Levermetastaser har varit närmast relaterade till CEA. Molekylvikten för CEA-protein i normala celler är 72 kDa. CEA med en molekylvikt på cirka 180-200 kDa har dock påvisats i cancercellinjer och patienter, vilket återspeglar de många glykosyleringsmodifieringsställena och de olika glykosyleringsmönstren i cancerceller . Andra modifieringsställen än glykosylering har inte rapporterats. CEA är ett glykofosfatidylinositol- (GPI-) länkat membranförankringsprotein som är exponerat på cellytan som vetter mot den extracellulära matrisen. CEA:s membranförankringsregion kan klyvas av fosfolipas C och fosfolipas D. De klyvda produkterna är lösliga och cirkulerar i blodkärlen. CEA kan alltså förekomma i sekretade och cellytförankrade former.

CEA är funktionellt förknippat med cellulär interaktion, celladhesion, immunsvar, anoikisresistens och främjande av levermetastasering . CEA överuttryck är förknippat med många typer av cancer, inklusive gastrointestinala, respiratoriska och genitourinära system och bröstcancer . CEA finns i det apikala membranet i normal vävnad men är överuttryckt i CRC och upptar hela ytan av cellmembranen hos kolorektalcancerpatienter .

CEA är en av de äldsta och mest använda tumörmarkörerna för övervakning av tumörrecidiv efter kirurgisk resektion och prognos. En liten ökning av CEA-nivån kan vara förutsägande för återfall efter kurativ kirurgi för CRC upp till ett år före uppkomsten av kliniska symtom . Framsteg inom ny teknik för avbildning och målinriktning har avslöjat andra tumörmarkörer . CEA är dock fortfarande den mest tillförlitliga och känsliga biomarkören för CRC. CEA:s uttrycksnivå i serum är en viktig faktor vid stadieindelning av tjocktarmscancer och vid beslutsfattande om framtida terapeutiska strategier . CEA-protein- och mRNA-uttrycksnivåer i serum är användbara tidiga markörer för återfall i bukspottkörtelcancer och CRC-patienter. Förhöjningar av CEA i serum på 50-60 % kan förekomma . CEACAM1, CEACAM6 och NCA-90 används också prognostiskt för att förutsäga tumöråterfall i bröst-, lung- och kolorektalcancer .

CRC-relaterat och överuttryckt CEA cirkulerar genom blodkärlen och kommer in i levern. Där påverkar det sannolikt flera steg i levermetastasering. CEA skyddar mot anoikis-medierad celldöd från cirkulerande CRC-celler. CEA kan också påverka lungmetastasering. Denna översikt kommer att fokusera på CEA:s roll i CRC-cellers överlevnad i levervävnad och i levermetastasering från kolorektalcancer.

3. CEA och levermetastasering

Metastasering är en flerstegsprocess där maligna celler sprider sig från det ursprungliga tumörorganets plats för att kolonisera avlägsna organställen . Den metastatiska kaskaden inbegriper mycket komplicerade cellbiologiska händelser. För att metastasera måste cancercellerna uthärda stränga stimuli från närliggande miljöer och genomgå en sekvens av steg. Dessa steg omfattar lokal invasion av cancerceller i omgivande extracellulära matrix (ECM) och stromala cellskikt, intravasering i blodkärl, överlevnad och cirkulation i blodkärl, stopp på avlägsna organställen, extravasering i parenkymet i avlägsna vävnader, initial överlevnad i främmande mikromiljöer och återstart av proliferation på metastatiska ställen för att generera makroskopiska och kliniskt påvisbara neoplastiska tillväxter .

Teoretiskt sett kan cirkulerande cancerceller som har sitt ursprung i den primära cancern spridas och överleva i en mängd olika sekundära vävnader och organ. Metastasering har dock endast rapporterats i en begränsad delmängd av målorganen . Värdens mikromiljöer kan vara en av de viktiga faktorerna och avgörande faktorerna för cancercellernas överlevnad i främmande vävnader. Cancerceller som har sitt ursprung i ett specifikt organ kan ha prioriterade mål för metastasering. De viktigaste organen för CRC-metastasering är levern och lungorna, medan de viktigaste organen för bröstcancermedierad metastasering är ben, lungor, lever och hjärna . Nästan 80 % av den metastasering som sker vid CRC är riktad mot levern. CRC sprider sig sällan till benet . Under metastasering får cancerceller förmågan att förändra mikromiljön för att gynna sin överlevnad i sekundära organ. Inflammatoriska reaktioner som produceras av intilliggande stromaceller eller makrofager som rekryteras av cancerceller är de viktigaste faktorerna för cellernas överlevnad i främmande vävnader och efterföljande metastasering . Många immunrelaterade genuttrycksnivåer påverkas av metastasering.

Ett direkt samband mellan CEA-produktion och metastaseringspotential i levern har dokumenterats för humana koloncancerceller . Injektion av CEA i möss före injektion av svagt metastatiska cancerceller kan öka levermetastasering av de injicerade cellerna . Svagt metastatiska koloncancercellinjer kan bli mycket metastatiska efter transfektion med CEA cDNA . Omvänt kan inhibering av CEA-uttrycket minska leverns metastatiska potential hos CRC-celler . CEA har ett aminosyrablock av Pro-Glu-Leu-Pro-Lys (PELPK) som ligger i position 108-112 mellan N- och A1-domänens gångjärnsområde i CEA. PELPK-penta-peptidaminosyrasekvensen är CEA:s bindningsmotiv för Kupffer-celler, vilket är förknippat med initiering av metastasering och mesenkymal-epitelövergången (MET) vid levermetastasering från cirkulerande CRC-celler .

Influenserna av CEA på levermetastasering innefattar överlevnad av cirkulerande tumörceller i blodkärl, aktivering av Kupffer-celler genom bindning till hnRNP M4, Kupffer-cellmembranprotein, förändrade leverns mikromiljöer samt adhesion och överlevnad av cirkulerande CRC-celler i levern.

3.1. Överlevnad av cirkulerande tumörceller genom CEA

De flesta celler utom cirkulerande blodrelaterade celler håller sig nära vävnaderna. Detta möjliggör effektiv kommunikation mellan intilliggande celler och ECM för att tillhandahålla viktiga signaler för tillväxt och överlevnad. När celler lossnar från ECM förlorar de de normala cell-matrixinteraktionerna och cellpolariteten. De kan genomgå anoikis, en apoptosprocess som induceras av att förankringsberoende celler lossnar från den omgivande miljön eller ECM . Metastasering i avlägsna sekundära organ kräver att tumörcellerna övervinner anoikis-medierad celldöd och överlever i blodkärlen.

Anoikis-medierad celldöd är förknippad med förlust av integrinmedierad celladhäsionssignalering . De lossnade cellerna kan producera tumörnekrosfaktor- (TNF-) relaterad apoptosinducerande ligand (TRAIL), TRAIL-R2-liganden och dödsreceptor 5 (DR5), ett nyckelprotein för anoikis i cellinjer för tjocktarmscancer . CEA på cellytan kan skydda cancerceller från anoikis hos CRC-patienter genom att direkt binda till DR5 och därmed blockera celldödssignaler i cirkulerande tumörceller . PELPK-penta-peptiden i CEA är också kritisk för CEA:s bindning till DR5; bindningen hämmar DR5-medierade celldödssignaltransduktioner nedströms .

Cellytan av CEA kan också interagera direkt med transforming growth factor-β (TGF-β) typ I-receptorn (TBRI). Interaktionen förändrar nedströms TGF-β-signalvägen och ökar tumörcellsproliferationen . Till skillnad från interaktionen mellan CEA och DR5 är det oklart om PELPK-sekvensen är involverad i interaktionen mellan CEA och TBRI.

CEACAM6 skyddar också många typer av cellinjer från apoptos och anoikis . CEACAM1 är associerad med apoptos i cellinjer för bröst- och tjocktarmscancer . CEA och CEACAM6 är antiapoptotiska funktionella proteiner, medan CEACAM1 deltar i apoptos. Den molekylära karaktären hos dessa omvända funktioner är oklar.

3.2. Arrest av cirkulerande tumörceller i levern genom bindning av CEA till hnRNP M4 i Kupffer-celler och aktivering av Kupffer-celler med CEA för levermetastasering

I den metastatiska kaskaden arresteras cirkulerande tumörceller i avlägsna organ. Först möter de makrofager som produceras genom differentiering av monocyter i vävnader. Både monocyter och makrofager har fagocytiska egenskaper. Makrofagernas huvudroll är fagocytos, en process där man slukar och smälter cellrester eller patogener. Den skyddar så småningom parenkymvävnader från stimuli och skador. Makrofagerna stimulerar också lymfocyter och andra immunceller att reagera på patogener . Kupfferceller är hepatiska makrofager som befinner sig i de hepatiska sinusoiderna via portalcirkulationen. Kupffercellerna är vända mot det sinusoidala lumenet och har direkt kontakt med portalcirkulationen. Cellerna avlägsnar kemiska föreningar och döda eller skadade celler, eliminerar bakterier och skyddar levern mot invasion av tumörceller . Förhöjda nivåer av cirkulerande CEA som utsöndras från CRC-celler kan aktivera Kupffer-cellernas funktioner, vilket är ett kritiskt steg i levermetastasering av CRC-celler.

Kupffer-celler uttrycker hnRNP M4-protein. Proteinet är en CEA-receptor och uttrycks ubiquitärt. Det lokaliseras normalt i kärnan. Kupfferceller, andra terminalt differentierade makrofager som lungalveolära makrofager och vissa cancerceller, inklusive den mänskliga CRC-cellinjen HT29, uttrycker hnRNP M4 på cellytan . Vad som styr hnRNP M4 till cellytan är okänt. Kupffercellerna uttrycker två alternativa splicingvarianter av hnRNP M4. Båda binder till CEA. De viktigaste rollerna för hnRNP är att reglera bearbetning av mRNA, alternativ splicing, biosyntes av mikroRNA och transport av mRNA till cytoplasman från kärnan . Däremot har hnRNP M4 en unik funktion i Kupffer-celler och alveolära lungmakrofager som receptor för CEA . PELPK-peptidsekvensen i CEA är viktig för bindningen till hnRNP M4 . Andra proteiner som innehåller PELPK-sekvensen och som reagerar med hnRNP M4 har inte hittats.

Kupfferceller kan rensa ut cirkulerande CEA i blodet. Särskilt viktigt är att lever- eller lungmetastasering från CRC-celler börjar med bindning med CEA och hnRNP M4-medierat cellulärt upptag av CEA. Patienter som producerar PELPK-muterat CEA har mycket höga CEA-nivåer i serum. Dessutom uppvisar det muterade CEA en lägre clearance från cirkulationen hos försöksdjur , vilket tyder på att PELPK är viktigt för bindningen av CEA med hnRNP M4 och det cellulära upptaget i Kupffer-celler.

Kupffer-cellerna aktiveras av interaktionen med CEA. De aktiverade cellerna inducerar överuttryck av cytokiner och förändrar mikromiljön så att cirkulerande kolorektala tumörceller kan överleva i levern . Aktiverade Kupfferceller producerar en rad cytokiner, kemokiner, proteiner och metaboliter. Dessa inkluderar interleukin- (IL-) 1-α, IL-1-β, IL-6 och IL-10; interferon-γ (IFN-γ); TGF-β; TNF-α; trombocytaktiverande faktor (PAF); monocytkemotaktiskt protein-1 (MCP-1); makrofaginflammatoriskt protein (MIP-1); Matrixmetalloproteinas (MMP-) 1, MMP-7 och MMP-13, syre- och kvävearter inklusive superoxid, väteperoxid och kväveoxid samt lipidmetaboliterna prostaglandin D2 och E2. Interleukiner och TNF-α är särskilt viktiga cytokiner för aktivering av Kupfferceller. Deras produktion i lokaliserade mikromiljöer inom leverns sinusoid har olika biologiska effekter .

Celladhesion är avgörande för att cirkulerande tumörceller ska kunna arresteras och överleva i avlägsna sekundära organ. Kupfferceller som aktiveras vid bindning av CEA kan producera IL-1-β och TNF-α som kan öka vidhäftningen av CRC-celler till endotelceller . Generering av cytokiner från mänskliga Kupffer-celler resulterar i överexpression av celladhesionsmolekyler som ICAM-1, VCAM-1 och E-selectin i endotelceller, vilket kan påvisas i ett multicell-kokultursystem som inkuberats med CEA-producerande koloncancerceller, Kupffer-celler och endotelceller .

Arrest av cirkulerande tumörceller i levern kan öka produktionen av kväveoxid (NO) och reaktiva syrearter (ROS) för att avlägsna tumörcellerna. NO och ROS har viktiga roller i makrofagmedierad immunitet . De påverkar cancerrelaterade cellfunktioner som cellöverlevnad, intravasering och angiogenes. Reglering av NO-nivån är ett kliniskt viktigt sätt att kontrollera cancerutvecklingen . NO och ROS påverkar levern negativt, vilket resulterar i immunsvarsmedierad död av CRC-celler . CEA-aktiverade Kupffer-celler kan frigöra den antiinflammatoriska cytokinen IL-10, som är viktig för tumörcellernas överlevnad på grund av inhiberingen av uppregleringen av inducerbart kväveoxidsyntas och produktionen av NO och ROS . IL-6 som utsöndras av aktiverade Kupffer-celler kan främja metastasering genom hepatocyte growth factor (HGF) . En korrelation mellan uttrycksnivån för CEA och IL-6 har rapporterats i serum från CRC-patienter .

Levermetastasering vid CRC kräver att man genomför en rad steg. Cirkulerande CRC-celler som uttrycker CEA kan blockera anoikis i blodet. De kan stöta på Kupffer-celler i levern och förändra leverns mikromiljöer för att gynna etableringen av en tumör. Hur CEA påverkar de många stegen i levermetastasering, t.ex. hur CEA-interaktion med Kupffer-celler inducerar signaltransduktion och aktiverar cellerna, är fortfarande oklart.

3.3. Aktivering av celladhesionsrelaterade proteiner av CEA

Cell-till-cell-adhesion är kritisk för kommunikation med närliggande celler och vävnadsarkitekturer. CEA som finns som ett GPI-länkat membranförankringsprotein fungerar som en cell-till-cell-adhesionsmolekyl som förbinder epitelcellmembran och i cellkluster . GPI-länkad CEA påverkar också intercellulär vidhäftning genom antiparallellel reciprok självinteraktion. CEA fungerar som en celladhesionsmolekyl genom homofil interaktion mellan CEA och CEA, CEA och CEACAM1 eller genom heterofil interaktion mellan CEACAM6. För homofila och heterofila interaktioner krävs en interaktion mellan N-domänen med variabla Ig-domäner och A3B3-domänen hos motparten CEA. Detta fenomen är en unik egenskap hos CEA . Även om A3B3-domänens funktioner inte har karakteriserats till fullo, finns det 28 asparaginlänkade högt glykosylerade platser i A3B3-domänen . Huruvida dessa modifieringar är viktiga i den antiparallella ömsesidiga självinteraktionen är oklart.

Cellytan CEA stör vävnadsarkitekturen och hämmar differentiering och anoikis genom aktivering med integrin-signalvägen . I cellmembranet kolokaliseras GPI-linkat CEA och α5β1-integrin. α5β1-integrin är den viktigaste receptorn för ECM. Således ökar dess kolokalisering med CEA cellernas bindning till fibronectin och aktiverar nedströmssignaler genom reglering av PI3K- och AKT-aktivitet . N-domän-deletionsmutant av CEA är oförmögen till självbindning eller klusterbildning, medan N-domän-deletionsmutanten CEA kan kolokalisera med α5β1-integrin på cellytan . Dessa resultat tyder på att N-domänen av CEA är obehövlig för kolokalisering av CEA och α5β1 integrin.

Glykosylering är en av de vanligaste posttranslationella modifieringarna av proteiner. Glykosylerade proteiner har kritiska roller i tumörceller . Glykosyltransferas överuttryck är ett tumör kännetecken och kan användas som en tumörmarkör . Glykosyleringsmodifierat CEA uttrycks i hög grad i koloncancertumörer jämfört med normala vävnader . Tumörspecifikt glykosylerat CEA kan interagera med dendritiska cellspecifika intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN) . Denna interaktion förmedlas genom att DC-SIGN binder Lewis(x) och Lewis(y), som förekommer i höga halter i CEA från CRC-celler . Interaktion mellan tumör CEA och DC-SIGN kan undertrycka tumörspecifika immunsvar från dendritiska celler för tumörutveckling. CEA-verkande biologiska händelser i levermetastaser sammanfattas i figur 2.

Figur 2

Schematisk framställning av CEA-verkande biologiska händelser. Proteiner som anges med röda bokstäver är direkt interagerande molekyler med CEA. Streckade pilar innebär konsekvenser av biologiska händelser som påverkar CEA. I cirkulerande kolorektalcancerceller interagerar DR5 (dödsreceptor 5) och TBRI (TGF-β typ I-receptor) med CEA. Interaktionen med DR5 resulterar i en hämning av caspase-8-aktiviteten, vilket inducerar en anoikishämning. Interaktion med TBRI gör att TGF-β-signalvägar förändras. Följaktligen kan cancerceller onormalt växa över. I Kupfferceller interagerar hnRNP M4 med CEA och utsöndrar en rad cytokiner som IL-6, IL-10 och TNF-α. Dessa cytokiner kan förändra leverns mikromiljöer till en metastasivänlig miljö för effektiv metastasering av primära tumörceller. CEA interagerar också med CEA antiparallellt och integrin. Interaktion mellan CEA och integrin med CEA ökar celladhesion och förvrängning av cellarkitekturen samtidigt som celldifferentiering hämmas.

4. CEA-målinriktade terapeutiska tillvägagångssätt

Sedan upptäckten att överuttryck av CEA är starkt förknippat med CRC-progression och levermetastasering har man försökt att inrikta sig på CEA som ett terapeutiskt tillvägagångssätt för att motverka cancer. Olika verktyg som riktar sig mot CEA har utvecklats och undersökts kliniskt, bland annat vacciner, dendritiska celler och antikroppar.

Vacciner har utvecklats mest intensivt. Immunisering med vacciniavirus som uttrycker rekombinant CEA kan avsevärt minska tillväxten av tumörer som transducerats med CEA-genen i en syngeneisk musmodell . Vacciner har utformats för att framkalla immunsvar mot tumörspecifika antigener eller tumörassocierade antigener, i syfte att hämma utvecklingen av cancer som uttrycker något av antigenerna. Konstruerade virus eller DNA-vektorer som uttrycker CEA har utvecklats som vacciner för att framkalla immunsvar mot CEA-uttryckande cancerceller . Vacciner baserade på dendritiska celler har också utvecklats genom att ladda dendritiska celler med CEA-peptid eller mRNA för att framkalla CEA-specifika T-cellsvar . Rekombinant virus- eller DNA-baserade och dendritiska cellbaserade vacciner har visat sig ge ett starkt immunsvar mot CEA, vilket har lett till fördröjd tumörprogress och förlängd överlevnad hos vissa cancerpatienter . I den studien misslyckades dock vaccinationen med att avlägsna tumörer i de flesta fall, förmodligen på grund av den hämmande effekten av tumörens mikromiljö på immunsvaret. Därför behövs sambehandling med läkemedel som kan hämma de immunsupprimerande effekterna för att optimera effekten av cancervaccin.

CEA-specifika antikroppsbaserade metoder har också studerats intensivt för att hämma cancerprogression. Olika målspecifika antikroppar har utvecklats som läkemedel. Många av dem, särskilt de mot cancer och reumatism, är redan kommersiellt tillgängliga och populära. CEA-specifika antikroppar kan effektivt hämma cancerprogression och metastasering i djurmodeller . Behandling med enbart CEA-specifika antikroppar har visat minimala effekter i kliniska prövningar, vilket troligen beror på deras dåliga tumörpenetration och snabba clearance av antikroppar med hög affinitet med fritt cirkulerande CEA . För att öka de cancerbekämpande effekterna har CEA-antikroppar konjugerats med olika molekyler, t.ex. radioisotoper, immunotoxiner, cytokiner och cytotoxiska enzymer . Nyligen utvecklade kombinationsbehandlingar har utnyttjat CEA och bispecifika antikroppar mot T-celler eller bispecifika antikroppar i kombination med antikroppar mot immunkontrollpunktmolekyler, inklusive anti-PD-1- eller anti-PD-L1-antikroppar . De kombinatoriska tillvägagångssätten visade effektivare anticancereffekter i kliniska studier genom att maximera rekryteringen av T-celler och dödandet av tumörer.

Trots de olika verktygsbaserade CEA-målinriktade anticancermetoderna är tumörmålinriktade och tumörundertryckande aktiviteter fortfarande begränsade. De mest effektiva CEA-riktade verktygen är baserade på induktion av ett immunsvar mot CEA. Däremot har få läkemedel som är direkt riktade mot CEA utvecklats. Ett nytt terapeutiskt tillvägagångssätt mot levermetastaser utvecklades genom identifiering av en antimetastatisk, CEA-specifik RNA-aptamer . En aptamer är en enkelsträngad DNA- eller RNA-nukleinsyra som kan binda till specifika molekylära mål som omfattar proteiner, kemikalier, joner och celler. Den kan identifieras genom in vitro-selektionsmetoder som kallas systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning (SELEX) . Aptamerer har terapeutiska fördelar jämfört med antikroppar, bland annat liten storlek, hög affinitet och specificitet, penetration till tumörvävnad, effektiv kemisk syntes och konjugering samt låg immunogenicitet . Aptamerer har också fördelaktiga egenskaper vid cancerterapi och bildbehandling, bland annat snabbt upptag i tumören, snabbt bortfall i blodet och långvarigt kvarhållande i tumören . CEA-specifik aptamer kan specifikt binda till de tidigare nämnda PELPK-penta-peptidaminosyrorna, som har viktiga roller i levermetastasering och anoikisresistens. Viktigt är att en aptamer effektivt kan minska volymen av levermetastaserande tumörer från koloncancerceller i musmodeller . Bindning av en CEA-aptamer till PELPK:s penta-peptidsekvens kan hämma CEA:s bindningsförmåga till hnRNP M4 eller DR5, vilket blockerar levermetastasering och ger cancercellerna känslighet för anoikis. Dessutom kan aptamer-specifik bindning med CEA-protein och CEA-uttryckande cellytor vara användbar som ett verktyg för att rikta och fånga celler, diagnostik och molekylär avbildning. Anoikisresistens hos cirkulerande cancerceller som orsakas av uppreglering av CEA kan framkalla läkemedelsresistens . Därför kan CEA-märkt aptamer som används ensam eller i kombination med kemoterapeutiska läkemedel, t.ex. en blandning av aptamer och läkemedel eller aptamer-läkemedelskonjugat, vara en fördelaktig metod för att motverka metastasering.

5. Slutsats

Metastasering är ett stort hinder att övervinna för att bota cancer. Till skillnad från primära cancerformer är metastasemedierad spridning av sekundära cancerformer svår att utrota. Dessutom återkommer de lätt. Ett samband mellan CEA-uttryck i cancerceller och metastasering har bekräftats. PELPK-regionen mellan N- och A1-domänerna i CEA:s gångjärnsregion är viktig för levermetastaser från CRC. Den skyddar cirkulerande CRC-celler från anoikis i blodkärl och orkestrerar Kupffer-cellernas funktioner för att förändra leverns mikromiljöer till en metastaseringsvänlig miljö, vilket underlättar cancercellernas överlevnad i levern.

CEA-överuttryck är associerat med många typer av cancer. CRC-patienter uppvisar höga uttrycksnivåer av CEA. CEA används som tumörmarkör efter cancerbehandling eller kirurgi hos cancerpatienter. Övervakning och mätning av cirkulerande CEA-nivåer är användbara för patientens prognos och diagnostik. Eftersom CEA är ett kliniskt meningsfullt mål på grund av dess starka korrelation med cancerprogress, metastasering och läkemedelsresistens pågår olika kliniska försök att utveckla olika verktygsbaserade CEA-målsökande anticancerläkemedel.

Detaljerna om hur CEA underlättar metastasering i levern från cirkulerande CRC-celler är fortfarande vaga. Icke desto mindre har ackumulerande experimentella data indikerat CEA:s viktiga roll i metastasering och tumörigenesering. Ytterligare förståelse av detaljerade funktioner, mekanismer och reglering av CEA förväntas leda till utveckling av effektivare metoder mot cancer.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av bidrag från Koreas nationella forskningsstiftelse från ministeriet för vetenskap, IKT och framtidsplanering (2012M3A9B6055200, 2015R1A2A1A1A15054252).