2001-03), RNase Free Water (#B-003000-WB-100), 5X siRNA buffer (#B-002000-UB-100) kom från Dharmacon. RNase A (#19101) kom från Qiagen.

Antikroppar för Western Blot

Antikroppar som användes i denna studie var: anti-HA (#SC-7392; musmonoklonal, spädning 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; musmonoklonal, spädning 1:1000) och anti-GAPDH (#SC-25778; kaninpolyklonalt, spädning 1:1000) från Santa Cruz; anti-CDC2 (#77055; kaninpolyklonalt, spädning 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; kaninpolyklonalt, spädning 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; kaninpolyklonalt, spädning 1:1000):1000) från Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#ab133699; monoklonal kanin, spädning 1:10000); anti-API5 (#ab56392; monoklonal mus, spädning 1:1000) och anti-SH3PX1 (#EPR14399; monoklonal kanin, spädning 1:2000) från Abcam; sekundära antikroppar anskaffades från Licor Biosciences-Odyssey goat anti-mouse (#926-32210, spädning 1:15000) och Odyssey goat anti-rabbit (#926-32211, spädning 1:15000).

Generering av stabil cellinje

I denna studie användes gateway-kompatibel Akt1-ingångsvektor (pENTR221) för att generera en uttryckskonstruktion genom LR-rekombinationsreaktion i närvaro av en lämplig destinationsvektor (pcDNA/FRT/TO). Destinationsvektorn modifierades för att inkludera en Strep-HA (SH)-tag som innehåller en streptavidinbindande peptid (Strep) och en hemagglutininin (HA)-epitoptag. Denna SH-tagg användes så småningom för att selektivt dra ut Akt1 och dess interagerande partners från komplexa celllysat. För att generera en inducerbar cellinje för Akt1-uttryck samtransfekterades uttryckskonstruktionen med pOG44-rekombinas till Flp-In TREx HEK293-celler som stabilt uttrycker Tet-repressorn. Transfektionen underlättades av Xtremegene 9 transfektionsreagens. Celler som uttryckte Akt1-konstruktionen selekterades under 15-20 dagar i hygromycin-B (75 µg/ml) innehållande RPMI-medium, kompletterat med 10 % Tet screenad FBS. Dessa selekterade celler samlades senare för att expandera för pulldown-experiment.

Tet-koncentrationen som krävs för optimalt Akt1-uttryck bestämdes genom att inducera Akt1-uttryck över ett intervall av Tet-koncentrationer (0,1 µg/ml till 5 µg/ml) och proteinuttrycksnivåerna av Akt1 övervakades i närvaro och frånvaro av Tet med hjälp av anti-Akt1- samt anti-HA-antikropp. Tet kompletterades till kulturmedierna var 24:e timme för att upprätthålla ett stabilt Akt-uttryck.

PDT Experiment

PDT för HEK293-celler övervakades i normala jämfört med Akt1-överuttryckande celler under en tidsperiod på 72 timmar efter den första administreringen av Tet. För varje observationspunkt såddes en parallell uppsättning av 104 normala och Akt1-överuttryckande HEK293-celler i tredubbla exemplar i en 96-brunnsplatta i 100 µl DMEM-medium innehållande 10 % serum. Tet kompletterades med odlingsmedia 24 timmar efter utsädet och efter ytterligare ett inkubationsintervall på 24 timmar skördades cellerna som tid 0. Därefter skördades en uppsättning celler, i parallellodling, var 24:e timme upp till 72 timmar. PDT bestämdes genom att räkna cellerna vid varje tidpunkt med hjälp av trypanblå färgningsmetoden.

SILAC-märkning för att differentiera cellcykelfasspecifika Akt1-interactom

Akt1-överuttryckande HEK293-celler expanderades och odlades i SILAC-medier som innehöll ”lätta” (K0R0), ”medelsvåra” (K6R6) eller ”tunga” (K8R10) lysin- (K) och arginin- (R) isotoper i minst fem cellfördubblingar för att möjliggöra fullständig inbyggnad av märkningen. Vid 70 % konfluens kompletterades medierna med Tet (1 µg/ml) för att inducera Akt1-uttryck. K0R0-märkta celler stoppades i G0-fasen genom att över natten svälta i serum, vilket är en allmänt använd metod för att stoppa celler i G0-fasen42. För att göra detta ersattes normala kompletta kulturmedier med RPMI utan serum och cellerna hölls i kultur i 16-18 timmar vid 37 °C i en atmosfär med 5 % koldioxid. K8R10-märkta celler stoppades i G1/S-fasen genom att cellerna odlades över natten i närvaro av 5 µg/ml aphidikolin, en reversibel hämmare av eukaryotisk nukleär DNA-replikation43. För G2-arrest kompletterades kulturmediet för K6R6-märkta celler med 400 ng/ml nocodazol och inkuberingen fortsatte i 16-18 timmar innan cellerna pelleterades. Nocodazol stör polymeriseringen av mikrotubuli och stoppar därmed cellerna i G2/M-fasen44. De arresterade cellerna trypsiniserades och räknades separat med hjälp av trypanblåfärgningsmetoden. Celler som arresterats i olika cellcykelfaser pelleterades sedan genom centrifugering vid 1500 rpm i 10 minuter. Flera cellpellets gjordes för varje cellcykelfas och förvarades vid -80 °C tills de användes.

SH-märkt affinitetsrening

Samma antal Akt1-överuttryckande celler som arresterats i G0-, G1/S- och G2-faserna blandades i förhållandet 1:1:1:1 och lyserades på is i 1 timme i IP-buffer (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1 % NP-40; 1X proteashämmare cocktail och 1 mM PMSF). Celllysat rensades från skräp efter centrifugalseparation vid 10 000 rpm i 15 minuter vid 4 °C. Akt1-proteinkomplex renades selektivt i parallella uppsättningar genom att rikta Strep- och HA-taggen samtidigt, enligt instruktionerna i handböckerna för respektive kit. Strep-märkta Akt1-proteinkomplex blandades kortfattat med 100 µl magnetiska streptactinpärlor och inkuberades i en timme i en roterande skakare vid 4 °C. Eventuella ospecifika interaktorer tvättades bort under fem på varandra följande tvättsteg med fem pärlvolymer streptactintvättbuffert av streptactin. Akt1-proteinet och dess interaktorer eluerades slutligen i två elueringssteg med 125 µl strep-elueringsbuffert per eluering (invitrogen). För rening av HA-märkta Akt1-proteinkomplex inkuberades rensade celllysat med 50 µl förtvättade HA-agarospärlor i 2 timmar vid 4 °C på en roterande skakare. Efter tre snabba tvättar med tio volymer TBS-T-buffert för pärlor eluerades Akt1-proteinkomplex tre gånger med 50 µl HA-peptid (250 µg/ml). Ovanstående reningssteg utfördes för tre sådana biologiska replikat för att rena Akt1-protein och dess interagerande partners och Strep- och HA-eluaten för varje replikat sammanfördes, lyofiliserades och sparades vid -80 °C fram till vidare bearbetning.

Proteinförstöring och provförberedelse för LC-MS/MS

Alla tre biologiska replikat bearbetades för proteinförstöring separat. Till det lyofiliserade provet tillsattes 40 µl 100 mM ammoniumbikarbonat, virvelades väl och därefter tillsattes 2 µl denatureringsbuffert (AB Sciex). Proverna reducerades med 4 µl reduktionsreagens (AB Sciex) i 1 timme vid 60 °C. 2 µl cysteinblockeringsreagens tillsattes i 10 minuter i rumstemperatur för att blockera reducerade cysteinrester. Proteinspjälkningen inleddes genom att tillsätta 5 µl av 0,1 µg/µl endoproteinas Lys C. Proverna inkuberades i 4 timmar i ett vattenbad vid 37 °C. Efter en kort snurrning tillsattes 1 µl trypsin (1 µg/µl) till proverna och inkubationen fortsatte i ytterligare 12-16 timmar vid 37 °C. Proteinspjälkningen avslutades genom att tillsätta en droppe myrsyra (FA).

Acidifierade prover ljödofiliserades och utsattes för peptidrening med hjälp av monospin C-18-kolonner. Före användning konditionerades C-18-kolonnerna med metanol och vatten och ytterligare ekvilibrerades med 3 % ACN i 0,1 % FA. De lyofiliserade proverna löstes upp i 3 % ACN i 0,1 % FA och lades på C-18-kolonnerna och fick binda i 10 minuter. Proverna passerade två gånger genom kolonnerna för att säkerställa fullständig bindning. Efter 10 strikta tvättar med 3 % ACN i 0,1 % FA eluerades de smälta peptiderna först i 40 % ACN följt av två elutioner i 60 % ACN. Slutligen sammanfördes de tre eluaten och lödofiliserades för varje replikat.

De eluerade peptiderna löstes på nytt upp i 500 µl 5 mM ammoniumformiat (pH 2,5) i 30 % ACN och vortexades försiktigt. Kationbytarpatronen fixerades och konditionerades innan provet laddades. Efter det att provet laddats tvättades patronen tre gånger med 5 mM ammoniumformiat (1 ml). Peptiderna eluerades på nytt två gånger med 400 µl 500 mM ammoniumformiat (pH 2,5) i 30 % ACN per eluering och eluaten sammanfördes för varje provreplikat och ljösofiliserades.

Masspektrometri Experimentell utformning och statistisk motivering

LC-MS/MS-analys

Alla prover analyserades med nanoflödesvätskekromatografi på ett nanoflex-system (Eksigent Technologies, AB Sciex) kopplat till en trippel TOF 5600-masspektrometer (AB Sciex; Concord, Kanada). Varje biologisk replikat injicerades två gånger som tekniska replikat. Systemet användes med en binär fasgradient med lösningsmedel A (2 % ACN i 0,1 % FA) och lösningsmedel B (98 % ACN i 0,1 % FA). För optimal reproducerbarhet av provtillförseln kördes den automatiska provtagaren i fullt injektionsläge och överfyllde 1 µl-slingan med 3 µl prov. För mätningarna av varje provinjektion fångades peptiderna i en cHiPLC-fälla, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) och separerades på en cHiPLC-kolonn, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) vid en flödeshastighet av 300 nl/minut, med hjälp av en linjär gradient: 5-60 % lösningsmedel B i 80 minuter, 60-90 % i 2 minuter. Kolonnen regenererades genom att tvättas med 90 % lösningsmedel B i 6 minuter och åter ekvilibrerades med 5 % lösningsmedel B i 22 minuter.

Masspektrometern var kopplad till en Nano Spray Ion Source (AB Sciex), som styrdes av Analyst-programvaran (v.1.6). Jonkällan var utrustad med en 10 μm SilicaTip electrospray PicoTip emitter (AB Sciex) och de eluerade peptiderna övervakades med följande jonkällparametrar-IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, ridågas = 25. Masspektrometern kördes i informationsberoende förvärv (IDA) top10-läge och högkänslighetsläge med 500 och 200 ms ackumuleringstid för MS1- respektive MS2-scans och 12 s dynamisk uteslutning, vilket resulterade i en total arbetscykel på ~2,55 s. Masspektrometerns analys utfördes med hjälp av TOF-MS1- och MS2-sökningsscanningar som sträckte sig från 350-1250 respektive 140-1600 m/z. Den rullande kollisionsenergin styrdes automatiskt med hjälp av IDA-skriptet för rullande kollisionsenergiparametrar. Urvalskriterierna för den moderjon som ska fragmenteras omfattade intensitet – där jonerna måste vara större än 150 cps, masstolerans på 50 mDa, med ett laddningstillstånd på +2 till +5. En automatisk kalibrering av spektra gjordes efter förvärv av vartannat prov med hjälp av dynamisk LC-MS och MS/MS-förvärv av 25fmol β-galaktosidas.

Databearbetning och analys

MS-MS-förvärv av Akt1 och dess interagerande proteinpartners förmedlades i tre olika cellcykelfaser, dvs. G0-, G1/S- och G2-fasen. SILAC-märkta celler som representerar varje fas samlades i tre separata uppsättningar och undersöktes som biologiska replikat. Förvärv av varje biologisk replik resulterade i två wiff- och två wiff.scan-filer, som representerar de tekniska replikerna. Wiff-filerna sammanfördes återigen för varje biologisk replikat innan de söktes mot UniProtKB/SwissProt Human-databasen (version april 2015) med hjälp av proteinpilotprogramvaran, version 4.5 (revision nr 1656). Referensdatabasen bestod av 20 204 proteinposter i den angivna versionen. Proteinpilotsökningen baserades på paragonalgoritmen, en del av standardstatistiken i programvaran. Följande inställningar användes för paragon-sökningarna: a) art Homo sapiens, b) Lys C och Trypsin som enzymkategorier för olika körningar, c) maximalt antal missade klyvningar = 2, d) fasta modifieringar som SILAC-etiketter – K6R6 och K8R10; cysteinalkylering med metylmetanethiosulfonat (MMTS), (e) Variabla modifieringar som oxidation vid metionin, vilket är ett standardalternativ i proteinpilot, (f) Identifiering, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) och SILAC (Lys + 8, Arg + 10) som provtyper, och (g) Parametern ”Search Effort” (sökansträngning) ”Thorough ID” (grundlig identifiering), vilket ger oss en bred sökning av olika proteinmodifieringar, (h) Mass-toleransen för prekursor- och fragmentjoner var 0.05 respektive 0,1 Da. För varje biologisk replikat per SILAC-etikett genererades Lys C- och Trypsin-digrerade filer. Följande parametrar användes för att filtrera data för att få en säker datamängd för efterföljande analys: a) Automatisk algoritm för korrigering av bias för förhållandet mellan tunga och lätta data tillämpades. Den korrigerar för ojämlik blandning under kombinationen av de olika märkta proverna i ett experiment och avlägsnar alla experimentella eller systematiska förskjutningar. Den automatiska biasfaktorn ökar kvantifieringens noggrannhet genom att normalisera variationer i de ursprungliga proteinkvantiteterna45, (b) Proteiner med 1 % global falsk upptäcktsfrekvens (FDR) från anpassningen (G-FDR-fit) bibehölls. FDR-analysen utfördes med hjälp av Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP) som installeras tillsammans med protein pilot-programvaran. c) Tröskelvärdet för minsta konfidens för proteiner sattes till 95 %. d) Identifiering av minst en unik peptid med 95 % konfidens i alla tre replikat.

Listorna över proteiner som erhållits efter Lys C och Trypsin-desmältning sammanfördes per biologisk replikat. Kvantifieringskvoter mellan medeltunga och tunga SILAC-märkta proteiner i förhållande till deras lättare motsvarigheter genomsnittsberäknades. Därefter fick vi tre proteinlistor per SILAC-märkning – K0R0, K6R6 och K8R10. Därefter utarbetades en unionslista över de identifierade proteinerna; Den kvantitativa uppskattningen kurerades manuellt genom att sammanföra filer från tre biologiska replikat för varje SILAC-tillstånd. Proteiner som identifierades i alla tre replikatuppsättningar behölls för efterföljande analys och kvantitativa förhållanden mellan medium och tunga etiketter i förhållande till lätta etiketter för dessa proteiner medelvärdesberäknades. En slutlig kombinerad fil utarbetades sedan för K0R0 (G0-fasen), K6R6 (G2-fasen) och K8R10 (G1/S-fasen). Ett protein kvalificerade sig för att ingå i den slutliga listan över Akt1-interaktörer endast om det identifierades i alla tre replikatuppsättningar för någon av cellcykelfaserna. Proteiner som identifierades men inte kvantifierades i alla tre replikat tilldelades ett kvantifieringsvärde på 0,01 (minimum) eller 100 (maximum) efter att ha trängt in i peptid-SILAC-förhållandena.

För att ytterligare rensa listan över Akt1-interaktörer från eventuella ospecifika interaktioner med affinitetsmatrisen eller taggen i sig, överexpresterades SH-märkt GFP i HEK293-celler. GFP-proteinets interaktionspartners eluerades selektivt enligt beskrivningen för Akt1-proteinkomplex. Proteiner som överlappade med Akt1 cellcykelfas-specifika interactom togs bort från Akt1 interactors-listan som ospecifika proteiner. Detta gav oss slutligen ett säkert dataset för interaktionspartners för Akt1. En sammanfattning av informationen om de Akt1-interagerande proteinerna och deras kvantifieringsuppskattningar finns i kompletterande tabell 3. Genom att dividera dem med Akt1-förhållandet i respektive fas normaliserades de kvantitativa förhållandena för alla Akt1-interaktörer. Detta gav enhetlighet för Akt1 som 1 i G0-, G1/S- och G2-faserna.

Polyakrylamidgelelektrofores och Western blotting

Från listan över identifierade Akt1-interaktörer valdes CDK1, CCNB1, BUB3, API5 och SH3PX1 slumpmässigt ut för att validera deras association med Akt1 genom Western Blotting. Asynkroniserad Akt1-uttryckande cellpellet lyserades i IP-buffer och utsattes för affinitetsrening riktad mot SH-tagg som beskrivits tidigare. Eluaten sammanfördes och späddes i 1X SDS-provbuffert, värmdes i 10 minuter och löstes på 10 % SDS-PAGE. Proteinbanden överfördes till nitrocellulosamembran och det senare blockerades med 1:1 Odyssey-blockeringsbuffert: PBS i en timme i rumstemperatur. Därefter klipptes membranet så att proteiner av olika storlek kunde undersökas med respektive primära antikroppar för validering tillsammans med anti-HA-antikropp. Utspädningen av den primära antikroppen gjordes i odyssey-buffert: PBST och inkuberades över natten vid 4 °C på en shaker. Efter noggrann tvättning exponerades blottarna för respektive IR-märkta sekundära antikroppar mot mus eller kanin i en utspädning på 1:15000, utspädda i odysseybuffert: PBST. Banden detekterades med hjälp av odyssey infraröd skanner.

Reverse co-immunoprecipitation gjordes också med hjälp av Dynabeads protein A. De tidigare detekterade Akt1-interaktorerna användes som lockbeteproteiner och Akt1 undersöktes som deras interaktionspartner med hjälp av anti-Akt1-antikropp. Antikroppar mot de utvalda Akt1-interaktorerna blandades med 50 µl dynabeads i separata rör i en koncentration av 1:20-1:70 och späddes ut i 200 µl PBST. Blandningarna av pärlor och antikroppar förvarades för inkubation i rumstemperatur i 10 minuter. Komplexen mellan pärlor och antikroppar pelleterades med hjälp av en magnetseparator och återuppsuspenderades i 200 µl PBST för tvättning. Därefter tillsattes 250 µl lysat till varje rör och inkuberades vid 4 °C i 2 timmar på en roterande skakare. Pärlorna tillsammans med respektive antikropp-antigenkomplex pelleterades återigen och tvättades tre gånger med 200 µl PBST per tvätt. Därefter kokades pärlorna i 50 µl 1X SDS-provbuffert i 10 minuter och kyldes därefter. Supernatanten laddades på 10 % SDS-PAGE och provades med Western Blotting. Anti-Akt1-antikropp användes för att söka efter Akt1 i eluering av API5, CCNB1, CDK1, BUB3 och SH3PX1.

GO-klassificering

GO-klasser som beskriver funktionen hos varje Akt1-interaktör bestämdes från UniProt (http://www.uniprot.org/) och EnrichR-databaser (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Efter en omfattande manuell kuratering delades de identifierade Akt1-interaktorerna in i tre större funktionella klasser, nämligen proliferation och överlevnad, metabolism och proteinsyntes. Resten avbildades som en gemensam klass kallad ”others” som inkluderade proteiner med funktioner som transport, hematopoesi etc.

Genknockdown med hjälp av siRNA

Standardisering

För att bestämma den optimala koncentrationen av siRNA för transfektion såddes 1,2 × 105 HEK293-celler i en 12-brunnsplatta. siRNA mot PLK1 användes som positiv kontroll i alla knockdown-analyser. En rad siRNA-koncentrationer från 10 nM till 50 nM transfekterades med dharmafect transfektionsreagens, enligt leverantörens protokoll. Förändringar i proteinuttrycksnivåerna övervakades genom western blotting vid 24 timmar, 48 timmar respektive 72 timmar (kompletterande figur 2). Ytterligare några måltavlor (SH3PX1, AKT1, CCNB1 och SLC25A5) knockades ner och effekten av knockdown fastställdes genom western blotting. GAPDH användes som lastningskontroll.

Knockdown av målproteiner

Proteiner som visade störd association med Akt1 medan cellen gick från G0 till G1/S-fasen i cellcykeln knockades ned individuellt i HEK293-celler och undersöktes med FACS. Varje siRNA återuppsuspenderades i 1x siRNA-buffert för att erhålla en stockkoncentration på 20 µM. Transfektion skedde i tre exemplar 24 timmar efter cellutsättning, tillsammans med lämpliga positiva och negativa kontroller. Varje siRNA späddes till en arbetskoncentration på 25 nM i RPMI till en slutvolym på 50 µl och förvarades i rumstemperatur under 5 minuters inkubering. Transfektionsreagenset späddes också i RPMI till en volym på 50 µl och förvarades för inkubering under liknande förhållanden. Både siRNA och transfektionsreagenset blandades försiktigt för att bilda komplex och fortsatte inkuberingen i ytterligare 20 minuter i rumstemperatur. Slutvolymen ökades till 500 µl med media innehållande 10 % serum. Dessa komplex tillsattes sedan försiktigt på cellerna och fortsatt inkubation vid 37 °C. Cellodlingsmediet ersattes med färskt 10-procentigt medium efter 24 timmar. Slutligen, 48 timmar efter transfektion, bestämdes transfektionseffektiviteten genom att övervaka siGLO under Nikon Ti inverterat mikroskop.

FACS-förvärv och analys

48 timmar efter transfektion centrifugerades cellerna kortvarigt och medierna sögs upp. Cellerna färgades med 300 µl propidiumjodidlösning innehållande 0,1 mg/ml propidiumjodid (Sigma), 3 µl/ml Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml natriumcitrat (Sigma) och 20 µg/ml RNas (Sigma) i 30 minuter vid 4 °C. De färgade cellerna överfördes omedelbart till BD FACS-rör och förvärvades i BD FACS Canto.

De erhållna uppgifterna analyserades med hjälp av programvaran FlowJo. DNA-histogrammen analyserades för att kvantifiera sub G0-, G0/G1-, S- och G2/M-populationer. Mindre förskjutningar observerades i G0/G1- och G2/M-populationerna och därför gjordes manuell gating för att analysera dessa populationer.

Beräkning av PDT och RT

PDT och RT i G1-, S- och G2-faserna i cellcykeln beräknades efter siRNA-knockdown av uppsättningen proteiner som uppvisar störd association med Akt1 i G1/S-fasen. PDT för de 23 generna, tillsammans med kontroller, övervakades i HEK293-celler under 72 timmar. I korthet såddes 10 000 celler i en 96-hålsplatta i 100 µl RPMI-medium med 10 % serum. siRNA-transfektion förmedlades nästa dag i tre exemplar för varje målprotein och betraktades som 0-timmarstidpunkt. Cellantalet bestämdes för obehandlade HEK293-celler genom trypanblå färgningsmetod. Efter 24 timmar ersattes cellodlingsmedier som innehöll siRNA-komplex med ny RPMI innehållande 10 % serum. Därefter räknades cellerna för var och en av de siRNA-transfekterade cellerna för att representera 24-timmarstidpunkten. Därefter skördades och räknades en uppsättning celler, som kördes i parallellkultur, vid 48 timmars respektive 72 timmars tidpunkter.

När PDT hade bestämts för alla de störda generna i målgruppen beräknades RT (i timmar) för var och en av dem för G1-, S- och G2-fasen enligt följande:

where; % cellpopulation bestämdes med hjälp av FACS-förvärv.

Data Tillgänglighet

Masspektrometridata deponerades som dataset ”Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.” till ProteomeXchange via PRIDE-databasen. De är offentligt tillgängliga via ProteomeXchange med identifieraren ProteomeXchange: PXD005557. Datamängden består av 12 råfiler (wiff och wiff.scan) och tillhörande 18 proteinpilotfiler.