Aminoglykosider: Perspektiv på verkningsmekanismer och resistens samt strategier för att motverka resistens
STRUKTURELLA GRUNDLAGER FÖR VERKNINGSMEDEL
16S rRNA från Escherichia coli är välstuderat bland rRNA-underenheterna, och i synnerhet har interaktionerna mellan olika aminoglykosidantibiotika och 16S rRNA och deras effekter på processen för översättning av mRNA till polypeptid undersökts (35). Liknande rRNA-strukturer finns i andra organismer, t.ex. jäst och Tetrahymena (33). Behandling av rRNA med en aminoglykosid skyddar flera nukleinbaser i rRNA från kemisk modifiering, vilket innebär att dessa molekyler har hög affinitet för vissa platser i rRNA. Detta bindningssätt liknades av Noller (35) vid enzymhämmare, som vanligtvis binder till enzymernas aktiva platser och stör deras verksamhet. Olika klasser av aminoglykosidantibiotika binder till olika platser på rRNA, beroende på den strukturella komplementariteten mellan de två. Exempelvis antas neomycin, paromomycin (fig. 1), gentamicin och kanamycin binda till A-sidan på 16S rRNA i E. coli på ett liknande sätt och visade sig skydda baserna A1408 och G1494 i kemiska fotspårsexperiment (fig. 2) (33). Fyra baser, A1408, A1492, A1493 och G1494, i rRNA:s A-sida interagerar med tRNA, om än med olika affinitet. Bindningen av de ovannämnda aminoglykosiderna till A-sidan i avkodningsregionen (dvs. platsen för kodon- och anticodonigenkänning) stör det korrekta erkännandet av rRNA:s kognitiva tRNA av rRNA under translation (35). Dessa interaktioner antas också störa translokaliseringen av tRNA från A-sidan till peptidyl-tRNA-sidan (P-sidan).
(A) Stereovy av den partiella strukturen av 70S rRNA i komplex med tre tRNA-molekyler (Protein Databank code, 486D). A-site-regionen på 16S rRNA visas i vitt, där aminoacyl tRNA ”A” (i gult) är bundet nära rRNA:s A-site. Två andra tRNA, peptidyl och exit, ”P” (i rött) respektive ”E” (i grönt), visas också. Ryggraden i den näst sista stammen av 16S rRNA-molekylen och 900-slingan visas i violett. Bindningsstället för paromomycin vid A-sidan indikeras av den vita pilen. (B) Stereovisning av lösningsstrukturen för RNA:s A-site-mall som binds av paromomycin, vilket ungefär motsvarar A-site-regionen på 16S rRNA i vitt i panel A. A-site-RNA:s Connolly-yta återges i enlighet med den elektrostatiska potentialen med hjälp av programmet MOLCAD (Tripos, Inc., St. Louis, Mo.), och aminoglykosiden visas som en boll- och pinnrepresentation. Den mest elektronegativa potentialen återges i blått och den mest elektropositiva potentialen återges i rött på ytan; alla andra färger visar potentialen mellan blått och rött. Pilen i vitt visar den knut som genereras av A1492, som inte har någon basparningspartner. Pilen i gult visar den ficka som genereras av basparet A1408 – A1493 och A1492. Pilen i rött visar placeringen av 3-aminet på ring II, platsen för acetylering av AAC(3).
Puglisi och medarbetare (12-14, 39) gav nyligen strukturella bevis för interaktionssättet mellan paromomycin, en representativ aminoglykosid i neomycinklassen, och en 27-nukleotisk RNA-mall som var utformad för att efterlikna A-site-regionen för 16S rRNA i E. coli (Fig.3A). Utformningen av RNA-mallen baserades på tidigare kunskap om att paromomycin interagerar med basparet C1407 – G1494, A1408, A1493 och U1495 och att dessa baser är absolut nödvändiga för hög affinitetsbindning (39) (visas i grått i fig. 3A). Ytterligare strukturella egenskaper, t.ex. den ficka som skapas av asymmetrin i den inre slingan på grund av närvaron av A1492 och basparet C1409 – G1491 i den nedre stamregionen, är också viktiga. Dessa strukturella egenskaper skapar tillsammans en ficka som är optimal för bindning av paromomycin (se nedan).
(A) Modell av A-site RNA-mallen som används för att studera paromomycins interaktioner. Rutan representerar den del av rRNA som är homolog till A-sidan. (B) RNA-aptamermall som använts för att studera interaktionerna med tobramycin.
I den ursprungliga A-site RNA-mallen har stammen basparningsinteraktioner vid U1406 – U1495 (icke-kanonisk) och C1407 – G1494 (fig. 3A). Vid bindning av paromomycin stabiliseras den distinkta struktur som bildas av A1408, A1492 och A1493 (Fig. 2B) och baserna A1408 och A1493 bildar ett icke-kanoniskt baspar (12, 39). Nukleoiden A1492, som inte har några basparningsinteraktioner, skapar en knäckning i RNA-strukturen, och de kombinerade effekterna av A1492 och basparet A1408 – A1493 skapar en utbuktning i A-sidan där paromomycin binder sig och ytterligare förlänger vinkeln på knäckningen (Fig.2B). De funktionella grupperna på paromomycin, såsom hydroxyl- och aminogrupperna, deltar i specifika interaktioner med RNA-molekylen (se nedan).
Fickan som skapats av A1492 och basparet A1408 – A1493 upptas av paromomomycins ring II, och denna ring staplar sig ovanför basen G1491 (visas med en gul pil i fig. 2B) (12). Ring I av paromomycin gör specifika kontakter med de ”universellt” konserverade basparen U1406 – U1495 och C1407 – G1494 i rRNA. Det är anmärkningsvärt att ring I är absolut nödvändig för specifik bindning av aminoglykosidantibiotika till rRNA. Ringarna III och IV i paromomycin förlänger dessa interaktioner ytterligare in i rRNA:s stora spår. Amino- och hydroxylgrupperna bidrar främst till paromomomycins ospecifika interaktioner med rRNA; de är alltså inte sekvensberoende interaktioner. En annan viktig punkt är att basparet C1409 – G1491 ger plats för bindning av aminoglykosid i fickan, och ett felmatchat baspar i denna position resulterar i förlust av bindning (12). I allmänhet binder aminoglykosider som delar strukturella egenskaper med paromomycin till rRNA på liknande sätt (13). Olika aminoglykosidantibiotika tycks dock binda till samma bindningsplats i mer än en konformation (28). I huvudsak måste den konformation av aminoglykosiden som binder till RNA uppfylla de elektroniska och steriska begränsningarna på bindningsstället. I en annan studie av komplexet av gentamicin Cla och A-site RNA-mallen uppvisade ringarna I och II i gentamicin Cla (som liknar ringarna i paromomycin) bindningsinteraktioner som liknade dem i komplexet av paromomycin och A-site RNA-mallen (57). Ring III i gentamicin Cla interagerar dock med basparen U1406 – U1495 och G1405 – C1496 i den övre stamregionen (fig. 3A). Utifrån dessa observationer föreslog Puglisi och medarbetare (57) att alla aminoglykosider som riktar sig mot 16S rRNA:s A-sida binder på ett gemensamt sätt, liknande ringarna I och II i paromomycin och gentamicin.
Och även om den övergripande strukturen hos rRNA är bevarad bland alla arter i evolutionär mening finns det skillnader som gör att bindningen av aminoglykosider är mer specifik – med minst 10 gånger högre affinitet – till prokaryoternas rRNA än till eukaryoternas rRNA (19, 35, 38). Detta är ingen stor skillnad i bindningsaffinitet och kan delvis förklara de toxiska effekterna av dessa antibiotika i däggdjursystem. Eukaryotiskt rRNA innehåller ett guanin i stället för A1408, vilket resulterar i ett baspar G1408 – A1493. Dessutom finns inte det matchade basparet C1409 – G1491 i eukaryoter. Dessa skillnader resulterar sammantaget i lägre affinitet hos aminoglykosider för det eukaryotiska rRNA (12, 19, 35, 38). Efter att ha beskrivit dessa skillnader ändrar bindningen av aminoglykosider till A-sidan av rRNA i prokaryoter A-sidans konformation och påverkar de specifika interaktionerna mellan mRNA och tRNA på denna plats, vilket resulterar i felaktiga interaktioner mellan kodon och anticodon. Det finns hittills få strukturella uppgifter om de specifika aspekterna av dessa interaktioner på ribosomal nivå (se nedan), men den tydliga och slutgiltiga konsekvensen är störning av översättningsprocessen.
En annan strukturell studie utfördes på bindning av tobramycin (Fig.1) till en RNA-aptamer (23). Den RNA-aptamer som användes i denna studie var ett 26-nukleotiskt stamlopps-RNA (fig. 3B). Det finns fyra mismatchpar, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18 och U11 – U16, i denna RNA-aptamer som är en del av den dragkedjeförsedda hårnålsslingan. Tobramycin binds i detta spår som delvis är inkapslat av ytan på det djupa spåret och guaninbasen på resterna G15 (fig. 4). I detta komplex sitter tobramycins ring I på golvet i det djupa spåret. En av aminogrupperna på tobramycins ring II interagerar med fosfatryggen i det djupa spåret och den andra aminogruppen är exponerad för lösningsmedlet. Ring III är placerad i mitten av det djupa spåret, med hydroxylgrupperna riktade mot botten av spåret. Konformationen hos den RNA-aptamer som beskrivs ovan föreslogs likna konformationen hos hårnålsslingorna i tRNA och rRNA (23).
Stereo av komplexet med tobramycin bundet till RNA-aptamern. Den gröna Connolly-ytan representerar en del av aminoglykosidbindningsstället.
Röntgenstrukturen med 7,5 Ås upplösning av det funktionella komplexet avT. thermophilus 70S rRNA som innehåller tRNA och mRNA är till hjälp för att sätta ovanstående diskussion i perspektiv (5). Utifrån denna struktur kan man föreställa sig hur väl modellstudierna med mindre RNA-mallar som tobramycin-RNA-aptameren och A-site-RNA med paromomycin (se ovan) skulle passa in i den fullständiga strukturen av rRNA. A-sidan i 16S rRNA-underenheten av 70S rRNA ses nära gränssnittet mellan tRNA och 50S rRNA-underenheten, i närheten av paret kodon-anticodon (fig. 2A). Vid en jämförelse av lösningsstrukturen av A-site RNA-mallen med A-site i röntgenstrukturen av 70S rRNA visade sig röntgenstrukturen vara nära besläktad med den paromomycinbundna RNA-mallen men inte med den naturliga lösningsstrukturen av A-site RNA-mallen (5). Detta är fascinerande och tyder på att det kanske i den funktionella formen alltid finns en utbuktning eller knäckning nära baserna A1492 och A1493 i 70S rRNA. Om detta skulle vara sant innebär det att bindningsfickan för paromomycin redan finns när 70S rRNA blir funktionellt, och att det därför är predisponerat för hämning av paromomycin. Detta motsäger påståendet att bindning av paromomycin ökar kinkvinkeln vid bindningsstället. Bevis till stöd för denna idé kommer från en nyligen genomförd studie som tyder på att affiniteten hos olika aminoglykosider för A-site RNA-mallen är olika, och att dessa antibiotikas förmåga att hämma proteinsyntesen in vitro också varierar (15). Gentamicin och flera andra besläktade antibiotika interagerar med A-site RNA med dissociationskonstanter (Kd) i det mikromolära området, men de hämmade en translationsprocess in vitro med 50 % hämmande koncentrationer i det nanomolära området (15). Den sistnämnda upptäckten härleddes som ett resultat av aminoglykosidernas bindning till det intakta rRNA i avkodningsregionen (A-site), och skillnaden i bindning till intakt rRNA jämfört med bindningen till A-site-mall-RNA:t kan bero på skillnaderna i konformationerna hos dessa två RNA:t, som diskuterats ovan.
A-site:t har svaga kontakter med mRNA:t och tRNA:t, vilket antyder att denna region spelar en roll i igenkänningen av lämpligt tRNA:t via subtila förändringar i den fria energin (5). Bindningen av aminoglykosid nära denna plats kan påverka den känsliga processen med interaktioner mellan kodon och anticodon. Det föreslogs också att närvaron av en aminoglykosid stabiliserar komplexet av mRNA och tRNA vid A-sidan, vilket i sin tur påverkar översättningsprocessen (5). Det är svårt att gissa alla effekter av aminoglykosider på rRNA-strukturen, och ytterligare strukturstudier med aminoglykosiderna bundna till komplexen, t.ex. 70S rRNA, kommer att vara till hjälp för att belysa och förstå de subtila förändringar som leder till aminoglykosidernas antibiotiska verkan.
I ett antal undersökningar har man använt syntetiska sonder för att förstå interaktionerna mellan RNA-mallar och aminoglykosider. Det har föreslagits att aminoglykosider binder till mer än en målplats i ribozymet (6, 30). Nyligen har flera aminoglykosidantibiotika som neomycin B, tobramycin och kanamycin A dimeriserats antingen symmetriskt eller asymmetriskt med hjälp av ett ”tether”, och deras bindningsaffinitet jämfördes med de monomera moderaminoglykosiderna (30). Det föreslogs att om det fanns flera bindningsställen på RNA, borde de dimeriserade aminoglykosiderna binda med högre affinitet än moderantibiotikan, förutsatt att flera bindningsställen är tillgängliga. Det observerades faktiskt att de dimeriserade aminoglykosiderna binder tillTetrahymena ribozymet 20 till 1 200 gånger bättre än moderaminoglykosiderna. En förklaring till den högre bindningsaffiniteten skulle kunna vara det ökade antalet positivt laddade aminogrupper på den dimeriserade aminoglykosiden, men denna effekt verkar vara synergistisk med den entropiska fördel som erhålls genom dimerisering (30). Det visade också på förekomsten av flera bindningsställen med hög affinitet för aminoglykosidantibiotika i en RNA-molekyl. I en annan studie försökte man utnyttja paromomycinets RNA-bindningsegenskaper och de interkalerande beteendena hos vissa föreningar som pyren och tiazolorange (48). I denna strategi tänkte man sig aminoglykosider som ett sätt att leverera interkalerande ämnen till RNA. Konjugatet av paromomycin med tiazolorange eller pyren visade bättre bindningsegenskaper till den 27-nukleotiska A-site RNA-mallen. I själva verket uppmättes dissociationskonstanten för konjugatet paromomycin-thiazolorange till 46 nM, vilket rapporterades som den högsta affinitet som rRNA A-site har uppvisat för någon ligand.
De strukturella kraven för RNA-bindning av aminoglykosider visade att en utbuktning i RNA-sekvensen är nödvändig för att möjliggöra bindning av aminoglykosider (7). Genom att använda ett specifikt stamloppsderivat av RNA-aptamern utfördes en serie studier av kemisk interferens, kemisk modifiering och mutation för att förstå de strukturella kraven för tobramycins bindning till RNA-aptamern. Denna aminoglykosid tycktes interagera huvudsakligen med nukleinbaserna i RNA-aptamern, men inte med fosfatryggen. Närvaron av en utbuktning föreslogs dock vara viktig för den höga affinitetsbindningen av tobramycin i ett stökiometriskt förhållande, och man drog slutsatsen att en utbuktning skapar en kavitet för interaktioner mellan aminoglykosiden och nukleinbasen (7). Denna analogi kan tillämpas på andra RNA-platser, t.ex. hammarhuvudregionen och A-sidan, där det finns en kavitet på grund av den icke-kanoniska basparningen eller slingor eller utbuktningar som skapar en lämplig plats för aminoglykosiderna att interagera med de anjoniska fosfatgrupperna och nukleinbaserna. I linje med detta lade Westhoff och kollegor (49) fram ett förslag om att interaktionen mellan aminoglykosider och RNA sannolikt är formspecifik snarare än sekvensspecifik.
Sammanhängande med detta koncept ansågs de elektrostatiska fälten i RNA-falsarna vara den styrande kraften för bindningen (se nedan). Hermann och Westhoff (20) kunde identifiera dockningsbekräftelserna för flera aminoglykosidantibiotika i olika RNA-mallar, t.ex. tobramycin-RNA-aptamerer och A-site-regionen i 16S-RNA, för vilka strukturell information fanns tillgänglig. På grundval av dessa observationer förutspåddes aminoglykosidernas bindningssätt till den transaktiverande responselementregionen i hiv (20). I en annan studie om RRE i HIV, bindningsregionen för Rev-proteinet, undersökte Cho och Rando (8) den roll som en utbuktning med en enda bas och en kavitet spelar för bindning av aminoglykosider. I överensstämmelse med tidigare hypoteser härleddes att spår i RNA:s icke-duplexregioner är viktiga för hög affinitetsbindning av aminoglykosider till RNA. I det här fallet påverkade inte den enskilda basutbuktningen bindningen, men kaviteten, en G-rik region som består av två icke-kanoniska baspar och ett enda utbuktat U, har en hög affinitet för aminoglykosider. Att manipulera håligheten minskade RRE RNA:s affinitet för aminoglykosider, vilket tyder på att de icke-kanoniska baspar som innehåller utbuktningar är de primära aminoglykosidbindningsställena i denna RNA-mall (8).