Utilitatea acidului organic produs de Exiguobacterium sp. 12/1 în neutralizarea apelor reziduale alcaline
Abstract
Scopul acestui studiu a fost de a investiga rolul acizilor organici produși de Exiguobacterium sp. tulpina 12/1 (DSM 21148) în neutralizarea apelor reziduale alcaline provenite din industria băuturilor. Se știe că această bacterie este capabilă să se dezvolte în medii cu un pH de până la 12,0 și să neutralizeze apele reziduale industriale alcaline de la pH 12,0 la pH 7,5. Investigația inițială privind tipul de grupe funcționale prezente în mediu, efectuată cu ajutorul spectroscopiei FT-IR, a evidențiat prezența unor vârfuri corespunzătoare grupării carbonil și grupării hidroxil, sugerând eliberarea de acid carboxilic sau de produs(i) metabolic(i) asociat(i). Identificarea grupării carboxilice specifice, realizată cu ajutorul RP-HPLC, a evidențiat prezența unui singur vârf în supernatantul de cultură cu timpul de retenție cel mai asemănător cu cel al acidului formic. Concentrația de acid produs pe diferite surse de carbon a fost studiată în funcție de timp. Deși acidul a fost prezent în aceeași concentrație finală, rata de producere a acidului a fost cea mai mare în cazul mediului suplimentat cu zaharoză, urmat de fructoză și glucoză. Cunoașterea produselor metabolice ale bacteriei poate fi considerată ca un prim pas spre realizarea potențialului acesteia pentru bioremedierea pe scară largă a apelor reziduale alcaline din industria băuturilor.
1. Introducere
Microorganismele alcaline – microorganisme care au pH-ul optim pentru creștere la sau peste pH 9 – au avut un mare impact în aplicațiile industriale. Detergenții biologici conțin enzime, cum ar fi celulozele alcaline și/sau proteazele alcaline, care au fost produse din alcalifile . Alkalifilele au fost, de asemenea, utilizate pentru producția industrială de enzime pentru care ar putea avea o utilizare specifică, de exemplu, ciclodextrina prin glucanotransferaza alcalină de ciclomaltodextrină și α-amilaza alcalină activă de formare a maltohexazei, care își găsesc aplicații în industria alimentară, chimică și farmaceutică. S-a raportat că pasta de lemn tratată alcalin poate fi albită biologic de xilanazele produse de alcalifile. Fujiwara și colaboratorii au raportat utilizarea unei proteaze alcaline pentru a descompune învelișul gelatinos al filmelor cu raze X, din care s-a recuperat argintul. Alcalifilele și-au dovedit, de asemenea, potențialul în biodegradarea unei varietăți de compuși organici .
Astfel, bacteriile alcalifile au atras mult interes datorită enzimelor lor extracelulare și proprietăților biochimice, cum ar fi alcalifilia și stabilitatea alcalină. Bioenergetica lor a fost, de asemenea, investigată în detaliu , în timp ce se cunosc puține lucruri despre fiziologia lor, de exemplu, enzimele și metaboliții intracelulari. Caracteristicile procesului metabolic intermediar sunt importante, deoarece ajută la caracterizarea bacteriei, la compoziția enzimatică a acesteia, la stadiul metabolic al celulelor și la posibilitățile de inginerie metabolică. Capacitatea alcalifilelor de a face să fluctueze puternic pH-ul mediului care conține carbohidrați a fost exploatată în lucrări anterioare pentru neutralizarea apelor reziduale puternic alcaline provenite din industria băuturilor, utilizând Exiguobacterium sp. tulpina 12/1 . Genul Exiguobacterium aparține ordinului Bacillales, care include, de asemenea, membri ai genului Bacillus. Exiguobacterium sp. 12/1 este un alcalifil facultativ care crește în mod optim la pH 10 și este capabil să neutralizeze apele uzate alcaline pentru a le reduce de la pH 12,0 la pH 7,5. Se presupune că bacteria eliberează unul sau mai multe produse metabolice acide pentru a neutraliza mediul extern foarte alcalin. Cu toate acestea, este important să se caracterizeze tipul de metaboliți eliberați în mediul extracelular. Aici, studiem producția de acizi organici ca un posibil mecanism de neutralizare alcalină. Astfel de tipuri de studii vor fi necesare înainte ca aplicațiile pe scară largă ale bacteriei pentru neutralizarea apelor uzate alcaline din industria băuturilor să poată fi dezvoltate.
Sursa majoră de carbon în apele uzate din industria băuturilor răcoritoare este zaharoza (dizaharidă care conține glucoză și fructoză), care este, de asemenea, principalul contribuitor la cererea biochimică de oxigen (BOD) a acesteia . CBO medie a apelor uzate din industria băuturilor răcoritoare variază între 600 și 4500 mg/L, ceea ce este echivalent cu 673-5052 ppm de zaharoză. Un studiu din literatura de specialitate privind produsele metabolice ale unui număr mare de bacterii care cresc pe zaharuri simple sugerează că bacteriile ar putea utiliza aceste zaharuri simple pentru a genera acizi organici. Acest lucru este confirmat și de analiza produselor metabolice extracelulare ale altor specii de Bacillus alcalifilice. În aceste studii, s-a constatat că principalul acid organic produs pe sursa de carbon zaharoză a fost acidul acetic. Acidul formic este un metabolit comun al bacteriilor neutrofile în condiții anaerobe, în timp ce B. circulans var. alkalophilus produce până la 2 g/L din acesta chiar și în culturile aerobe. Alți acizi volatili, cum ar fi acizii propionic, butiric, izobutiric și izovaleric, sunt tipici pentru tulpinile Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus și Bacillus sp. 17-1. Acizii izobutirici și izovalerici au fost raportați în mediile mai multor bacili neutrofili . Dar acești acizi, precum și acizii propionic și butiric, sunt considerați a proveni din aminoacizi pe baza studiilor efectuate pe Clostridium sp. . Acizii lactic și piruvic sunt destul de frecvent produși de bacilii neutrofili , dar producția de acid succinic de către Bacillus este rară . Etanolul nu a fost detectat în bacilii alcalifilici, deși este un produs tipic al culturilor de glucoză ale multor bacili neutrofili . Astfel, condițiile de creștere alcalină pot afecta producția de metaboliți neutri. În acest studiu am folosit cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază inversă pentru a studia tipul și concentrația de acizi produși de Exiguobacterium sp. tulpina 12/1 în timpul neutralizării mediului cu pH ridicat care conține diferite tipuri de surse de carbon.
2. Materiale și metode
2.1. Materiale și metode
2.1. Tulpina și condițiile de cultură
Cultura Exiguobacterium sp. 12/1 a fost obținută de la DSMZ (DSM 21148) și a fost menținută sub formă de stocuri de glicerină. Mediul bazal alcalin (ABM) care conține (toate concentrațiile în g/L): peptonă, 1; extract de drojdie, 0,5; glucoză, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (ultimele trei componente adăugate în mediul autoclavizat din soluții sterilizate separat) a fost utilizat pentru cultivarea de rutină a tulpinii 12/1 la 37°C. Pentru analizele IR și RP-HPLC, bacteria a fost cultivată la 37°C, la 200 rpm în mediu salin minim (MSM) conținând (toate concentrațiile în mM): K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; sare disodică EDTA, 0,3; ZnSO4-7H2O, 0,01; MnSO4, 0,02; CuSO4-5H2O, 0,004; FeSO4-7H2O, 0,1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 și 1% (p/v) din unul dintre următorii carbohidrați: glucoză, fructoză sau zaharoză (toate componentele adăugate din soluțiile stoc concentrate autoclavate separat). pH-ul final al mediului a fost ajustat la 10,5 folosind NaOH 1 N.
2,2. Analiza creșterii și a pH-ului culturii
1 ml de cultură în fază logaritmică pe ABM a fost utilizat pentru a inocula precultuiri (50 ml) (MSM conținând 1% zahăr). Cultura de test propriu-zisă (250 mL de MSM în flacon Erlenmeyer de 500 mL) a fost inoculată cu întreaga precultura în faza log (O.D. ~ 1,2). Fiecare set de cultură a constat din trei flacoane. Absorbția probelor la 650 nm a fost utilizată ca măsură a creșterii bacteriene. pH-ul a fost determinat în probele de cultură fără celule, la temperatura camerei, după centrifugarea la 4000 ×g timp de 20 min.
2.3. Analiza FT-IR
Cultura a fost recoltată după 60 h de creștere și a fost centrifugată la 4000 ×g timp de 20 min. Pentru analiza IR, supernatantul culturii a fost liofilizat și zdrobit sub formă de pulbere. Supernatantul pulverizat a fost apoi amestecat cu bromură de potasiu, iar amestecul a fost presat sub formă de tabletă. În cele din urmă, comprimatul a fost analizat cu ajutorul spectrometrului FT/IR-4200 (JASCO, Tokyo, Japonia).
2.4. Analiza RP-HPLC
Cultura a fost recoltată la diferite momente de timp și a fost centrifugată la 4000 ×g timp de 20 min. Pentru analiza HPLC, supernatantul culturii a fost filtrat printr-un filtru de 0,22 μm, iar 10 μL de probă filtrată a fost injectată în coloana HPLC.
Acidul formic de calitate standard analitică, acidul acetic, acidul succinic, acidul propionic, acidul lactic și acidul izobutiric au fost obținute de la Sigma. S-au preparat soluții standard stoc (100 mg/mL sau 100 μL/mL) și au fost depozitate la 4°C pentru utilizare ulterioară. Soluțiile standard de lucru (10 mg/mL sau 10 μL/mL) au fost preparate zilnic. Apa Milli-Q (Millipore) a fost utilizată pentru a pregăti soluțiile tampon și soluțiile stoc ale fiecărui compus și ale probelor. Soluțiile stoc, probele și tamponul au fost filtrate prin filtre cu membrană de celuloză Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, SUA). Solvenții au fost degazați în vid înainte de utilizare.
Analiza acizilor organici a fost efectuată în conformitate cu metoda lui Tormo și Izco . Analiza a fost efectuată pe un sistem Breeze (Waters, Mildford, MA, SUA) format dintr-o pompă HPLC binară 1525, un autosampler 717 plus și un detector UV cu două canale 2487 setat la 210 nm, operat cu ajutorul unui software Breeze. Separarea a fost realizată pe o coloană Atlantis dC18 (Waters) de 250 × 4,6 × 5 μm. Zilnic s-au preparat 20 mM de NaH2PO4 ajustat la pH 2,20 cu acid fosforic și s-a filtrat prin membrane hidrofile de 0,2 μm (Millipore). Programul de solvenți a utilizat două rezervoare conținând 1% de acetonitril în 20 mM de tampon fosfat ajustat la pH 2,20 cu acid fosforic (solvent A) și acetonitril (solvent B); debitul a fost stabilit la 1,5 ml/min la temperatura camerei. Programul de gradient a început cu 100% de solvent A și, după 7 minute, solventul B a fost crescut liniar pentru a ajunge la 7% în 5 minute. De la 12 la 19 min, rata a fost menținută la 93% din solventul A și 7% din solventul B. După aceea, rata a fost schimbată la condițiile inițiale pentru a echilibra coloana timp de 15 min înainte de a injecta din nou 10 μL din proba următoare.
3. Rezultate
3.1. Analiza neutralizării pe mediu definit
Pentru analiza acidului organic produs de bacterie a fost ales mediul minim de sare, datorită naturii sale definite și a sursei de carbon similare cu apele reziduale din industria băuturilor. Bacteria a fost lăsată să crească în mediu minim de sare suplimentat cu diferite surse de carbon glucoză, fructoză și zaharoză. Figura 1 prezintă profilul de creștere și caracteristicile pH-ului mediului în timp. Fructoza și zaharoza au dus la o neutralizare mult mai rapidă a mediului în comparație cu glucoza. De asemenea, pH-ul final obținut cu glucoză a fost ușor mai mare decât cel obținut în cazul mediului suplimentat cu sucroză și fructoză. Acest lucru se reflectă și în profilul de creștere al bacteriei cultivate pe cele trei surse de carbon. Bacteria a crescut mai rapid în zaharoză, urmată de fructoză și glucoză.
(a)
(b)
(a)
(b)
Variația pH-ului (a) și a O.D. (b) în funcție de timp pe MSM. Valorile reprezintă media a trei măsurători repetate, iar barele de eroare reprezintă abaterea standard.
3.2. Identificarea grupului funcțional prezent în supernatantul de cultură
Pentru a identifica grupul funcțional larg al metabolitului produs de bacterie în vederea neutralizării apelor uzate alcaline, supernatantul de cultură liofilizat a fost supus spectroscopiei FT-IR. Două vârfuri corespunzătoare grupului carbonil (la 1644,98 cm-1) și grupului hidroxil (la 3436,74 cm-1) au fost prezente în spectru (tabelul 1). Conform studiului de literatură, cel mai probabil, bacteria produce acizi organici ca produs metabolic care neutralizează apele reziduale alcaline.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.3. Identificarea produsului metabolic specific al bacteriei
În vederea identificării acidului organic produs de bacterie, s-a efectuat HPLC în fază inversă folosind standarde de acizi organici cunoscuți, selectați în urma unui studiu de literatură. Standardele au fost analizate atât individual [figura 2(a)], cât și în amestec [figura 2(b)] pentru a se stabili orice diferențe în timpul de retenție care apar din cauza interferenței altor acizi organici din mediu. S-a constatat că timpul de retenție al acizilor organici etalon în cele două cazuri a fost similar, diferența de timp de retenție nefiind mai mare de 0,09 unități, cu excepția acidului propionic (tabelul 2). Supernatantul de cultură a fost analizat prin aceeași metodă și s-a constatat că acesta cuprinde un singur vârf cu un timp de retenție similar cu cel al acidului formic. Acest lucru a fost confirmat în continuare prin dozarea supernatantului cu acid formic standard al cărui vârf s-a suprapus cu cel al produsului din supernatant [figura 2(d)].
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
RP-Cromatogramele HPLC ale acizilor organici standard individuali (a), acizi organici standard în amestec (b), supernatant de cultură (c) și supernatant de cultură îmbogățit cu acid formic.
3.4. Analiza cantitativă a produsului metabolic al bacteriei
Pentru analiza cantitativă a supernatantului de cultură, s-au analizat diferite concentrații standard de acid formic și s-a calculat zona de vârf corespunzătoare fiecărei concentrații. Aria vârfului a fost trasată în funcție de concentrație pentru a obține o curbă standard (figura 3). Această curbă standard a fost utilizată pentru a calcula cantitatea de acid produsă în timp pe un mediu salin minim suplimentat cu diferite surse de carbon. Supernatantul de cultură al bacteriei a fost analizat în funcție de timp și a fost supus din nou analizei HPLC în fază inversă. S-a constatat că vârful produsului majoritar din supernatantul de cultură bacterian crește cu timpul. Timpul de retenție al acidului este similar cu cel al acidului formic. Studiul acidului formic produs cu diferite surse de carbon în funcție de timp este prezentat în figura 4. Cea mai mare cantitate de acid a fost produsă în cazul MSM suplimentată cu zaharoză, urmată de fructoză și glucoză.
Curba standard pentru determinarea concentrației de acid formic în supernatantul de cultură.
Variația în timp a cantității de acid organic produs pe MSM suplimentată cu diferite surse de carbon. Valorile reprezintă media a trei măsurători repetate, iar barele de eroare reprezintă abaterea standard.
4. Discuții
Sursa majoră de carbon din efluentul de ape reziduale din industria băuturilor este zaharoza . Prin urmare, pentru analiza produsului metabolic produs în timpul neutralizării, a fost selectat un mediu salin minim bine definit care conține zaharoză și cele două zaharuri monosacaride constitutive – glucoza și fructoza. Caracteristicile de creștere a tulpinii 12/1 pe medii saline minimale suplimentate cu cele trei surse de carbon arată o neutralizare eficientă concomitent cu creșterea [figurile 1(a) și 1(b)]. Scăderea pH-ului mediului de creștere se datorează în mod necesar fie formării de acizi, fie eliminării bazelor .
Producția de acizi este bine documentată în cazul bacteriilor cultivate pe zaharuri simple. Au fost studiați produsele metabolice ale unor membri alcalifilici din genul Bacillus . În aceste studii s-a constatat că principalul acid organic produs pe sursa de carbon zaharoză este acidul acetic. Secvențele genomice ale speciilor de bacili alkalifilici – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans și Bacillus clausii – susțin, de asemenea, această observație, deoarece toate aceste specii au o cale funcțională de conversie a piruvatului în acetat. Acidul formic este un metabolit comun al bacteriilor neutrofile în condiții anaerobe, în timp ce B. circulans var. alkalophilus produce până la 2 g/L din acesta chiar și în culturile aerobe. Alți acizi volatili, cum ar fi acizii propionic, butiric, izobutiric și izovaleric, sunt tipici pentru tulpinile Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus și Bacillus sp. 17-1. Acizii izobutirici și izovalerici au fost raportate în mediile mai multor bacili neutrofili . Dar acești acizi, precum și acizii propionic și butiric, sunt considerați a proveni din aminoacizi pe baza studiilor efectuate pe Clostridium sp. . Acizii lactic și piruvic sunt destul de frecvent produși de bacilii neutrofili , dar producția de acid succinic de către Bacillus este rară . Etanolul nu a fost detectat în bacilii alcalifilici, deși este un produs tipic al culturilor de glucoză ale multor bacili neutrofili . Astfel, condițiile de creștere alcalină pot afecta producția de metaboliți neutri .
Studiile inițiale asupra produselor metabolice în cazul bacillus sp. au fost efectuate folosind procedura titrimetrică . Capacitatea de tamponare crescută a supernatantului culturii bacteriene în jurul pH 5, care este intervalul tipic de protonare a acizilor carboxilici, a fost folosită pentru a emite ipoteza că mediul conține acizi carboxilici. În acest studiu, am utilizat spectroscopia FT-IR pentru a stabili grupul funcțional al compusului (compușilor) prezent(i) în supernatantul de cultură. Spectrograful FT-IR a evidențiat vârfurile caracteristice grupului carbonil (la 1644,98 nm) și grupului hidroxil (la 3436,74 nm) (tabelul 1), ceea ce sugerează prezența unei specii chimice alcătuite din grupul hidroxil și carbonil și este foarte probabil să fie un acid carboxilic.
Metoda HPLC cu fază inversă a fost utilizată pentru a analiza acizii organici prezenți în supernatantul de cultură . Condițiile HPLC au fost alese pentru cea mai bună rezoluție raportată, și anume pH 2,2 și 1% acetonitril. Metoda HPLC cu fază inversă este avantajoasă datorită utilizării unor coloane mai puțin costisitoare, manipulării mai ușoare a parametrilor analitici pentru a optimiza separarea și analizelor la temperatura camerei . Metoda a fost folosită mai întâi pentru a calcula timpul de retenție al standardelor acide alese în funcție de studiul literaturii. Ordinea de eluție a acizilor în aceste condiții a fost aceeași cu cea raportată în Tormo și Izco , dar a existat o variație între timpii de retenție observați în acest studiu și cel raportat în Tormo și Izco . Această variație poate fi atribuită diferenței în condițiile HPLC, cum ar fi temperatura de 25-30°C în acest studiu față de 24°C ± 1°C raportată în Tormo și Iczo .
RP-HPLC a supernatantului de cultură arată prezența unui singur vârf cu absorbție la 211 nm, care este lungimea de undă de absorbție caracteristică acizilor organici. Astfel, supernatantul conține o singură specie chimică care este cel mai probabil un acid organic. Comparația dintre timpul de retenție al acestui vârf și timpul de retenție al acizilor organici standard arată că timpul de retenție este cel mai asemănător cu cel al acidului formic. Această observație a fost confirmată în continuare prin adăugarea de acid formic în supernatantul de cultură, ceea ce a dus la creșterea zonei de vârf a produsului [figurile 2(c) și 2(d)]. Prezența acidului formic în supernatantul de cultură este în concordanță cu produsele metabolice ale unor membri alcalifilici din genul Bacillus, precum și ale unor bacterii alcalifilice anaerobe zaharolitice, cum ar fi Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum și Amphibacillus tropicus .
Diminuarea maximă a unităților de pH pe unitate de timp raportată până în prezent la bacteriile alcalofile este de 0,13 unități pe oră în cazul Bacillus circulans var. alkalophilus, ceea ce este destul de scăzut în comparație cu scăderea de peste două unități în timpul primei ore de inoculare raportată în acest studiu. Scăderea mare a pH-ului a indicat o formare de produse de catabolism acid. Cu toate acestea, doar rata de scădere a pH-ului nu indică o creștere a concentrației de acizi. Prin urmare, analiza cantitativă a produsului metabolic al bacteriei a fost efectuată cu ajutorul RP-HPLC. HPLC a fost preferată față de GC, deoarece o comparație a metodelor GC și HPLC pentru determinarea acizilor organici în supernatantele de cultură ale bacteriilor alcalofile sugerează că, în timp ce rezoluția acizilor prin GLC a fost excelentă, reproductibilitatea cantitativă prin HPLC a fost mai bună decât cea prin GLC . Așa cum era de așteptat, s-a constatat că concentrația de acid produs crește odată cu creșterea timpului de incubare (figura 4). De fapt, cantitatea de acid a continuat să crească mult după ce a fost atins pH-ul minim. Acest lucru este în concordanță cu studiile anterioare privind producția de acid în cazul Bacillus sp. facultativ și obligat alcalifilic, unde producția de acid a continuat să crească chiar și după 30 de ore de la atingerea pH-ului minim. Analiza comparativă a produsului metabolic produs în medii suplimentate cu diferite surse de carbon arată că, deși acidul a fost prezent în aceeași concentrație finală, rata de producție de acid a fost cea mai mare în cazul mediului suplimentat cu zaharoză, urmat de fructoză și glucoză (figura 4). Acest lucru este în concordanță cu caracteristicile de creștere a organismului în mediile suplimentate cu aceste zaharuri.
5. Concluzie
Exiguobacterium sp. tulpina 12/1 neutralizează pH-ul mediului extern prin producerea de acid organic cu lanț scurt – acid formic. Ținând cont de potențialul de aplicare a bioremedierii pe scară largă a apelor reziduale alcaline, această capacitate de neutralizare alcalină a bacteriei pentru apele reziduale din industria băuturilor poate fi considerată ca un prim pas spre exploatarea potențialului său de comercializare.
Recunoștințe
N. M. Kulshreshtha mulțumește University Grants Commission pentru bursa de cercetare. Autorii sunt extrem de recunoscători Consiliului Cercetării Științifice și Industriale, India, pentru că a oferit o platformă R&D și facilități pentru această cercetare.
>.