Rolul catalitic al enzimelor: Transferuri parțiale de protoni și redistribuiri de sarcină scurte și puternice induse de legatura H
Rezultate și discuții
Structurile și energiile diferitelor sisteme model mutante de KSI au fost investigate de-a lungul a trei etape de reacție: în primul rând, abstracția protonului C4-β (ES → TS1 → EI1); în al doilea rând, rotația ușoară a Asp-40 protonat (EI1 → TS2 → EI2); și în al treilea rând, donarea protonului în poziția C6-β de către Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), așa cum se arată în Fig. 1. Profilul energetic prezis al WT (Fig. 2A) este similar cu cel experimental corespunzător al lui Pollack și colaboratorii (25). Trebuie remarcat faptul că la TS2 substratul este parțial neutralizat, deoarece atomii de H ai reziduurilor catalitice se apropie de oxianionul (O3) din substrat, iar electronul în exces se transferă de la substrat la reziduurile catalitice adiacente prin intermediul căilor de legătură H. Astfel, substratul, Tyr-16/57 și Asp-103 împart o unitate de sarcină negativă, iar distribuția sarcinilor lor depinde de afinitățile protonice și de afinitățile electronice ale reziduurilor catalitice ale mutanților. Această stare TS2 cu resturi catalitice este în contrast cu cea fără resturi catalitice, în care substratul este încărcat negativ cu aproape o unitate.
Profiluri energetice calculate (ΔE) (A); distanțe interoxigenice d(O3-Or) (B); distanțe descentrate ale protonilor (ΔrH(descentrat)). (C); scăderea energiei determinată de reziduuri în raport cu sistemul parental (ΔΔEa = ΔE – ΔEa) (D); și scurtarea distanțelor interoxigenice în funcție de calea de reacție în raport cu starea ES (E). În B și C, liniile punctate pentru f și g desemnează al doilea reziduu cel mai apropiat, Tyr-16.
Structurile noastre tridimensionale calculate ale EIs (complexate cu equilenină în loc de steroid) corespund aproape exact structurilor cu raze X ale PI(g′) și TI(g′). În structura prezisă a complexului Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenină, cele două distanțe ale valorilor d(O3-Or) pentru Tyr-16 și Asp-103 (2,54 și, respectiv, 2,55 Å) sunt în bună concordanță cu datele cu raze X (2,6 ± 0,1 Å pentru ambele în cazul PI și 2,58 ± 0,08 Å și, respectiv, 2,62 ± 0,07 Å, în cazul TI) (32, 33, 36). Deoarece structurile calculate au fost optimizate fără constrângeri, concordanța dintre geometriile experimentale și cele teoretice indică faptul că în enzimă reziduurile cheie au interacțiuni aproape maxime cu substratul fără tensiune.
S-a conchis că, în soluție, situsul activ al TI ar putea avea structura diadică (Asp-99… Tyr-14… equilenină) (29), care este diferită de structurile cu raze X ale TI și PI (32, 33). Cu toate acestea, un experiment RMN recent pentru PI/equilenină a indicat că, în PI(D40N)/equilenină, apare o rezonanță caracteristică puternică în câmp descendent la 16,8 ppm și una slabă la 13,1 ppm (36), similară cu cazul TI/equilenină realizat de grupurile lui Mildvan (29) și Pollack (25). Acest rezultat este, de asemenea, demonstrat de calculele noastre ab initio ale complexului Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenină, în care rezonanța puternică de câmp descendent de la 16,5 ppm este atribuită lui Tyr-16. De asemenea, experimentul arată că, în mutantul D103L + D40N, apare o rezonanță puternică în câmp descendent (atribuită lui Tyr-16), în timp ce în mutantul Y16F + D40N, rezonanța puternică dispare. Astfel, acest experiment exclude în mod clar structura diadică în care rezonanța puternică de câmp descendent a fost atribuită lui Asp-103, care este legat prin H de Tyr-16 (36).
Constantele absolute de viteză pot fi investigate prin utilizarea barierelor de activare calculate. La nivelurile B3LYP/6-31+G* și MP2/6-31+G*, bariera de activare a WT a KSI este oarecum subestimată, în comparație cu bariera experimentală (10 până la ≈11 kcal/mol) raportată de Pollack și colaboratorii săi (46). Cu toate acestea, atunci când se ia în considerare efectul de mediu dielectric al KSI (31), bariera de activare a WT este de 8,2 kcal/mol, în strânsă concordanță cu valoarea experimentală. O ușoară subestimare cu 2-3 kcal/mol ar putea fi explicată printr-un calcul mai precis și un sistem model mai complet care să includă reziduuri apolare în jurul situsului activ. Spre deosebire de bariera de activare absolută, barierele de activare relative între diferiți mutanți și, prin urmare, mecanismul de reacție sunt destul de consistente, indiferent de nivelul de calcul, datorită efectului de anulare între diferite sisteme model cu medii similare. Astfel, prin utilizarea barierelor de activare relative între diferiți mutanți, am obținut reactivitatea relativă (raportul dintre constanta de viteză cinetică a unui mutant și cea a WT) sau log(kcat/kcat(WT)) cu ipoteza că transferul de la ES la TS1 este etapa care determină viteza de-a lungul căilor de reacție (a se vedea nota de subsol a tabelului 1). Calculele MP2 consolidează rezultatele obținute la nivelul B3LYP. Valorile prezise ale log(kcat/kcat(WT)) sunt în bună concordanță cu valorile măsurate pentru PI (32-35) și TI (25-28, 31) (tabelul 1) (tabelul 1). Având în vedere că structura tridimensională (terțiară și cuaternară) extrem de omoloagă și mediul situsului activ al TI sunt similare cu cele ale PI, este de așteptat ca reacțiile catalitice din cele două KSI să se desfășoare în același mod.
- Vezi în linie
- Vezi popup
Energii de activare calculate (ΔETS1‡), reactivități relative , și deplasări chimice RMN (δEI1) pentru șapte sisteme model (a-g) de KSI
Fig. 2 prezintă profilurile energiilor și distanțelor legăturilor H pentru diferite mutante de-a lungul traseului de reacție. Profilurile energetice globale (ΔE) (Fig. 2A) sunt aproape simetrice în raport cu TS2. Barierele din prima și a treia etapă sunt similare. A doua etapă, care are o barieră mică (≈1 kcal/mol), nu poate fi determinantă pentru viteză, deoarece implică doar o ușoară deplasare a atomului H printr-o rotație minimă (de doar câteva grade, deoarece Asp-40 este foarte înclinat față de planul substratului) în jurul unei legături C-C (sau a unei legături C-H în figurile 1 și 3). Astfel, reacția poate fi considerată practic ca fiind un mecanism în două etape. Reziduurile catalizează prima etapă prin donarea (parțială) a unui proton către substrat (ca acid), în timp ce a treia etapă este catalizată prin acceptarea (parțială) a unui proton de la substrat (ca bază). Se face referire la distanțele interoxigenice ale legăturilor H și la distanța descentrată a unui proton comun față de punctul median al lui O3 și Or, unde valoarea pozitivă/negativă indică faptul că protonul se află în apropierea reziduurilor/substratului.
Compararea HOMO-urilor TS2 a două sisteme model, (a) Parent și (g) Asp-103 + Tyr-16/57. Nivelurile energetice MO (în eV) sunt desenate în linii roșii și albastre pentru ɛ = 1 și, respectiv, 10. Cazul pentru ɛ = 80 (nu este desenat) este similar cu cel pentru ɛ = 10. În cazul a, energia HOMO a TS2 este ridicată (-0,4 eV) în comparație cu cea a ES (-1,7 eV), deoarece o sarcină negativă trebuie să fie stocată în substrat. Cu toate acestea, energia HOMO a ES prin EP în cazul g este oarecum constantă și foarte negativă (-2,0 până la ≈-2,7 eV). Astfel, MO demonstrează în mod clar modul în care reziduurile catalitice din cazul g scad bariera de activare prin rearanjamentele proton-electron conduse de SSHB în comparație cu cazul a. Pentru cazul g, o puternică conjugare π este responsabilă pentru schimbarea ordinii legăturilor (rearanjamente electronice). Această conjugare π scade drastic energia HOMO (-2,0 eV), deoarece sarcina negativă din substrat responsabilă de creșterea energiei HOMO a lui a este stocată temporar pe reziduurile catalitice Tyr-16 și Asp-103 la HOMO-urile de la al doilea la al șaselea (-3,4, -4,1, -4,4, -4,4, -4,6 și -4,6 eV). Energia celui de-al șaptelea MO care arată conjugarea π completă prin patru atomi de C 3-6 (adică aceleași ordine de legătură de 1,5 pentru toate aceste legături conjugate carbon-carbon), care este responsabilă de deplasarea H din poziția C4 în C6, este, de asemenea, scăzută (-4,7 eV). Această energie scăzută este în contrast cu energia ridicată (-3,5 eV) a MO corespunzător pentru conjugarea π completă în cazul a. În cel de-al treilea HOMO al lui g, care corespunde celui de-al doilea HOMO al lui a, oxianionul este puternic stabilizat prin interacțiunea sa cu atomii H ai reziduurilor Tyr-16 și Asp-103. Acești atomi H sunt puternic desecretizați (și, prin urmare, sunt responsabili de deplasări chimice mari) de către doi atomi O puternic retragători de electroni ai reziduurilor, în timp ce fiecare atom H desecretizat (sau proton) partajat de ambii atomi O anionici prezintă unele dintre caracteristicile orbitalului de tip p puternic polarizat (datorită hibridizării sp cu care protonul face legătura între cei doi atomi O). Această analiză reflectă într-un fel caracteristicile SSHB datorate interacțiunilor MO, precum și interacțiunilor electrostatice neinduse.
Pentru reziduurile acide cu afinitate protonică mai mică (pA în faza gazoasă sau pKa în mediul dielectric), bariera de activare ar fi mai mică pentru prima etapă și mai mare pentru a treia etapă, în timp ce reziduurile bazice cu pA sau pKa mai mare ar produce un efect contrar. În consecință, în mecanismul enzimatic în două etape, puterea catalitică optimă este obținută atunci când reziduurile enzimei joacă un dublu rol de donator/acceptor de protoni foarte puternic către/de la substrat alternativ (care va fi denumit catalizator amfoacid/bază sau tampon de protoni/electroni) pentru reacția globală. În mediul dielectric al enzimelor, efectul catalitic maxim se obține în cazul unor pKa egale ale reziduurilor și substratului . Această situație este în contrast cu reacțiile într-o singură etapă, în care o diferență mare de pKa sporește reactivitatea (47, 48). Condiția de pKas egal între reziduuri și substrat pentru efectul catalitic maxim corespunde cerinței ca reziduurile din enzimă să posede pKas echivalent cu substratul pentru a forma SSHB-uri maxime (4-7, 15, 23, 24). Astfel, în mecanismul de reacție în două etape al KSI, SSHBs, în calitate de catalizatori amfoacizi/baze, împreună cu navetele parțiale de protoni și redistribuirile de sarcină, joacă un rol crucial în stabilizarea puternică a EIs cu ≈15 kcal/mol în energia de stabilizare determinată de reziduuri și în scurtarea distanței interoxigenice dependentă de calea de reacție în raport cu starea ES .
Energia de stabilizare determinată de reziduu ΔΔEa este într-o anumită măsură corelată cu ΔdES, cu excepția cazului în care transferul de protoni are loc de la reziduu la substrat (adică, cu excepția cazului în care ΔrH se află într-o regiune negativă în Fig. 2C). Prin urmare, stabilizarea la EIs și TSs poate fi corelată cu scurtarea distanței legăturii H și, prin urmare, a rezistenței legăturii H, în raport cu starea ES. Altfel spus, legăturile H normale (sau obișnuite) (între parteneri neutri) la ES tind să devină SSHB (care implică specii ionice) la EIs și TS2. Astfel, aceste legături scurte ar trebui să fie responsabile pentru o parte din scăderea de energie determinată de reziduuri. În ceea ce privește transferul de protoni, potențialul la ES este un singur puț pentru toți mutanții, în timp ce forma potențialului (în apropierea EIs sau TSs) în regiunea în care ΔrH este aproape de zero (adică, în jurul TS1/EI1 pentru c și EI1/TS2 pentru e și f în Fig. 2C) prezintă unele caracteristici ale unui puț dublu. Pentru o valoare absolută mică a ΔrH (<≈0,5 Å) (Fig. 2C), bariera pentru transferul de protoni se dovedește a fi foarte mică în calculele noastre, astfel încât transferurile de protoni în potențialul de tip dublu puț nu pot explica singure scăderea drastică a barierei de activare. Într-adevăr, cazul g, în care caracteristicile de tip double-well ale potențialului aproape că dispar cu un transfer mic de protoni, prezintă o scădere mai mare a energiei decât cazul f, care implică transferul de protoni într-un potențial de tip double-well. Pe de altă parte, trebuie remarcat în Fig. 2 D și E că, după ce au loc transferurile de protoni, ΔdES nu se mai scurtează, ci se lungește ușor, în timp ce ΔΔEa se reduce în continuare. Astfel, doar scurtarea lungimii legăturii H (adică ΔdES) nu poate explica scăderea drastică a barierei la TSs și EIs (adică ΔΔEa). Astfel, scăderea barierei la TSs și EIs trebuie să fie explicată prin forțe de interacțiune suplimentare, care vor fi discutate în termeni de interacțiuni de orbital molecular (MO) între substraturi și reziduuri (care implică rearanjamente electronice induse de transferul de sarcină sau redistribuiri de sarcină).
În cazul a două reziduuri concurente ca în f și g, stabilizarea cumulativă a EIs/TSs are ca rezultat un kcat mai mare. Cu toate acestea, acest efect este oarecum subadditiv (adică mai mic decât suma energiilor de stabilizare ale fiecărui reziduu) ca urmare a puterii reduse de retragere a protonilor de către oxianiune pentru fiecare reziduu din cauza prezenței celuilalt reziduu. Această subadditivitate indică faptul că SSHB ar implica transferuri de sarcină și polarizare (de exemplu, interacțiuni electrostatice induse) și, eventual, legături covalente parțiale. Într-adevăr, stabilizarea EIs și TSs în prezența reziduurilor catalitice rezultă în principal din delocalizarea electronului în exces prezent în situsul activ prin transfer de sarcină și polarizare, ceea ce se va vedea mai jos. Sarcinile efective de populație a orbitalului de legătură naturală (49) al substratului în cazurile a, c-e și f la TS1 sunt -0,57, ≈-0,43 și, respectiv, -0,37. Astfel, sarcina negativă a substratului este mai redusă în prezența a două reziduuri catalitice. Această reducere provine din transferul electronului în exces de la substrat la reziduurile catalitice cu afinitate electronică mare, care joacă rolul de tampon pentru electronul în exces. Deși Asp are o putere de retragere a electronilor mai mare decât Tyr, Tyr are o afinitate electronică mai mică decât Asp. Astfel, Tyr este la fel de eficient sau puțin mai eficient decât Asp în ceea ce privește scăderea barierei de activare. Stabilizarea TS-urilor și EI-urilor în prezența reziduurilor catalitice este strâns corelată cu scăderea energiei stării de exces de electroni , deoarece spațiul pentru a găzdui electronul în exces este mărit cu reziduuri catalitice în plus față de substrat. Această scădere a energiei este direct legată de principiul incertitudinii; cu cât electronul în exces este mai puțin localizat, cu atât este mai stabilizat.
Se constată că deplasările chimice calculate (δ) sunt oarecum corelate cu cea mai mică valoare a d(O3-Or) pentru același număr de legături H , în timp ce prezența celei de-a doua legături H crește δ din cauza efectului de ecranare sporit. Pe baza rezultatelor noastre, o valoare mare a δ poate fi adesea un bun indicator al SSHB, dar δ este doar parțial corelată cu kcat. Această corelație scade în special pentru δ mare (>16 ppm) sau valoare absolută mică a ΔrH (<0,5 Å), deoarece dependența kcat de δ a fost pusă sub semnul întrebării (50).
Diminuarea barierelor de activare în prezența reziduurilor catalitice este bine înțeleasă din analiza MO (Fig. 3). Distincția izbitoare a nivelurilor energetice TS2 MO între a și g provine din natura cuantică a densității excesive de electroni acumulate pe substrat prin deprotonarea de către Asp-40. Stabilizarea rezultată, obținută prin disiparea unei părți din densitatea de electroni către reziduurile catalitice, se datorează principiului incertitudinii menționat anterior, care este similar cu ceea ce se observă în cazul unui electron în exces care interacționează cu clusterele de apă (51, 52), ceea ce este în favoarea unui spațiu de cavitate rezonabil de mare. Astfel, prezența reziduurilor catalitice (care joacă rolul de tampon de sarcină prin transferul parțial de electroni de la substrat la reziduurile catalitice) reduce drastic acumularea de sarcină pe oxianion. Această stabilizare a EIs și TSs este asistată în mod esențial de SSHBs. Acest efect este puternic sporit în prezența atât a Asp-103, cât și a Tyr-16/57. Energiile MO din cazul g sunt astfel mult mai mici decât cele din cazul a. Efectul de mediu dielectric al enzimei nu este atât de drastic ca și efectul de reziduu catalitic care implică transferul de electroni. Astfel, navetele parțiale de protoni și redistribuirile de sarcină promovate de SSHB sunt mai responsabile pentru scăderea TS-urilor și EI-urilor decât efectul dielectric al enzimei. În consecință, efectul catalitic rezultă dintr-o combinație favorabilă de câștiguri din energii electrostatice neinduse și energii de interacțiune MO (polarizare, transfer de sarcină și energie de legătură covalentă). În timp ce primele rezultă din navetele parțiale de protoni datorate prezenței legăturilor H încărcate (și, prin urmare, legate de puterea SSHBs), cele din urmă rezultă în principal din delocalizarea electronică din cauza reziduurilor catalitice, care joacă rolul de tampon pentru un electron în exces. Câștigul de energie de interacțiune MO este strâns legat de interacțiunea suplimentară enzimă-substrat promovată de SSHB.
Energia de stabilizare poate fi astfel reprezentată ca sumă a energiei sporite a legăturii H încărcate (care implică specii ionice) a EIs/TSs în raport cu legătura H normală (între parteneri neutri) a ES și a câștigului de energie de interacțiune MO din cauza redistribuirilor de sarcină care implică disiparea electronilor către reziduurile catalitice. Deoarece cei doi termeni energetici nu sunt ușor de separat, este dificil de estimat fiecare termen. Cu toate acestea, evaluăm acești termeni în cazul d utilizând următoarea metodă. Din compararea energiilor lui EI1 în raport cu ES în absența și în prezența lui Tyr-16 (Y16), energia de stabilizare a lui EI1 de către Y16 este de 8,7 kcal/mol. Pentru a investiga contribuția interacțiunii electrostatice neinduse (care nu include efectul de inducție electrostatică al substratului + Asp-40 (D40) asupra reziduului Y16) la stabilizare, am efectuat calculele ES și EI1 în cazul în care Y16 este înlocuit cu un reziduu fantomă compus doar din sarcinile orbitalului său de legătură naturală (NBO) (Y16q), care au fost calculate pentru o singură moleculă Y16 în absența substratului + D40. Apoi, câștigul de energie de interacțiune electrostatică neindusă (sau câștigul de energie electrostatică determinat de preorganizare) este de 4,4 kcal/mol, care este responsabil pentru rezistența sporită a legăturii H încărcate (adică SSHB în sine). Apoi, diferența de energii de stabilizare între efectul cuantic complet prin Y16 și efectul electrostatic neindus prin Y16q (4,3 kcal/mol) ar trebui să provină din energia de interacțiune electrostatică indusă, energia covalentă etc. Interacțiunea electrostatică indusă include efectele de polarizare și de transfer de sarcină. Pentru a obține câștigul de energie electrostatică indusă, am obținut mai întâi sarcinile atomice ale lui Y16 (Y16qind), care include efectul de inducție în prezența substratului + D40. Apoi, am efectuat calculele ES și EI1 în cazul în care Y16 este înlocuit cu un reziduu fantomă (Y16qind) compus numai din sarcinile sale atomice punctiforme. Deoarece această energie de stabilizare este de 8,2 kcal/mol, câștigul de energie electrostatică indusă de interacțiunea dintre substrat + D40 și Y16 este de 3,8 kcal/mol. Astfel, câștigul de energie prin transfer de sarcină și polarizare este mare și comparabil cu câștigul de energie electrostatică neindusă. Reziduul Y16 joacă roluri catalitice importante de tampon de sarcină pentru a retrage și păstra o mare parte din excesul de sarcină negativă din substrat, precum și de redistribuire a sarcinii electronice corespunzătoare în timpul reacției. Această energie electrostatică indusă provine din energia de interacțiune MO prin interacțiunea de sarcină electronică mecanică cuantică între reziduul catalitic (Y16) și substratul + D40 (adică energia de interacțiune substrat-residu determinată de SSHB). În cele din urmă, contribuția energetică rămasă de 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol ar putea corespunde în principal energiei covalente neelectrostatice. Această energie este destul de mică, ceea ce este coroborat și mai mult de analiza noastră MO, conform căreia suprapunerea orbitală neelectrostatică în SSHB în sine nu este semnificativă.
În enzimele care implică un mecanism de reacție în două etape, un substrat nu este complet încărcat negativ, ci este parțial anionic, cu disipare de electroni către reziduurile catalitice. Astfel, în acest caz, creșterea energiei de stabilizare (≈10 kcal/mol la EI1) determinată de SSHB în raport cu legătura H normală se dovedește a nu fi mică . Dacă energia SSHB este extinsă pentru a include interacțiunile substrat-reziduu datorate redistribuirii sarcinilor atât în substrat, cât și în reziduu, energia de stabilizare este suma energiei SSHB determinată de preorganizare și a energiei de interacțiune MO determinată de SSHB. Cu toate acestea, dacă luăm în considerare doar puterea SSHB propriu-zisă, creșterea energiei de legare este mult redusă (la ≈5 kcal/mol).
.