Terapie genică pentru afecțiuni neereditare

Au existat multe progrese în identificarea mecanismelor implicate în afectarea cronică a organelor, ceea ce a deschis drumuri pentru studiile de terapie genică. În timp ce o multitudine de studii preclinice și clinice din ultimele decenii s-au concentrat pe dezvoltarea terapiei genice pentru afecțiuni ereditare, în ciuda mai multor studii preclinice pe modele animale, au existat doar câteva studii clinice care au fost întreprinse pentru a investiga eficacitatea terapeutică a terapiei genice pentru bolile neereditare. Un studiu recent arată că expresia telomerazei cu ajutorul vectorilor AAV9 exercită efecte terapeutice într-un model de fibroză pulmonară la șoareci . Această terapie a vizat fibroza pulmonară idiopatică. Este cunoscut faptul că telomerii acționează ca structuri protectoare la capetele cromozomilor, iar prezența telomerilor scurți s-a dovedit a fi una dintre cauzele apariției bolilor. În această afecțiune, telomerii devin prea scurți, ceea ce duce la încetarea diviziunii celulare care, la rândul său, duce la apoptoza celulară. Telomeraza este o enzimă care poate restructura lungimea telomerilor, iar Povedano și colegii săi au dezvoltat un tratament folosind serotipul 9 AAV pentru a administra telomeraza pentru a corecta telomerii scurți. Deoarece AAV9 vizează în mod preferențial celulele alveolare regenerative de tip II (ATII), șoarecii tratați cu AAV9-Tert prezintă o funcție pulmonară îmbunătățită, cu reducerea inflamației și a fibrozei la 1-3 săptămâni după tratamentul cu vectorul. Este interesant de remarcat faptul că fibroza pulmonară fie s-a îmbunătățit, fie a dispărut la 8 săptămâni de terapie genică. Tratamentul cu AAV9-Tert duce la telomeri mai lungi și la o proliferare crescută a celulelor ATII, precum și la o deteriorare mai mică a ADN-ului, apoptoză și senescență.

Terapia genică cardiacă derivată din vectorul AAV apare ca o platformă complet nouă pentru tratarea afecțiunilor cardiace . Terapia genică AAV pentru insuficiența cardiacă a fost validată în studii preclinice folosind modele animale, iar marea majoritate a acestor abordări au fost întreprinse pentru a îmbunătăți manipularea calciului de către cardiomiocite. Proteina terapeutică utilizată în majoritatea acestor studii a fost calciul sarcoplasmatic ATPază (SERCA2a). Pe baza constatărilor preclinice pozitive, a fost efectuat primul studiu clinic (CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422) pentru a administra SERCA2a utilizând vectorul AAV serotip 1 pentru a trata pacienții cu insuficiență cardiacă avansată . Rezultatul acestui studiu de fază 1 a fost de succes, fără evenimente adverse, și a trecut la studiul de fază 2a, oferind rezultate promițătoare cu o rată semnificativ scăzută de evenimente adverse. Cu toate acestea, rezultatele studiului clinic de fază 2b (studiul CUPID2b, NCT01643330) utilizând același vector au fost dezamăgitoare, fără nicio schimbare semnificativă între grupul de tratament și grupul placebo . Acest lucru a dus la încetarea recrutării de pacienți pentru alte două studii suplimentare care utilizează AAV1.SERCA2a . Interesant este faptul că există două noi studii viitoare care vizează livrarea S100A1 cu un vector AAV9 și o formă constitutiv activă a inhibitorilor de proteină fosfatază 1, I1c, cu un capsid chimeric cu serotipurile AAV2 și AAV8 . În plus, AAV1, AAV6 și AAV9 au apărut ca fiind cele mai promițătoare serotipuri AAV pentru transferul de gene cardiace, ceea ce dă speranțe pentru abordări de terapie genică de succes pentru tratarea insuficienței cardiace în viitor.

Au fost raportate, de asemenea, abordări de terapie genică mediată de AAV pentru tratarea durerii neuropatice la rozătoare . Fischer și colegii săi au arătat că administrarea de rAAV care exprimă gena Ca2+ channel-binding domain 3 (CBD3) a redus semnificativ comportamentul dureros, cum ar fi hiperalgezia după atingerea cu un ac sau sensibilitatea la stimularea cu acetonă în modele animale de durere inflamatorie și neuropatică . Un alt studiu care a utilizat vectorul AAV9 care codifică ARN în formă de ac de păr scurt (shRNA) împotriva receptorului vanilloid 1 (TRPV1), care este o genă țintă importantă pentru durerea acută, a demonstrat că terapia a atenuat alodinia termică indusă de leziuni nervoase (răspuns crescut al neuronilor) la 10-28 de zile după tratament într-un model de șoarece cu leziuni nervoase (SNI) . Aceste rezultate oferă dovezi pozitive pentru a încuraja cercetătorii în domeniul terapiei genice să dezvolte tratamente pe bază de vectori AAV pentru pacienții cu durere neuropată cronică/diabetică.

Au fost înregistrate progrese considerabile în abordarea terapiei genice pentru tratarea fibrozei hepatice cronice. Deși inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei (ACE) sau blocantele receptorilor de angiotensină (ARB) sunt utilizate pe scară largă ca tratamente la pacienții cu hipertensiune arterială, acestea au fost testate la pacienții cu boli hepatice cronice; cu toate acestea, rezultatele nu au fost convingătoare, în principal din cauza faptului că produc efecte secundare sistemice adverse . Din cauza lipsei de tratamente medicale, transplantul de ficat a devenit în mod inevitabil singura opțiune pentru pacienții cu boală hepatică în stadiu terminal, rezultată din fibroza hepatică cronică și/sau ciroză. Mai mult decât atât, incidența crescândă a bolii hepatice cronice, lipsa organelor donatoare, complicațiile post-transplant și costul ridicat în transplantul hepatic înseamnă că există o nevoie majoră de a descoperi și formula noi terapii specifice, eficiente, sigure și necostisitoare pentru fibroza hepatică/cirroza hepatică.

O posibilă abordare pentru a ocoli această situație este dezvoltarea unor strategii antifibrotice țintite pe organe. Studiile din laboratorul nostru au sugerat că o posibilă țintă este „axa alternativă” a sistemului renină-angiotensină (SRA), care cuprinde enzima sa cheie, enzima de conversie a angiotensinei 2 (ACE2), care descompune puternica octapeptidă profibrotică, angiotensina II (Ang II), într-o heptapeptidă antifibrotică, angiotensina-(1-7) (Ang-(1-7)) . Dovezile din studiile experimentale pe animale au arătat că ACE2 umană recombinantă (rhACE2) este benefică pentru prevenirea hipertensiunii în bolile cardiovasculare și pentru îmbunătățirea funcției renale în nefropatia diabetică . În mod interesant, rhACE2 a fost bine tolerată de un grup de voluntari umani sănătoși într-un studiu clinic de fază 1, fără a exercita efecte secundare cardiovasculare nedorite . Există un studiu care a raportat efectele terapeutice ale ACE2 recombinantă în fibroza hepatică experimentală, în care leziunile hepatice au fost induse chirurgical prin colestază sau prin injectarea hepatotoxică de tetraclorură de carbon . Aceștia au demonstrat că ACE2 recombinantă a redus semnificativ fibroza hepatică în ambele modele animale de boală hepatică . Cu toate acestea, un dezavantaj major al acestei abordări sistemice este că tratamentul produce în mod inevitabil efecte în afara țintei, care, în multe cazuri, sunt nedorite. Astfel, există mai multe dezavantaje în cazul administrării sistemice a ACE2 recombinante. Aceasta include injecții zilnice de ACE2, o procedură invazivă în mediul clinic și o abordare costisitoare, cu efecte nedorite asupra reglării tensiunii arteriale . Pentru a ocoli această problemă, o abordare ideală ar fi creșterea nivelurilor de ACE2 specifice țesutului în organul țintă. Astfel, se așteaptă ca activitatea crescută a ACE2 specifică pentru fiecare organ în parte, utilizând un vector AAV recombinant specific pentru ficat, să producă efecte terapeutice limitate la organul vizat, minimizând în același timp efectele nedorite în afara țintei.

În plus față de utilizarea serotipului capsidic specific pentru ficat, specificitatea poate fi îmbunătățită și mai mult prin ingineria vectorului cu gena ACE2 sub controlul transcripțional al unui promotor puternic specific pentru ficat, apolipoproteina E/α1-antitripsina umană. Studiile publicate de laboratorul nostru au utilizat un vector AAV pseudotipic specific pentru ficat (rAAV2/8) pentru evaluarea preclinică și au constatat că supraexpresia hepatică a genei ACE2 murine administrată la șoareci a durat până la 6 luni după o singură injecție intraperitoneală . Apoi am tratat șoarecii cu o serie de modele de boli hepatice, care au inclus fibroza biliară indusă de ligatura canalelor biliare (BDL), leziuni toxice induse de injecții cu tetraclorură de carbon (CCl4) și fibroza hepatică asociată cu ficatul gras indusă de alimentația cu o dietă deficitară în metionină și colină (MCD), folosind o singură injecție intraperitoneală de rAAV2/8-ACE2 . Tratamentul a produs o creștere majoră a expresiei ACE2 și a activității proteice, care a fost limitată la ficat, fără a afecta alte organe importante. Spre deosebire de tulburările moștenite, de exemplu, hemofilia B, unde un nivel relativ scăzut de expresie a transgenei în ficat poate fi suficient pentru creșteri mici ulterioare ale nivelurilor de FIX în sânge , magnitudinea expresiei transgenei necesară pentru intervenția terapeutică în bolile neereditare poate fi substanțial mai mare. Acest lucru, la rândul său, poate reprezenta o provocare pentru cercetătorii în domeniul terapiei genice. Cu toate acestea, în mod interesant, în cadrul abordării noastre terapeutice orientate spre ficat cu rAAV2/8-ACE2, am constatat că o expresie hepatică crescută a ACE2 a redus nivelul hepatic al Ang II profibrotic cu mai mult de 50% în comparație cu cei tratați cu un vector de control care purta albumină serică umană (rAAV2/8-HSA) . O reducere a Ang II, care a fost însoțită de creșteri ale nivelurilor hepatice ale peptidei antifibrotice Ang-(1-7), a dus la o reducere marcantă a expresiei citokinelor inflamatorii, ceea ce a dus la o reducere profundă a fibrozei hepatice în toate cele trei modele (figura 2) . Aceste studii cu modele animale pe termen scurt au fost validate în continuare pentru a furniza dovezi că în modelele animale pe termen lung de fibroză biliară și de boală a ficatului gras, care produc leziuni hepatice mai comparabile cu cele observate la pacienții cu astfel de boli, o singură injecție intraperitoneală de rAAV2/8-ACE2 a determinat o reducere profundă a fibrozei hepatice (figura 3). În contrast pronunțat cu alte studii care utilizează vectori AAV , am constatat că rAAV2/8-ACE2 a redus nivelurile serice de alanină transaminază (ALT) la animalele bolnave în comparație cu cele care au primit vectorul de control (rAAV2/8-HSA), sugerând că vectorul în sine este sigur în ficat. Mai mult, vectorul rAAV2/8-HSA (până la 10 zile) sau rAAV2/8-ACE2 (până la 24 de săptămâni) injectat la șoareci sănătoși nu a produs nicio modificare a nivelului de ALT în plasmă, confirmând că este puțin probabil ca vectorul în sine să provoace leziuni hepatice . Reprezentarea schematică a mecanismului molecular asociat cu terapia genică ACE2 utilizând vectorul rAAV2/8 în fibroza hepatică este prezentată în figura 4.

Livrarea de gene cu țintă hepatică utilizând vectorul rAAV2/8 s-a dovedit a fi promițătoare din punct de vedere terapeutic în ficatul adult, dar efectele lor nu au fost investigate pe larg în ficatul imatur. Deși rAAV2/8 transduce ficatul de șoarece neonatal cu o eficiență ridicată, vectorul nu este persistent în ficat și scade rapid odată cu creșterea ficatului . Prin urmare, utilizarea cu succes a terapiei mediate de rAAV2/8 pentru a trata bolile hepatice în copilăria timpurie poate necesita readministrare . În concordanță cu acest lucru, un alt studiu a demonstrat că tratamentul șoarecilor neonatali cu deficiență de ornitină transcarbamilază (OTC) cu terapia AAV2/8-OTC nu a reușit să protejeze șoarecii de hiperamonemie la vârsta adultă . Astfel, producerea unei transducții stabile în ficatul în curs de dezvoltare rămâne una dintre cele mai mari provocări pentru terapia genică rAAV2/8 specifică pentru ficat, iar readministrarea vectorilor poate fi necesară pentru a menține eficacitatea terapeutică la vârsta adultă după un tratament neonatal timpuriu.

Deși vectorii AAV utilizați pentru studiile preclinice pot fi eficienți în ficatul uman, este important să se selecteze un vector AAV specific pentru hepatocitele umane cu o eficiență sporită a transducției . Recent, două grupuri au propus utilizarea șoarecilor umanizați, cum ar fi modelul de șoarece FRG (Fah-/-/-/Rag2-/-//Il2rg-/-) imunodeprimat, pentru a identifica cel mai bun serotip rAAV pentru terapia genică direcționată către ficat . Studiile efectuate pe modelul de șoarece umanizat repopulat cu peste 25 % hepatocite umane au permis cercetătorilor să identifice vectori AAV specifici pentru ficatul uman, cum ar fi LK-03, derivat din biblioteca de AAV cu capsidele de ADN amestecate. Această bibliotecă a fost generată folosind 10 gene de capsidă AAV. LK-03, care este compus din cinci capside AAV parentale diferite, a fost capabil să transducă hepatocite primare umane cu o eficiență mai mare in vitro și într-un model de xenogrefă de carcinom hepatocelular in vivo, în comparație cu serotipul AAV 8 . Wang și colegii săi au raportat, de asemenea, un nivel mai ridicat de transducție hepatică la șoarecii FRG folosind capsida AAVrh10, un AAV din clada E derivat din macacul rhesus, și AAV3B și au arătat că vectorii AAV-LK-03 pot fi superiori fie AAV3B, fie AAV8 . Se preconizează că cercetătorii vor utiliza din ce în ce mai mult modele animale umanizate pentru alte boli decât cele hepatice, ceea ce le va permite să identifice noi variante de vectori AAV, eficiența transducției și reacțiile imune specifice țesutului uman care face obiectul cercetării. În plus, s-a raportat că vectorul AAV3B-eGFP, care a fost capabil să provoace o expresie GFP robustă specifică ficatului în ficatul primatelor neumane, este semnificativ mai bun decât AAV8, fără hepatotoxicitate aparentă .

.