6.2.3 Cowpea Mosaic Virus

Cowpea mosaic virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) är den mest studerade plattformen för olika konjugationer och biotekniska tillämpningar. Det är ett 30 nm isosaedriskt virus och består av ett tvådelat positiv-sens, enkelsträngat RNA-genom där varje RNA-molekyl är inkapslad i en separat partikel. CPMV:s kapsid består av 60 kopior av var och en av två olika CP-underenheter (kallade små, 24 kDa, och stora, 42 kDa) med pseudo T = 3 ikosaedrisk symmetri. På grund av förekomsten av den mycket symmetriska och heteromeriska karaktären hos kapsiden ger CPMV en anmärkningsvärd möjlighet att differentiellt införa (i femdubbla eller tredubbla eller båda positionerna) flera typer av funktionaliteter genom specifik genetisk och kemisk ingenjörskonst med kontroll över både den rumsliga fördelningen och graden av multivalens (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). CPMV kan renas i stora mängder från infekterade blad och är stabil i ett brett temperaturintervall (upp till 60 °C) och i pH-intervallet 3,0-9,0 och tål vissa organiska lösningsmedel (Steinmetz et al., 2009). CPMV-kapsider används för kontrollerad immobilisering av aktiva enzymer. Användning av CPMV-kapsiden för templattillverkning av metalliska nanopartiklar genom en elektrolytisk deposition (ELD) och mineralisering genom en mängd olika processer möjliggjorde tillverkning av tunna skikt av metaller och legeringar med enhetlig tjocklek och sammansättning. CPMV-virioner används som nanobyggstenar för kontrollerad konstruktion av 2D- och 3D-strukturer med hjälp av en bottom-up, layer-by-layer (LbL)-strategi för potentiella tillämpningar som nanoelektroniska enheter eller elektrokemiska multipla biosensorer (granskad i Culver et al., 2015; Wen et al, 2015a, 2016; Narayanan och Han, 2017a).

Nativa CPMV-partiklar och CPMV-partiklar som derivatiserats med lantanidmetallkomplex befanns vara säkra och icke-toxiska, baserat på biodistributions-, toxicitets- och patologistudier av dessa partiklar in vivo (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). CPMV visade sig vara förknippat med regioner med inflammation och inducerade störningar i blod-hjärnbarriären under infektion i centrala nervsystemet (CNS) hos möss (Shriver et al., 2009). CPMV med yt-PEGylering har visat låg immunogenicitet, och internalisering förhindrades i flera celltyper på grund av minskad ospecifik bindning (Raja et al., 2003). Manchester och medarbetare upptäckte att fluorescerande märkt CPMV har en endogen kapacitet att tas upp av vaskulära endotelceller och kan användas som en intravital bildsond för att visualisera kärlsystemet och blodflödet till ett djup på upp till 500 μm under 72 timmar i levande mus- och kycklingembryon (Lewis et al., 2006). CPMV visade sig ha en naturlig förmåga att binda till ytvimentin, ett cytoskelettprotein som modulerar cellernas arkitektur och dynamik, och visade sig vara överuttryckt i endotel-, cancer- och inflammatoriska celler (Koudelka et al., 2009). CPMV:s biokompatibla, naturliga interaktion med vimentin och endotelhållande egenskaper har vidare utnyttjats för att avbilda tumörangiogenes och tumörhoming in vivo (Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al., 2011; Wen et al, 2015a).

Den yttre ytan av CPMV-kapsiden har modifierats i stor utsträckning med hjälp av naturligt förekommande eller genmanipulerade exponerade lysin-, cystein-, tyrosin- och asparaginsyre- och glutaminsyrarester med hjälp av kemiska standardkonjugeringsmetoder och konjugerande tvärbindare för att fästa flera reagenser, t.ex. au-nanopartiklar, redoxreaktiva metylviologengrupper, metallorganiska ferrocenkarboxylatgrupper, fluorophorer, biotin, PEG-kedjor, stilbenderivat, kolhydrater, heterologa proteiner (t.ex.g., humant holotransferrin, T4-lysozym, LRR-domianen i internalin B och genprodukten Intron 8 i HER2-receptorn för tyrosinkinas), antikroppar, oligonukleotider, halvledarkvantprickar och fullerener. Inkorporering av onaturliga aminosyror i CPMV:s kapsid skedde med hjälp av flera ortogonala kemier (t.ex. kemoselektiv hydrazonligeringsstrategi och kopparkatalyserad azid-alkynecykloaddition (CuAAC) eller ”klickreaktion”). Dessa ansträngningar har underlättat användningen av CPMV-partiklar som optiska sonder, vaccinkandidater och minnes- och sensornanoanordningar (granskad i Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso och Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff och Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan och Han, 2017a). CPMV och TMV laddades för att bära kontrastmedel för dual-modalitet magnetisk resonans (MR) och optisk avbildning, och båda modaliteterna visade specificitet för fibrinbindning in vitro med närvaro av målande peptider. Prekliniska studier i en fotokemisk modell för trombos i en halspulsåder bekräftade nanosondernas trombushållning, där de långsträckta TMV-stängerna uppvisade betydligt större fasthållning till trombier än icosahedral CPMV (Wen et al., 2015b,c). CPMV dekorerade med E7p72-peptider (hög affinitet epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7) bindande peptid som specifikt riktar sig mot mänskliga endotelceller) riktade sig till tumörassocierad neovaskulatur med hög specificitet enligt bedömning av intravital avbildning (Cho et al., 2017).

In vitro- och in vivo-monteringsprotokoll för CPMV:s kapsidunderenheter är ännu inte väl etablerade. Detta har begränsat dess potential att användas som nanokontainer för inkapsling av lastmolekyler. Nativt nukleinsyrainnehåll i CPMV-virioner användes som en elektrostatisk svamp för att attrahera bildgivande medel och terapeutiska molekyler via en enkel infusionsteknik (Yildiz et al., 2013). Transient samexpression av CPMV-prekursorn (VP60) som består av fusionerade stora och små proteiner och 24K-proteinas för proteolytisk bearbetning av VP60 i växter resulterade i CPMV VLPs (eCPMV), som helt saknade RNA (antingen virus eller värd) (Saunders et al., 2009). Sådana tomma kapslar har använts för att bära en mängd olika lastmolekyler, såsom metaller, fluorescerande färgämnen eller läkemedel (Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a; Narayanan och Han, 2017a). Fluorofoner, biotinaffinitetsmärken, PEG och olika peptider har selektivt visats på den tomma CPMV:s inre yta genom att rikta in sig på reaktiva lysiner (Wen et al., 2012b). Effekten av eCPMV som ett in situ-vaccin visades i musmodeller av metastaserande melanom, bröstcancer, äggstockscancer och tjocktarmscancer, där det inducerade ett antitumorimmunrespons genom att utlösa aktivering och infiltration av neutrofiler, vilket resulterade i en kemo-/cytokinprofil som leder till aktivering av adaptiv immunitet. De flesta möss som återigen utsattes för tumörer på den motsatta flanken stötte helt bort den återigen utsatta tumören (Lizotte et al., 2016). Intratumoral leverans av magnetiska nanopartiklar (mNP) för att inducera hypertermi och eCPMV i kombination förbättrade den lokala och systemiska tumörbehandlingseffekten (fördröjning av sekundär tumörtillväxt (abscopal effekt) och motståndskraft mot återutmaning av tumör) i cancercellmodellerna C3H-mus/MTG-B bröstadenokarcinom och C57-B6-mus/B-16-F10-melanom (Hoopes et al., 2017a). Med hjälp av åtta spontana cancersjukdomar hos hundar (två orala melanom, tre orala amelioblastom och ett karcinom) visade Hoopes et al. (2017b) att hypofraktionerad strålning och mNP-inducerad hypertermi och intratumoral eCPMV-behandling i kombination visade sig framkalla förstärkta immunsvar.

För att använda CPMV för riktad leverans av läkemedel till cancerceller och för att övervinna den naturliga interaktionen mellan CPMV och däggdjursceller användes en ”klick”-reaktion för att konjugera PEG och folatligandenhet (CPMV-PEG-FA) till CPMV. Denna konjugering gjorde det möjligt att rikta CPMV specifikt mot folatreceptorer (FR) som uttrycker HeLa- och KB-celler (Destito et al., 2007). CPMV:s inriktning på neuroblastomtumörceller uppnåddes genom att CPMV modifierades genetiskt för att visa neuropeptid Y-analogen (NPY) som en inriktningsligand. Det visades att CPMV-NPY interagerade specifikt med SK-N-MC-celler som överuttryckte Y1-receptorn (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). Receptorriktad avbildning uppnåddes genom att förankra korta peptidsekvenser (F56 och bombesin som är specifika för vaskulär endotelial tillväxtfaktorreceptor-1 (VEGFR-1)) respektive gastrinfrisättande peptidreceptorer (GRPR)) till CPMV. Dessa CPMV-baserade sensorer visade sig vara specifika när det gäller att binda till cancerceller som överuttrycker dessa receptorer på cellytan (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen och Steinmetz (2014) utvecklade en bottom-up-strategi för syntesen av CPMV-nanopartiklar, dimerer och sammansättningar som innehåller målinriktade ligander (cykliska RGD-peptider) och fluorescerande färgämnen och fann att symmetrisk presentation av RGD-peptider och dimerisering av nanopartiklar ökade effektiviteten av målinriktning mot cancerceller.

CPMV har använts med framgång för visning av flera heterologa peptider för att framkalla immunsvar. Immunisering av djur med var och en av chimärerna inducerade ett starkt humoralt immunsvar som var skyddande mot utmaning av respektive patogen. Multivalent visning av antivirala molekyler och kolhydrater på CPMV underlättade deras användning för terapeutiska tillämpningar (Lomonossoff och Evans, 2011; Koudelka et al., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) etablerade kovalent konjugering av dox till CPMV genom antingen en amidbindning eller en disulfidbro med hjälp av lysin- eller cysteinrester på CPMV:s yttre yta. De dox-belastade CPMV uppvisade högre celldödande effekt än fritt dox även vid låga doser. CPMV som modifierats med en korona av negativt laddade dendroner användes för att ladda positivt laddade fotosensibiliserare (för fotodynamisk terapi (PDT)). Detta hybridbärarsystem för PDT-CPMV var effektivt för att döda både melanomceller och makrofager in vitro (Wen et al., 2016). För att övervinna den dosbegränsande icke-specifika toxiciteten hos trivalent krom (ett fördelaktigt mineralnäringsämne), som selektivt kan hämma proliferationen av högglukosinducerade humana aortiska glatta muskelceller (HASMC) in vitro, Kromklorid laddades in i CPMV:s inre hålighet via infusion, och de resulterande CrCl3-belastade CPMV-partiklarna (CPMV-Cr) minskade signifikant den glukosinducerade HASMC-proliferationen och uppvisade antiaterogena effekter under hyperglykemiska förhållanden (Ganguly et al., 2016).