ABSTRACT

Privind ligatura, fiecare fragment Okazaki sintetizat pe șirul de întârziere la eucariote trebuie să fie procesat nucleolitic. Clivarea cu suclază are loc în contextul structurilor de clape 5′ generate prin sinteza de deplasare a șuvițelor de către ADN polimeraza delta. Cel puțin trei ADN nucleaze: Rad27 (Fen1), Dna2 și Exo1, au fost implicate în procesarea fulgilor de fragmente Okazaki. Cu toate acestea, nici contribuțiile nucleazelor individuale la sinteza șirului întârziat, nici structura intermediarilor de ADN formați în absența lor nu au fost clar definite in vivo. Prin epuizarea condiționată a nucleazelor lagging-strand și prin analiza directă a fragmentelor Okazaki sintetizate in vivo în S. cerevisiae, realizăm o evaluare sistematică a impactului lui Rad27, Dna2 și Exo1 asupra sintezei lagging-strand. Am constatat că Rad27 procesează majoritatea clapetelor lagging-strand, cu o contribuție suplimentară semnificativă din partea Exo1, dar nu și din partea Dna2. În cazul în care este afectată scindarea nucleazei, observăm o reducere a sintezei de deplasare a șuvițelor, spre deosebire de generarea pe scară largă a clapetelor lungi ale fragmentului Okazaki 5′, așa cum prevăd unele modele. Mai mult, folosind construcții restricționate de ciclul celular, demonstrăm că atât procesarea nucleolitică, cât și ligatura fragmentelor Okazaki pot fi decuplate de la replicarea ADN și întârziate până după ce sinteza majorității genomului este completă.

.