Proteinele trebuie să interacționeze cu alte proteine pentru a forma complexe funcționale. În multe cazuri, funcția proteinelor în interiorul celulelor nu poate fi înțeleasă fără informații despre structura proteinelor și fără cunoașterea complexului în care se află proteina.1, 2 Acest lucru este, de exemplu, de o importanță capitală pentru proteinele care modulează informațiile epigenetice de pe ADN. Aproape toate aceste proteine care modifică cromatina necesită o interacțiune intensă cu enzimele metabolice, care furnizează cofactorii necesari pentru acetilarea, deacetilarea sau metilarea și demetilarea histonelor.3-5 Acest lucru evidențiază necesitatea de a studia mediul complex al unei anumite proteine pentru a analiza funcția și starea de activitate a acesteia. Reticularea proteinelor, în combinație cu analiza prin spectrometrie de masă (XL-MS), este o metodă ideală pentru a obține informații despre structura proteinelor și compoziția complexelor proteice.6-9 Pentru XL-MS, sunt necesari reactivi chimici specializați, reticulatorii, care sunt capabili să conecteze în mod covalent reziduurile proteice care se află în imediata apropiere, de exemplu, interacționând într-un complex.10, 11 Caracterizarea peptidelor reticulate prin intermediul spectrometriei de masă reprezintă însă o provocare formidabilă din două motive. În primul rând, identificarea legăturilor încrucișate trebuie realizată prin analizarea ionilor de fragmente nu numai a uneia, ci și a două peptide conectate, ceea ce complică masiv spectrele MS2. În al doilea rând, speciile peptidice reticulate au doar o abundență foarte scăzută și fac parte dintr-un amestec peptidic care este dominat în mod covârșitor de peptide ne-reticulate. În multe cazuri, acest lucru duce la o pierdere dramatică de informații care împiedică identificarea precisă a reticulațiilor și, prin urmare, analiza interactomului. Au fost dezvoltați câțiva reactivi de reticulare, care au introdus grupe care pot fi clivate prin MS și posibilitatea îmbogățirii XL pentru a aborda aceste probleme.12-18

În prezenta lucrare, raportăm dezvoltarea unui nou reactiv de reticulare care poate fi îmbogățit și are proprietăți de clivare care permit o identificare precisă a reticulațiilor. CliXlink conceput (1) este prezentat în figura 1. Reactivul permeabil la celule (figura 1 A și figura S1 din informațiile de sprijin) prezintă două unități de ester succinimidilic care pot reacționa cu nucleofilele din proteine și sunt distanțate la aproximativ 9 Å; astfel, permite fixarea pe distanțe scurte pentru a obține informații structurale despre proteine și pentru a capta proteine aflate în imediata apropiere una de cealaltă. Capacitatea de scindare eficientă a MS este asigurată de grupul sulfoxid bine stabilit, care poate fi scindat în condiții de disociere indusă prin coliziune (CID) cu energie scăzută înainte de fragmentarea peptidelor. În plus, o unitate alchină permite ca o fracțiune de îmbogățire, de exemplu, biotina, să fie atașată la situsurile reticulate cu ajutorul reacției CuAAC. 19

Aplicarea reticulatorului poate urma fluxul de lucru descris în figura 1 B. Aceasta implică adăugarea reactivului 1 la un proteom complex, fixând informațiile privind distanța în stare nativă a peptidelor aflate în imediata apropiere și păstrându-le pe tot parcursul fluxului de lucru ulterior pentru analiza MS. Atașarea grupului de afinitate pentru îmbogățire se realizează după reticulare pentru a evita interferența grupurilor de îmbogățire voluminoase. Prin modificarea peptidelor reticulate la nivelul proteinelor, excesul de reactivi cu molecule mici poate fi eliminat cu ușurință prin precipitare cu acetonă. Aceasta este urmată de digestia enzimatică a proteinelor. Peptidele reticulate sunt astfel marcate, de exemplu, cu biotină, ceea ce permite îmbogățirea lor. Ulterior, acestea sunt analizate prin intermediul spectrometriei de masă. Deoarece masele peptidelor individuale dintr-o legătură încrucișată nu sunt imediat accesibile, atribuirea legăturilor încrucișate este dificilă, în special în cazul probelor complexe. Acest lucru necesită utilizarea unor reactivi care pot fi scindați în MS, care facilitează identificarea MS2 prin formarea unor ioni de fragment specifici.20, 21 În cel mai bun caz, reactivul ar trebui să permită, de asemenea, experimente MS3, ceea ce necesită ca reticulantul să fie scindat înaintea peptidelor. Acest lucru permite separarea peptidelor pentru identificarea individuală bazată pe MS3. Reactivul nostru 1 conține atomi de β-hidrogen pe ambele părți ale sulfoxidului, astfel încât fragmentarea are loc în două direcții, așa cum este ilustrat în figura 1 C. Acest lucru conduce la o separare curată a peptidelor (α, β) și generează două fragmente pentru fiecare peptidă: un fragment de alchenă și un fragment de acid sulfenic; acesta din urmă formează un tial la pierderea apei. Se obțin astfel două perechi de mase cu un Δm/z≈32 caracteristic. În mod important, am observat că a predominat calea de fragmentare a (Figura 1 C). Prin urmare, pentru α-peptidă, fragmentul de alchenă și, pentru β-peptidă, fragmentul thial, sunt principalii produse de clivaj. Datorită proprietăților de scindare asimetrică, cea mai mare parte a intensității semnalului este reținută pe un fragment per peptidă, ceea ce ar trebui să asigure o sensibilitate excelentă în experimentele MS3.

Sinteza reactivului 1 este simplă (schema 1). Punctul de plecare este dimerul disulfidic oxidat al homocisteinei 2, care este tratat cu acid 4-pentinoic pentru a obține disulfura 3. Scindarea reductivă a disulfurii și alchilarea tiolilor generați cu 3-bromopropionat de metil generează compusul sulfurat 4. Saponificarea ambilor esteri metilici în 5 și conversia lui 5 în ester bissuccinimidilic activat 6, urmată de oxidarea tioeterului în sulfoxid, dă reactivul 1 cu un randament total de 16 %. De o importanță deosebită este faptul că reactivul este foarte pur și că unitățile de ester reactive sunt la locul lor în ambele părți. Este necesar să se evite hidroliza parțială. Acest lucru a fost asigurat printr-o purificare finală prin precipitare. Reactivul 1 a fost dizolvat într-un amestec de acetat de etil și diclorometan și a fost precipitat prin adăugarea de hexani.

Am investigat în continuare proprietățile MS ale 1. În acest scop, am adăugat 1 la proteina model utilizată în mod obișnuit, albumina serică bovină (BSA). Am urmat fluxul de lucru descris în figura 1 B fără a efectua etapa de îmbogățire. Pe scurt, după adăugarea de 1 la soluția de proteină și reacția timp de 1 h la temperatura camerei și la pH fiziologic, am precipitat proteina cu acetonă, am resuspendat-o în tampon (a se vedea informațiile justificative) și am digerat ulterior proteina cu un amestec de tripsină și Lys-C.

Mestecul peptidic obținut a fost desalinizat cu coloane C18 Tip și analizat cu ajutorul HPLC-MS2 (figura 2). Figura 2 A prezintă, ca exemplu, două peptide BSA reticulate (α+β). După ce am determinat masa exactă a reticulării intacte (m/z 677,1; figura 2 B), am efectuat atât fragmentare CID, cât și HCD pe precursor pentru a evalua proprietățile de fragmentare (figura 2 C). O fragmentare CID mai selectivă (excitare prin rezonanță a ionului de reticulare; Figura 2 C, spectrul de sus) la o energie de coliziune normalizată scăzută de 25 % oferă, așa cum era de așteptat, doar un set mic de semnale intense. Două perechi de semnale proeminente, cu Δm/z de 32 (Δmrep), sunt obținute datorită fragmentării reticulatorului, care are ca rezultat un fragment tial (α-/β-tial) și un fragment alchenic (α-/β-alchenic) pentru fiecare peptidă. După cum s-a menționat anterior, se preferă calea de fragmentare a (figura 1 C), ceea ce conduce la o distribuție asimetrică a intensității. În consecință, formarea dominantă a peptidelor intacte și separate așteptate face ca reactivul să se preteze la experimente MS3 mai sofisticate.

Pentru studiul nostru, am utilizat fragmentarea HCD. Această metodă asigură scindarea simultană a reticulatorului și formarea simultană a fragmentelor peptidice necesare pentru identificare (figura 2 C, spectrul inferior). Pentru a ajuta la recunoașterea reticulării/peptidelor, este important ca fragmentarea HCD să furnizeze în continuare fragmentele de alchenă și tială. Prin urmare, datele HCD permit identificarea peptidelor prin MS2.

Utilizând această metodă, am analizat datele cu software-ul MeroX disponibil gratuit, filtrând strict toate identificările de reticulații (scor >50, rata de descoperire falsă (FDR) 1 %) și solicitând prezența a cel puțin trei din patru ioni din cele două perechi de mase caracteristice.23, 24 Fără a exploata posibilitatea de îmbogățire pe bază de CuAAC, am reușit să identificăm 61 de reticulații unice de BSA într-o singură măsurătoare (Figura 2 D).25 Acest rezultat este reprezentativ pentru măsurătorile efectuate cu BSA purificată în laboratorul nostru. În plus, am reprezentat legăturile încrucișate găsite în structura cristalină a BSA și am observat că majoritatea distanțelor măsurate au fost rezonabile. Este important faptul că legăturile încrucișate prezintă o distanță medie CAα-Cα între aminoacizii reticulați de 22,1 Å și o distribuție a distanțelor care este în perfectă concordanță cu ceea ce se așteaptă în cazul unei reticulații cu un reactiv care spațiază esterii activi cu aproximativ 9 Å (figurile 2 E și S2)26 și ținând cont de lungimile lanțurilor laterale și de dinamica moleculară a proteinelor.27 Reticularea a avut loc în principal între două resturi Lys (49 %), dar am detectat, de asemenea, conexiuni Lys-Thr (30 %), Lys-Ser (13 %) și Lys-Tyr (8 %), în concordanță cu reactivitatea esterilor succinimidilici (Figura 2 F).28

Acest succes ne-a permis să validăm noul reticulant într-un mediu mai complex. Am dorit în special să arătăm valoarea suplimentară a posibilității de îmbogățire bazată pe CuAAC. Pentru acest experiment, am reticulat din nou proteina BSA (10 μg), am precipitat-o cu acetonă, am redisolvat proteina reticulată și, ulterior, am realizat reacția clic (Figura S3 A) prin adăugarea de 7 (Figura 3 A) și CuSO4/tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amină (THPTA) urmată de reducerea CuII la CuI prin adăugarea de ascorbat de sodiu. După 1 h la temperatura camerei, am efectuat o altă precipitare cu acetonă pentru a elimina excesul de azidă de biotină. Am adăugat apoi tripsină și Lys-C pentru digestie.

Aceste peptide au fost apoi combinate cu un digest de proteine obținut dintr-un extract de celule HEK (435 μg de proteine; figura 3 B). Acest lucru creează un fond masiv de peptide ne-reticulate. Dacă am analizat acum legăturile încrucișate în cadrul acestui fond mare (figura 3 C), am identificat doar un număr foarte mic de potriviri spectrale ale legăturilor încrucișate (media CSM=5,0), situsuri încrucișate unice (media XL unice=3,7), precum și monolink-uri (media=5,3), în care un ester succinimidilic s-a hidrolizat înainte de reacția cu proteina. Cu toate acestea, dacă am efectuat îmbogățirea cu margele magnetice acoperite cu streptavidină, numărul de identificări de reticulații s-a îmbunătățit în mod dramatic. În urma incubării amestecului de peptide cu particulele magnetice; a spălării extinse (6×) a perlelor cu tampon (a se vedea informațiile justificative) și a clivajului ușor, reductiv al disulfurii pentru a elibera legăturile încrucișate „capturate” și, astfel, pentru a elimina fracțiunea de biotină (figura S3 B), am detectat acum, în medie, 95,0 CSM-uri și 37,0 XL-uri unice împreună cu 184,3 monolink-uri. Numărul de XL-uri unice identificate a fost mai mic decât cel pentru BSA purificat (figura 2 D), ceea ce ar putea fi explicat prin ineficiența reacției CuAAC sau prin interferența fondului complexului nereticulat. Cu toate acestea, acest rezultat arată că noul nostru reticulant, 1, este capabil să îmbogățească peptidele reticulate într-un mare exces de peptide nemodificate; facilitând astfel analiza probelor complexe cu legături încrucișate puțin abundente. Inițial, am fost sceptici cu privire la structura asimetrică a 1. Cu toate acestea, datele arată că, în ciuda acestui fapt, se identifică un număr mare de legături încrucișate.

În concluzie, noul nostru reticulant 1 combină următoarele avantaje: în primul rând, dimensiunea reactivului este ideală pentru a obține informații valoroase despre distanțe pentru proteomica structurală. În plus, molecula este permeabilă la celule, iar unitatea alchină nu provoacă interferențe majore cu reacția de reticulare. În plus, fragmentarea robustă și eficientă a sulfoxidului simplifică identificarea reticulației. Posibilitatea funcționalizării peptidelor reticulate cu 1 prin chimia click permite utilizarea diverselor modificări și strategii de îmbogățire care permit analiza reticulațiilor puțin abundente. În concluzie, reactivul nostru 1 deschide acum calea pentru analiza interacțioanelor complexe prin utilizarea experimentelor MS2 și MS3.

Conflict de interese

Autorii nu declară niciun conflict de interese.