Die Wechselwirkung von Röntgenstrahlen mit den Elektronen in einem Kristall führt zu einem Beugungsmuster, das mathematisch gesehen die Fouriertransformation der Elektronendichteverteilung ist. Die Detektoren, die zur Messung der Röntgenstrahlen verwendet werden, können jedoch nur die Amplitude der gebeugten Röntgenstrahlen messen; die Phasenverschiebungen, die zur Verwendung der Fourier-Transformation und zur Ermittlung der Elektronendichteverteilung erforderlich sind, können mit dieser Methode nicht direkt gemessen werden. Dies ist in der Physik als „Phasenproblem“ bekannt. Vereinfacht ausgedrückt lassen sich die Phasen nicht aus den gemessenen Amplituden der Röntgenstrahlen ermitteln. Es müssen andere Extrapolationen vorgenommen und zusätzliche Experimente durchgeführt werden, um eine Karte der Elektronendichte zu erhalten. In vielen Fällen können die vorhandenen Daten über die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Verbindung hilfreich sein, wenn die Dichtekarte unzureichend ist. Eine andere Methode, die so genannte Patterson-Synthese, ist sehr nützlich, um eine erste Schätzung der Phasen zu erhalten, und sie ist sehr nützlich für die ersten Schritte zur Bestimmung der Struktur von Proteinen, wenn die Phasen nicht bekannt sind. Das Problem kann vereinfacht werden, indem man ein Atom, in der Regel ein Schwermetall, mit Hilfe der Patterson-Synthese findet und dann die Position dieses Atoms verwendet, um die anfänglichen Phasen abzuschätzen und eine anfängliche Elektronendichtekarte zu berechnen, die bei der Modellierung der Position anderer Atome weiterhelfen und die Phasenabschätzung noch weiter verbessern kann. Eine weitere Methode ist die so genannte molekulare Ersetzung, die die Position der Proteinstruktur in der Zelle bestimmt. Neben der molekularen Ersetzungsmethode kann das Phasenproblem auch durch die isomorphe Ersetzungsmethode, die anomale Beugungsmethode mit mehreren Wellenlängen, die anomale Beugungsmethode mit einer Wellenlänge und direkte Methoden gelöst werden.

Molekulare ErsetzungBearbeiten

Das Phasenproblem kann durch ein atomares Modell gelöst werden, das Phasen berechnen kann. Ein solches Modell kann erhalten werden, wenn die zugehörige Proteinstruktur bekannt ist. Um dieses Atommodell zu erstellen, muss jedoch die Ausrichtung und Position des Modells in der neuen Einheitszelle bestimmt werden. Hier kommt die Technik der molekularen Ersetzung (oder MR) ins Spiel.

Molekulare Ersetzung, auch MR genannt, ist eine Methode zur Lösung von Phasenproblemen in der Röntgenkristallographie. MR lokalisiert die Orientierung und Position einer Proteinstruktur mit ihrer Einheitszelle, deren Proteinstruktur homolog zu der unbekannten Proteinstruktur ist, die bestimmt werden muss. Die erhaltenen Phasen können helfen, Karten der Elektronendichte zu erstellen und berechnete Intensitäten der Position des Proteinstrukturmodells zu den beobachteten Strukturen aus dem Röntgenkristallographie-Experiment zu erzeugen.

Die MR-Methode ist auch effektiv für die Lösung makromolekularer Kristallstrukturen. Diese Methode erfordert weniger Zeit und Aufwand für die Strukturbestimmung, da die Ableitung schwerer Atome und die Sammlung von Daten nicht vorbereitet werden müssen. Die Methode ist geradlinig und der Modellaufbau wird vereinfacht, da keine Kettenverfolgung erforderlich ist.

Diese Methode besteht aus zwei Schritten:

1. einer Rotationssuche, um das homologe Modell in der Einheitszelle zu orientieren, oder einem Ziel
2. einem Translationsziel, bei dem das neu orientierte Modell in der Einheitszelle positioniert wird

Patterson-basiertes (molekulares Ersetzen)Bearbeiten

Patterson-Karten sind interatomare Vektorkarten, die Peaks für jedes verwandte Atom in der Einheitszelle enthalten. Wenn die Patterson-Karten auf der Grundlage der aus den Elektronendichtekarten abgeleiteten Daten erstellt wurden, sollten die beiden Patterson-Karten nur dann in enger Beziehung zueinander stehen, wenn das Modell korrekt ausgerichtet und an der richtigen Stelle platziert ist. Dadurch können wir Informationen über die Lage der unbekannten Proteinstruktur und ihrer Zelle ableiten. Bei der molekularen Ersetzung gibt es jedoch ein Problem: Sie hat sechs Dimensionen und drei Parameter zur Angabe von Ausrichtung und Position. Mit den Patterson-Karten kann sie in Teilmengen der Parameter unterteilt werden, um jeden Teil separat zu betrachten.

RotationsfunktionBearbeiten

Die Rotationsfunktion hat intramolekulare Vektoren, die nur von der Orientierung des Moleküls und nicht von seiner Position abhängen, denn selbst wenn das Molekül in der Einheitszelle verschoben wird, werden alle Atome um den gleichen Betrag verschoben, aber die Vektoren zwischen den Atomen sind gleich. Die Patterson-Karte für die unbekannte Proteinstruktur wird mit der homologen bekannten Proteinstruktur in verschiedenen Orientierungen verglichen

Klassische RotationsfunktionBearbeiten

Um die Orientierung zu finden, bestimmen Sie die Rotationsachse und den Drehwinkel um diese Achse. Zur Definition einer Achse (ein Vektor vom Mittelpunkt der Kugel zu einem Punkt auf der Kugeloberfläche) werden zwei Parameter benötigt. Die Drehachse beginnt parallel zur z-Achse und wird um die y-Achse mit dem Winkel ᶱ gedreht, dann dreht sich das Objekt um die z-Achse mit dem Winkel ᶲ und schließlich um die Drehachse mit dem Winkel ᵠ. Diese geben einen Punkt auf der Oberfläche einer Einheitskugel an.

Fast Rotation FunctionEdit

Die Drehfunktion kann durch den Vergleich zweier Patterson-Karten oder der Spitzen in diesen Pattersons berechnet werden. Die Rotationsfunktion kann mit Fourier-Transformationen nur dann viel schneller berechnet werden, wenn die Pattersons als sphärische Harmonische ausgedrückt werden.

Direkte RotationsfunktionBearbeiten

Bei der direkten Rotationsfunktion kann die Proteinstruktur in die Einheitszelle der unbekannten Struktur gesetzt werden, und die Patterson für das orientierte Molekül wird mit der Patterson der gesamten unbekannten Struktur verglichen.

ÜbersetzungsfunktionBearbeiten

Wenn die Orientierung der bekannten Struktur bekannt ist, kann ihr Modell (Elektronendichtekarte) orientiert werden, um Strukturfaktoren zu berechnen, wobei eine Korrelationsfunktion verwendet wird, um den Vektor zu bestimmen, mit dem das Modell über das homologe Modell innerhalb einer asymmetrischen Einheit übersetzt wird.

Mit den korrekt orientierten und übersetzten Phasenmodellen der Proteinstruktur ist es genau genug, um die Elektronendichtekarten aus den abgeleiteten Phasen abzuleiten. Die Elektronendichtekarten können zum Aufbau und zur Verfeinerung des Modells der unbekannten Struktur verwendet werden.

Anomale MehrwellenlängenbeugungBearbeiten

X-Strahlen werden in großen Maschinen, den so genannten Synchrotronen, erzeugt. Synchotrons beschleunigen Elektronen auf nahezu Lichtgeschwindigkeit und lassen sie durch einen großen, hohlen Metallpolygonring laufen. An jeder Ecke wird der Elektronenstrom durch Magnete gebogen, wodurch Energie in Form von elektromagnetischer Strahlung freigesetzt wird. Da sich die Elektronen mit Lichtgeschwindigkeit bewegen, senden sie hochenergetische Röntgenstrahlung aus.

Der Vorteil der Synchrotrons besteht darin, dass die Forscher nicht mehrere Versionen jedes kristallisierten Moleküls züchten müssen, sondern nur eine Art von Kristall, der Selen enthält. Sie haben dann die Möglichkeit, die Wellenlänge auf die chemischen Eigenschaften des Selens abzustimmen. Diese Technik wird als anomale Mehrwellenlängenbeugung bezeichnet. Die Kristalle werden dann mehrmals mit unterschiedlich langen Wellenlängen beschossen, und schließlich entsteht ein Beugungsmuster, mit dem die Forscher die Position der Selenatome bestimmen können. Diese Position kann als Referenz oder Markierung verwendet werden, um den Rest der Struktur zu bestimmen. Dadurch können die Forscher ihre Daten viel schneller erfassen.

Isomorphe ErsetzungsmethodeBearbeiten

Diese Methode vergleicht die Röntgenbeugungsmuster zwischen dem ursprünglichen Proteinkristall und dem gleichen Typ von Kristall mit einem Zusatz von mindestens einem Atom mit hoher Ordnungszahl. Die Methode wurde von Max Ferdinand Perutz (1914-2002) zur Bestimmung der Struktur kleiner Moleküle und schließlich des Hämoglobins verwendet. Ein perfekter Isomorphismus liegt vor, wenn der ursprüngliche Kristall und sein Derivat genau dieselbe Proteinkonformation, Position und Ausrichtung der Moleküle sowie die Parameter der Einheitszelle aufweisen. Der einzige Unterschied, den der Kristall und sein Derivat bei einer perfekten Isomorphie aufweisen, sind die Intensitätsunterschiede, die durch das Hinzufügen schwerer Atome auf dem Derivat entstehen. Diese Unterschiede können manuell oder durch ein automatisches Patterson-Suchverfahren wie SIR 2002, SHELXD, nB und ACORN ermittelt werden, und diese Informationen sind wichtig, um die Phasenwinkel des Proteins zu bestimmen. Eine perfekte Isomorphie tritt jedoch aufgrund der veränderten Zellabmessungen kaum auf. Bei einem Protein mit schwerem Atom beträgt die tolerierbare Änderung der Zellabmessungen dmin/4, denn dmin ist die Auflösungsgrenze. Andere Faktoren, wie die Rotation, tragen ebenfalls zur Nicht-Isomorphie bei.

VerfahrenBearbeiten

1. Bearbeiten Sie einige Derivate des Proteins in kristalliner Struktur. Messen Sie dann die Zelldimension, um die Isomorphie zu überprüfen.
2. Sammeln Sie die Röntgenintensitätsdaten des ursprünglichen Proteins und seines Derivats.
3. Wenden Sie die Patterson-Funktion an, um die Koordinaten des schweren Atoms zu bestimmen.
4. Verfeinern Sie die Parameter des schweren Atoms und berechnen Sie den Phasenwinkel des Proteins.
5. Berechnen Sie die Elektronendichte des Proteins.

Die Derivate werden mit zwei verschiedenen Methoden hergestellt. Die bevorzugte Methode besteht darin, den Proteinkristall in einer Lösung zu tränken, die genauso zusammengesetzt ist wie die Mutterlauge, jedoch mit einer leicht erhöhten Konzentration an Fällungsmitteln. Eine andere Methode ist die Ko-Kristallisation, die jedoch nicht häufig angewandt wird, da der Kristall nicht oder nicht isomorph wächst. Das Einweichverfahren hängt davon ab, wie groß die Poren des Kristalls sind. Die Poren sollten weit genug sein, damit das Reagenz in den Kristall diffundieren und die reaktiven Stellen auf der Oberfläche aller Proteinmoleküle im Kristall erreichen kann.

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction MethodEdit

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction (abgekürzt MAD) ist eine Methode in der Röntgenkristallographie, die es ermöglicht, die Strukturen biologischer Makromoleküle, wie Proteine und DNA, zu bestimmen, um das Phasenproblem zu lösen. Voraussetzung für die Struktur sind Atome, die eine starke Streuung der Röntgenstrahlen verursachen, vor allem Schwefel oder Metallionen von Metalloproteinen. Da Selen den natürlichen Schwefel ersetzen kann, wird es am häufigsten verwendet. Die Verwendung dieser Technik erleichtert dem Kristallographen die Anwendung der MIR-Methode (Multiple Isomorphous Replacement), da die Präparation schwerer Verbindungen überflüssig ist.

Diese Methode wird zur Lösung von Phasenproblemen verwendet, wenn außer den Amplituden keine Daten über die gestreute Beugung verfügbar sind. Außerdem wird sie verwendet, wenn ein Schwermetallatom bereits im Protein gebunden ist oder wenn die Proteinkristalle nicht isomorph sind, was für die MIR-Methode ungeeignet ist. Die Methode wurde hauptsächlich für Schwermetalllösungen verwendet, die normalerweise aus der ersten Übergangsserie und ihren Nachbarn stammen. Es ist wichtig, eine Quelle für ein starkes Magnetfeld zu haben, um dieses Experiment durchzuführen. Ein Teilchenbeschleuniger, ein so genanntes Synchrotron, ist für die Methode ebenfalls erforderlich.

Anomale Beugungsmethode mit einer WellenlängeBearbeiten

Im Vergleich zur anomalen Beugung mit mehreren Wellenlängen (MAD) wird bei der anomalen Beugung mit einer Wellenlänge (SAD) ein einziger Datensatz mit einer einzigen Wellenlänge verwendet. Der Hauptunterschied zwischen MAD und SAD besteht darin, dass der Kristall bei SAD weniger Zeit im Röntgenstrahl verbringt, was eine mögliche Schädigung des Moleküls durch die Strahlung reduziert. Da SAD nur eine Wellenlänge verwendet, ist es außerdem zeitsparender als MAD.

Die aus den Daten der anomalen Einzelwellenlängenbeugung abgeleiteten Elektronendichtekarten müssen modifiziert werden, um Phasenmehrdeutigkeiten aufzulösen. Eine gängige Modifikationstechnik ist das Solvent Flattening, und wenn SAD mit Solvent Flattening kombiniert wird, sind die daraus resultierenden Elektronendichtekarten von vergleichbarer Qualität wie diejenigen, die aus einer vollständigen MAD-Phasenbestimmung abgeleitet werden. Beim Solvent Flattening wird die Elektronendichte der vom Lösungsmittel besetzten Zwischengitterbereiche zwischen den Proteinmolekülen angepasst. Es wird davon ausgegangen, dass die Lösungsmittelregion im Vergleich zum Protein relativ ungeordnet und strukturlos ist. Durch die Glättung der Elektronendichte in den Lösungsmittelbereichen wird die Elektronendichte des Proteins auf ein interpretierbares Maß erhöht. Diese Methode wird ISAS genannt, iterative single-wavelength anomalous scattering.

Direkte MethodenBearbeiten

Die direkte Methode kann helfen, die Phasen anhand der erhaltenen Daten wiederherzustellen. Die direkte Methode schätzt die Anfangs- und Expansionsphasen mit Hilfe einer Triple-Relation. Die Dreifachbeziehung ist die Beziehung zwischen der Intensität und Phase einer Reflexion und zwei anderen Intensitäten und Phasen. Bei dieser Methode spielt die Größe der Proteinstruktur eine Rolle, da die Phasenwahrscheinlichkeitsverteilung umgekehrt proportional zur Quadratwurzel aus der Anzahl der Atome ist. Die direkte Methode ist die nützlichste Technik zur Lösung von Phasenproblemen.