γδ-selecție

celulele γδT apar din timocitele DN, deoarece rearanjarea lanțurilor TCRγ și δ are loc în stadiile DN. Celulele precursoare γδ, care au TCRγ și δ rearanjate înainte de recombinarea TCRβ, exprimă complexul γδTCR/CD3 pe membrana plasmatică, unde γδTCR se auto-oligomerizează, ca și pre-TCR, și inițiază căile de semnalizare intracelulară . Acest semnal γδTCR induce procesul denumit „γδ-selecție”, care confirmă generarea lanțurilor TCRγδ funcționale, ceea ce face ca celula să recunoască faptul că „sunt o celulă γδT” .

Semnalul de γδ-selecție declanșează diferențierea din celule precursoare γδ CD5- CD24high γδ în celule CD5+ CD24low γδT-compromise . Tranziția de la celule γδT CD5- la celule γδT CD5+ este afectată în mod semnificativ la șoarecii cu deficit de Syk, în timp ce șoarecii cu deficit de Zap70 prezintă o diferențiere normală a celulelor γδT CD5+. Șoarecii dublu-deficienți Zap70/Syk prezintă o oprire completă a diferențierii celulelor γδT în stadiul de precursor CD5- . Astfel, selecția γδ este dependentă în principal de semnalul mediat de Syk, iar Zap70 joacă doar un rol minor și redundant în acest proces. Acest mecanism este destul de analog cu cel al β-selecției. O țintă critică a Syk în semnalul de selecție γδ este semnalosomul Lat, deoarece șoarecii cu deficit de Lat prezintă o inhibiție completă a selecției γδ și o lipsă totală de celule γδT mature.

Celulele precursoare γδ provenite de la șoareci cu deficit de Syk/Zap70 sau de la șoareci cu deficit de Lat nu se disting de celulele din linia αβT prin expresia proteinelor lor de suprafață celulară, cu excepția γδTCR, și își păstrează potențialul de a se diferenția în celule αβT. Ce determină destinul de diferențiere în linia αβT sau γδT din precursor? Această întrebare a fost abordată prin studii care utilizează șoareci transgenici γδTCR. Atunci când semnalul γδTCR este slăbit de o deficiență fie a proteinelor de semnalizare, fie a liganzilor endogeni pentru γδTCR transgenic, celulele precursoare au dat naștere la celule DP din linia αβT în detrimentul celulelor din linia γδT . Aceste rezultate sugerează că un semnal mai puternic (probabil în urma interacțiunii cu ligandul γδTCR) conduce la angajamentul față de celulele γδT, în timp ce un semnal mai slab (probabil prin pre-TCR independent de ligand) conduce la diferențierea αβT. Cu toate acestea, experimentele care utilizează o altă tulpină de șoareci transgenici care exprimă γδTCR cu aceeași specificitate de ligand au demonstrat că celulele γδT au fost capabile să se maturizeze în absența liganzilor . Chien și colaboratorii au utilizat o metodă de colorare tetramerică pentru a identifica populația de celule γδT specifice ligandului, pentru a examina semnificația liganzilor γδTCR endogeni la șoarecii netransgenici. Rezultatele au arătat în mod clar că numărul celulelor γδT specifice ligandului a fost comparabil între șoarecii ligand-suficienți și cei -deficienți, sugerând că majoritatea celulelor γδT nu au întâlnit liganzi în timpul diferențierii timice . Autorii au furnizat, de asemenea, dovezi că unele γδTCRs pot semnaliza independent de ligand . Aceste observații contrazic în mod evident modelul anterior conform căruia angajarea liniei γδT necesită interacțiunea cu ligandul γδTCR. Având în vedere că celulele γδT policlonale reactive la anumiți liganzi exogeni se diferențiază și ajung la maturitate funcțională în timus, este probabil ca observațiile din anumite linii de șoareci transgenici γδTCR să nu reflecte majoritatea celulelor γδT cu γδTCR policlonale.

Pentru a examina impactul semnalului de selecție γδ asupra diferențierii αβT/γδT, am utilizat șoareci cu deficit de Lat, în care diferențierea celulelor γδT este oprită în stadiul de precursor CD5-. Celulele precursoare γδTCR+ au fost purificate de la șoareci adulți Lat-deficienți, infectate cu retrovirusuri care exprimă Lat și cultivate pe monostraturi de celule stromale (Fig. 2a). Acest experiment permite evaluarea directă a fenotipului celular înainte și după selecția γδ în condiții fără liganzi. În comparație cu celulele de control netransduși, celulele γδT care exprimă Lat au prezentat o inducție marcată a expresiei de suprafață a CD5 (Fig. 2b), precum și expresia ARNm a genelor semnătură a celulelor γδT (Tcrd, Egr3, Runx3 și Bcl-2) și abrogarea completă a transcripției genelor asociate cu celulele DN precursoare și celulele αβT (Rag1, Rag2 și Ptcra) (Fig. 2c) (Fig. 2c). Aceste rezultate indică faptul că semnalul γδTCR atât conduce diferențierea spre linia γδT, cât și reprimă diferențierea în linia αβT într-o manieră independentă de ligand.

În ansamblu, deși mecanismele prin care pre-TCR și γδTCR dirijează procesele de diferențiere în liniile αβT și, respectiv, γδT sunt încă evazive (și dezbătute), este probabil ca selecția γδ, cel puțin în majoritatea celulelor γδT generate în mod natural, să nu depindă de ligandul γδTCR cognat din timus.

Intensitatea semnalului γδTCR determină diferențierea γδT17/γδT1

În timpul dezvoltării atât a liniilor αβT, cât și a γδT, expresia lui Syk și Zap70 este reglată invers: Syk este foarte bine exprimat în stadiile timpurii (DN1-3 și precursorul γδ) și se reduce ulterior, în timp ce Zap70 este exprimat în stadiile ulterioare (după β-selecția sau γδ-selecția) . Celulele γδT care au trecut prin γδ-selecția exprimă niveluri ridicate de Zap70, precum și complexele γδTCR/CD3 și pot răspunde la liganzi endogeni dacă aceștia sunt furnizați în timus. În prezent, este recunoscut faptul că, spre deosebire de celulele αβT, celulele γδT nu sunt supuse selecției pozitive determinate de liganzi sau eliminării clonale în timus. Mai multe studii au sugerat că interacțiunea ligandului γδTCR în timus controlează, în schimb, funcția efectoare a celulelor γδT.

Utilizând colorarea tetramerică a unei populații de celule γδT care este reactivă la moleculele MHC non-clasice de clasă I T10 și T22, grupul lui Chien a descoperit că celulele γδT naive de antigen care s-au dezvoltat în absența liganzilor au produs în mod preferențial IL-17, în timp ce celulele γδT experimentate cu antigen care s-au dezvoltat în prezența liganzilor au produs predominant IFNγ . Acest studiu a sugerat pentru prima dată ideea că un semnal γδTCR puternic indus de ligand și un semnal γδTCR slab induc celulele γδT1 și, respectiv, γδT17. Un studiu recent cu șoareci nou generați cu deficit de T10/T22 a raportat în esență aceleași rezultate, susținând acest „model de putere a semnalului” . Acest model a fost susținut și de alte studii. Maturizarea timică și diferențierea efectoare a celulelor γδT Vγ5Vδ1 γδT necesită Skint1 (și probabil alte proteine din familia Skint), o proteină costimulatoare putativă pentru TCR Vγ5Vδ1 Vγ5Vδ1 . În absența lui Skint1, celulele γδT Vγ5Vδ1 γδT sunt direcționate greșit către un fenotip celular γδΤ17 în detrimentul fenotipului celular γδΤ1 . Mai mult, dezvoltarea celulelor γδT1 necesită, de asemenea, costimulare prin CD27, o proteină din superfamilia receptorilor TNF exprimată în celulele γδT1, dar nu și în celulele γδT17 . Mai recent, grupul lui Pennington a identificat celule γδT bipotente timice (CD24lo CD44lo CD45RBlo) care pot da naștere atât la celule γδT17, cât și la celule γδT1. În cultura de organe de timus fetal, dezvoltarea celulelor γδT17 a fost inhibată de semnalele TCR puternice induse de stimularea cu anticorpi anti-TCRδ sau anti-CD3ε, dar aceste efecte au fost abrogate de inhibarea farmacologică a căii MEK/ERK . Aceste date oferă dovezi directe în sprijinul ideii că intensitatea semnalului γδTCR este un determinant critic al funcției efectoare a celulelor γδT.

La nivel transcripțional, semnalul puternic al γδTCR induce expresia regulatorilor transcripționali asociați cu γδT1, cum ar fi Egr2, Egr3 și Id3, ceea ce duce la o soartă celulară γδT1 . Id3 inhibă adoptarea destinului celular γδT17 prin inhibarea reglării transcripționale mediate de HEB (codificată de Tcf12) . HEB se poate lega direct în amonte de situsurile de start transcripțional ale Sox4 și Sox13 pentru a promova expresia acestora. Acești factori transcripționali asociați cu γδT17 sunt necesari pentru exprimarea factorului transcripțional esențial RORγt (codificat de Rorc) și a proteinei de semnalizare Blk . Având în vedere aceste fapte, modelul intensității semnalului TCR demonstrează în mod clar mecanismele prin care semnalul TCR controlează funcția efectoare a celulelor γδT.

Cu toate acestea, o serie de studii au demonstrat impactul ablației genetice a moleculelor de semnalizare TCR asupra funcției efectoare a celulelor γδT, contestând ideea că intensitatea semnalului γδTCR determină singură soarta de diferențiere γδT17/γδT1. Șoarecii mutanți Zap70 W163C prezintă o pierdere completă a dezvoltării celulelor Vγ6+ γδT17, dar au o dezvoltare normală a celulelor γδT1, în timp ce semnalele TCR sunt atenuate la acești șoareci . Un alt studiu realizat de Silva-Santos și colaboratorii a arătat că șoarecii haploinsuficienți pentru CD3δ și CD3γ (CD3DH), care au avut o expresie mai mică a complexelor γδTCR/CD3 pe suprafața celulară și o semnalizare γδTCR afectată, au prezentat o reducere marcată a dezvoltării timice a celulelor Vγ6+ γδT17, precum și a celulelor γδT1, dar nu și a celulelor Vγ4+ γδT17, ceea ce indică faptul că subseturile γδT17 necesită o intensitate distinctă a semnalului γδTCR pentru dezvoltarea lor . Deși dezvoltarea celulelor αβT și transducția semnalului αβTCR nu au fost afectate la șoarecii CD3DH, această tulpină de șoareci este singurul model animal până în prezent în care a fost demonstrată inhibarea specifică a semnalizării γδTCR. Rămâne neclar de ce celulele γδT sunt afectate în mod specific la șoarecii CD3DH, dar este probabil ca compoziția distinctă a complexelor TCR-CD3 αβT și γδT să explice fenotipul unic al șoarecilor CD3DH. În acest context, trebuie remarcat faptul că șoarecii cu mutația CD3ε C80G, care nu este capabilă să inducă modificări conformaționale în TCR, prezintă, de asemenea, o dezvoltare deficitară a celulelor γδT17, dar o dezvoltare normală a celulelor γδT1 .

Syk este necesară pentru diferențierea γδT17

Recent, am raportat un nou mecanism de reglementare prin care kinazele γδTCR-proximale Syk și Zap70 controlează diferențiat inducerea γδT17 . Șoarecii cu deficit de Syk prezintă o pierdere completă a celulelor γδT17 (atât a subseturilor Vγ4+ cât și Vγ6+) în timus. În special, expresia forțată a Zap70 în celulele T-progenitoare deficiente în Syk nu a reușit să restabilească generarea de celule γδT17, sugerând un rol non-redundant al Syk în diferențierea γδT17. Deoarece celulele γδT cu deficit de Syk, dar nu și de Zap70, prezintă o reducere semnificativă a fosforilării Akt indusă de stimularea γδTCR, se indică faptul că Syk mediază activarea indusă de γδTCR a căii PI3K-Akt. Șoarecii cu deficit de PI3K (p110γ-/-/ p110δ-/-/-) prezintă o inhibiție completă a dezvoltării celulelor γδT17, dar nu sunt afectați în ceea ce privește selecția γδ (upregulation CD5) sau dezvoltarea γδT1. S-a demonstrat că inhibarea PI3K reduce expresia factorilor de transcripție asociați cu γδT17 (Rorc, Sox13 și Sox4), sugerând rolul crucial al căii PI3K-Akt în inducerea programului de diferențiere γδT17. În concordanță cu acest lucru, un raport anterior a demonstrat că șoarecii PI3Kδ inactivi din punct de vedere al kinazei sau șoarecii cu deficit de PI3Kγ prezintă o reducere semnificativă a numărului de celule γδT17 periferice și o ameliorare a inflamației dependente de γδT17 . Calea PI3K-Akt este, de asemenea, necesară pentru diferențierea celulelor αβT (Th17) producătoare de IL-17 , sugerând că această cale de semnalizare este un mecanism comun de reglementare împărtășit de liniile αβT și γδT pentru inducerea subseturilor proinflamatorii producătoare de IL-17.

γδTCR activarea indusă de PI3K-Akt depinde de Syk, dar nu de Lat, ceea ce indică faptul că Syk conduce calea PI3K-Akt pentru a induce diferențierea γδT17 în plus față de calea de semnalizare principală dependentă de Lat care induce selecția γδ . Nu este clar dacă Syk activează calea PI3K/Akt în celulele γδT prin interacțiune directă sau într-o manieră indirectă. Un studiu anterior a raportat că șoarecii cu deficit de Rasgrp1 prezintă un fenotip efector al celulelor γδT similar cu cel al șoarecilor cu deficit de PI3K (adică o pierdere de celule γδT17 și o creștere a celulelor γδT1) . Deoarece Rasgrp1 poate funcționa ca un activator în amonte al căii PI3K/Akt în semnalizarea αβTCR , este probabil ca Rasgrp1 să transmită semnale de la γδTCR la PI3K pentru a induce diferențierea γδT17.

Pierderea preferențială a celulelor γδT17 a fost, de asemenea, raportată la șoarecii deficitari pentru Blk, o kinază din familia Src exprimată în celulele γδT, precum și în celulele B, deși funcția sa în transducția semnalului γδTCR este necunoscută .

Zap70 controlează anumite subseturi de celule γδT

Am demonstrat, de asemenea, rolul lui Zap70 în diferențierea timică a celulelor γδT . Șoarecii cu deficit de Zap70 prezintă o reducere marcată a celulelor Vγ6+, majoritatea fiind γδT17, dar nu sunt afectați în ceea ce privește dezvoltarea altor celule γδT, inclusiv a subseturilor Vγ1+, precum și Vγ4+. Într-adevăr, nivelul de expresie al proteinei Zap70 a fost cel mai ridicat în subsetul Vγ6+ dintre celulele γδT. Deoarece expresia CD5 a fost mai mică în celulele Vγ6+ cu deficit de Zap70 decât în celulele de control, Zap70 este probabil necesară pentru maturizarea timică a celulelor Vγ6+. În experimentele noastre, șoarecii cu deficit de Zap70 au avut o diferențiere timică normală a celulelor Vγ4+, inclusiv a subsetului γδT17, ceea ce contrazice raportul anterior în care o mutație hipomorfă Zap70 a cauzat o reducere a celulelor timice Vγ4+ γδT17 Vγ4+ . Această discrepanță se poate datora șoarecilor diferiți utilizați în cele două studii (grupul lui Hayday a utilizat șoareci mutanți hipomorfi Zap70 pe un fond BALB/c, în timp ce noi am utilizat șoareci cu deficit complet de Zap70 pe un fond C57BL/6). În plus, șoarecii cu deficit de Zap70 au prezentat o reducere semnificativă a celulelor periferice Vγ4+, care includeau atât subseturile γδT17, cât și γδT1, dar aveau celule Vγ1+ neafectate. Astfel, spre deosebire de rolul său esențial în dezvoltarea celulelor αβT, cerința lui Zap70 este limitată la maturizarea timică a celulelor Vγ6+ și la menținerea periferică a celulelor Vγ4+.

Constatările noastre privind rolurile diferite ale lui Zap70 și Syk ar putea oferi un nou indiciu pentru a înțelege mecanismele de semnalizare γδTCR și dezvoltarea celulelor γδT. Zap70 este necesar pentru semnalizarea αβTCR și pentru semnalizarea γδTCR în anumite subseturi de celule γδT. În celulele αβT, activarea lui Zap70 este dependentă de Lck, care este cuplată cu coreceptorii CD4 sau CD8 care se leagă de pMHC de pe suprafața celulelor prezentatoare de antigen . Astfel, se sugerează că Lck-Zap70 este o axă de semnalizare care este specializată în recunoașterea antigenului realizată prin contact celulă-celulă; deși în cazul celulelor γδT, rămâne neclar modul în care Zap70 este activat în ciuda lipsei de expresie CD4 și CD8. În schimb, Syk este asociat cu o gamă largă de imunoreceptori, inclusiv pre-TCR, γδTCR, BCR și FcR . Deoarece Syk este capabilă să fosforileze ITAM-urile și țintele din aval independent de kinazele din familia Src, cum ar fi Lck , acești receptori pot fi activați independent de ligand sau în urma legării la o varietate de antigene solubile, precum și la antigene de pe suprafața celulară. Astfel, utilizarea lui Syk sau Zap70 în semnalizarea imunoreceptorului poate dicta modul în care receptorul recunoaște antigenul. Într-adevăr, exprimarea Syk în locul lui Zap70 a făcut ca celulele αβT să fie capabile să răspundă la stimularea cu anticorpi anti-CD3 solubili, în timp ce celulele αβT normale au răspuns doar la anticorpi anti-CD3 multimerizați care imită interacțiunea cu pMHC de pe suprafața celulară. Aceste constatări ne-au determinat să emitem ipoteza că modul de recunoaștere a antigenului utilizat de limfocite ar putea fi determinat nu numai de receptorul lor în sine, ci și de utilizarea distinctă a kinazelor din familia Syk. Pe baza acestui concept, am prezis că există liganzi γδTCR de suprafață celulară endogeni necesari pentru maturarea timică a celulelor Vγ6+, precum și pentru menținerea periferică a celulelor Vγ4+ și că celulele Vγ1+ nu au nevoie de liganzi γδTCR de suprafață celulară pentru dezvoltarea și/sau menținerea lor.

Procese independente și dependente de γδTCR pentru inducerea γδT17

Un raport recent a demonstrat în mod elegant că celulele γδT17 apar dintr-un progenitor care este distinct de celelalte subseturi de celule γδT . S-a raportat că progenitori intratimici de origine fetală, care exprimă niveluri ridicate de Sox13, au fost identificați într-o populație clasificată anterior ca timocite DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi). Acești progenitori Sox13+ au dat naștere în mod preferențial la celule γδT17 în timusul fetal reconstituit, în timp ce alți progenitori din cadrul populației DN2 nu au făcut acest lucru. Cel mai important, progenitorii Sox13+ au fost detectabili, iar programele lor de linie γδT17 au fost intacte la șoarecii cu deficit de TCRδ sau cu deficit de Rag, ceea ce indică faptul că soarta liniei γδT17 este „pre-cablată” printr-un mecanism intrinsec celular, independent de γδTCR. Cu toate acestea, un raport anterior a arătat că celulele γδT17 se pot dezvolta din stadiul DN2 (CD44+CD25+c-kithi) atunci când sunt co-cultivate pe un monostrat de celule stromale care exprimă ligandul Notch . Astfel, ar putea fi necesară redefinirea etapelor de diferențiere și a relațiilor progenitor-descendent în dezvoltarea celulelor γδT.

Figura 3 rezumă procesele de diferențiere a celulelor γδT, precum și a celulelor αβT, evidențiind diferențele în ceea ce privește cerința semnalelor αβ/γδTCR și a kinazelor din familia Syk. Etapele timpurii ale diferențierii, și anume selecția β pentru linia celulară αβT și selecția γδ pentru linia celulară γδT, sunt conduse de semnalizarea pre-TCR sau γδTCR independentă de ligand, care servește ca punct de control pentru celulele care exprimă un lanț TCRβ funcțional sau, respectiv, un lanț γδTCR funcțional. Aceste semnale de receptor independente de ligand sunt inițiate de Syk, care este exprimată în timocitele DN, inclusiv în precursorii γδT. În linia celulară γδT, semnalul γδTCR mediat de Syk este, de asemenea, necesar pentru inițierea diferențierii celulelor γδT17 prin activarea căii PI3K. Atât în timpul selecției β, cât și în timpul selecției γδ, expresia lui Syk și Zap70 este reglată invers: Syk este reglată în jos, în timp ce Zap70 este reglată în sus la semnalizarea pre-TCR sau γδTCR. Prin urmare, ultimul pas în diferențierea liniei αβT depinde de semnalizarea αβTCR mediată de Zap70, care permite timocitelor DP să recunoască pMHC pe suprafața TEC-urilor pentru a fi selectate pozitiv sau negativ în funcție de puterea interacțiunii αβTCR-pMHC. În schimb, semnalizarea γδTCR mediată de Zap70 ca răspuns la liganzii endogeni determină funcția efectoare a celulelor γδT: un semnal puternic induce γδT1, în timp ce un semnal slab/absent induce γδT17.

.