PMC
TEST METHODS FOR PHOTOTOXICITY AND ANIMAL ALTERNATIVES
Este esențial să se asigure fotosiguranța substanțelor chimice atunci când există șanse de expunere umană, așa cum se poate exemplifica în mod clar în cazul produselor farmaceutice (20) sau al produselor cosmetice (21). Pentru a evalua potențialul de fototoxicitate al unei substanțe chimice, au fost introduse diverse metode de testare care variază de la teste in silico(22), in chemico(23), in vitro până la teste in vivo. Au fost dezvoltate și utilizate în mod curent teste in chemico, cum ar fi generarea de ROS (24), teste in vitro care includ testul 3T3 NRU și modelul de epidermă 3D, și studii in vivo care utilizează cobai, șoareci sau șobolani pigmentați (25).
Sursa de lumină pentru fototoxicitate. Sursa de lumină pentru fototoxicitate este extrem de importantă, deoarece lungimile de undă absorbite de substanța chimică de testat (spectrul de absorbție) și doza de lumină (realizabilă într-un timp de expunere rezonabil) trebuie să fie suficiente pentru a induce fototoxicitate (26). Simulatoarele solare care simulează lumina naturală a soarelui sunt considerate sursa de lumină artificială ideală (Fig. 5).
Distribuția puterii de iradiere a simulatorului solar filtrat trebuie să fie apropiată de cea a luminii de zi exterioare. Simulatoarele solare sunt echipate cu arce cu xenon sau cu arce cu halogenură de mercur-metal (dopate). De asemenea, acestea ar trebui să fie filtrate în mod corespunzător pentru a atenua lungimile de undă UVB foarte citotoxice. Spectrul înregistrat sub aceste filtre nu trebuie să se abată de la lumina exterioară standardizată a zilei (Specificație: FDA CFR Partea 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
Cu toate acestea, alte surse de lumină UVA, cum ar fi lampa UVA, pot fi, de asemenea, utilizate cu un dozimetru UV adecvat pentru a verifica intensitatea și lungimea de undă. Intensitatea luminii (iradierea) variază în funcție de surse, iar aceasta trebuie verificată periodic înainte de fiecare test de fototoxicitate cu ajutorul unui UV-metru de bandă largă adecvat. UV-metrul trebuie să fi fost calibrat înainte de fiecare măsurare. În consecință, timpul de iradiere depinde de intensitatea sursei de lumină (de exemplu, pentru o sursă de lumină de 1,7 mW/cm2, este necesar un timp de expunere de 50 min pentru a obține 5 J/cm2). Timpul de iradiere variază, de asemenea, în funcție de metodele de testare. S-a stabilit că o doză de 5 J/cm2 (măsurată în intervalul UVA) este necitotoxică, dar suficient de puternică pentru a excita substanțele chimice pentru a provoca reacții fototoxice în testul de absorbție a roșului neutru 3T3.
3T3 Neutral red uptake assay. Testul 3T3 NRU a fost aprobat oficial de OCDE și avizat ca OECD TG432 în 13 aprilie 2004 (3). Acest test evaluează fotocitotoxicitatea prin determinarea reducerii relative a viabilității celulare după expunerea la articolul de testat în prezența față de absența iradierii UV/VIS. Decizia de a efectua testul de fototoxicitate 3T3 NRU se ia pentru substanțele chimice care prezintă spectre de absorbție în regiunea UV/VIS atunci când sunt dizolvate în solventul corespunzător (17). S-a sugerat că, în cazul în care coeficientul de extincție/absorbție molară este mai mic de 10 litri x mol-1 x cm-1, este puțin probabil ca substanța chimică să fie fotoreactivă (de exemplu, în cuva UV cu un traseu luminos de 1 cm lungime, DO a soluției 0,05 M trebuie să fie mai mică de 0,5 pentru a fi considerată ca fiind nefotoreactivă, pe baza ecuației „absorbție = coeficient de extincție x lungimea traseului x concentrație”) (26). Testul 3T3 NRU prezintă o capacitate de predicție foarte sensibilă, dar puțin specifică (o sensibilitate de 93 % și o specificitate de 84 %). Testul 3T3 NRU are multe limitări. Acesta nu poate prezice alte efecte adverse decât foto(cito)toxicitatea care pot apărea în urma acțiunii combinate a unei substanțe chimice și a luminii, cum ar fi fotogenotoxicitatea, fotoalergia (fotosensibilizarea) sau fotocarcinogenitatea. Testul 3T3 NRU este utilizat doar pentru identificarea pericolelor, în timp ce utilitatea sa pentru evaluarea potenței fototoxice nu este justificată.În special, acest sistem de testare nu are activitate metabolică, care este esențială în manifestarea substanțelor chimice expuse sistemic. Prin urmare, pentru substanțele chimice expuse sistemic care necesită activare metabolică, cum ar fi monocrotalina, riddelliina și heliotrina (alcaloizi pirrolizidinici) (28), se recomandă studii in vivo pe animale (5,29).
Principiul fundamental al testului 3T3 NRU este compararea viabilității celulare în prezența sau absența iradierii UV/Vis, determinată cu colorantul vital, roșu neutru, care este un colorant cationic slab care penetrează cu ușurință membranele celulare și se acumulează intracelular în lizozomii celulelor viabile. Linia celulară de bază este celula Balb/c 3T3, care este un fibroblast de șoarece dezvoltat din embrioni de șoarece de către G.T. Todaro în 1968. Denumirea 3T3 semnifică „transfer de 3 zile, inocularea a 3 × 105 celule” în farfurie de 20 cm2 , iar această celulă este relativ stabilă, ușor de obținut și ușor de manipulat (30). Fibroblastul cutanat este una dintre celulele-țintă ale fototoxicității, ceea ce oferă o justificare solidă pentru utilizarea celulelor 3T3.
Pentru a decide dacă articolul de testat este sau nu fototoxic în testul 3T3 NRU, se obține concentrația-răspuns în prezența și în absența iradierii. Se calculează factorul de fotoiritare (PIF) sau efectul fotoelectric mediu (MPE) (31). PIF este raportul dintre IC50 (concentrația care scade viabilitatea celulară cu 50%) a celulelor neiradiate și cele iradiate, așa cum se arată în Fig. 7.
Când nu se poate obține IC50, MPE se calculează după următoarea ecuație
PIF < 2 sau se prezice un MPE < 0,1: „fără fototoxicitate”. Un PIF > 2 și < 5 sau un MPE > 0,1 și < 0,15 prezice: „fototoxicitate probabilă” și un PIF > 5 sau un MPE > 0,15 prezice: „fototoxicitate probabilă” și un PIF > 5 sau un MPE > 0,15 prezice: „fototoxicitate” (Fig. 8).
Test de hemoliză a eritrocitelor. Membranele celulare sunt vulnerabile la ROS și la radicalii generați fotochimic. Deteriorarea eritrocitelor indusă de UVA și hemoliza rezultată (fotohemoliză)este valorificată pentru a evalua potențialul fototoxic al articolelor de testare (32). Eritrocitele de oaie (SRBC) sunt incubate cu substanțe chimice și iradiate cu UVA la 20 J/cm2. După iradiere, SRBC-urile au fost incubate în întuneric timp de 2 ore la temperatura camerei și apoi încă 1 oră la 37℃, după care hemoliza a fost măsurată cu reactivul lui Drabkin și măsurarea absorbției UV la 540 nm. Gradul de fototoxicitate a fost evaluat prin eliberarea hemoglobinei din SRBC, adică activitatea fotohemolitică, conform ecuației (33).
-
ADE: densitatea optică a soluției de medicament expuse cu eritrocite
-
AD: densitatea optică a soluției de medicament expuse fără eritrocite
-
C: densitatea optică a soluției de control 100% hemolitic
-
Oxigenul sangvin + imidazol
-
→ → imidazol oxidat
-
+ RNO
-
→ albire cu RNO + produse
Fototoxicele precum ciprofloxacina, norfloxacina sau enoxacina cresc semnificativ activitatea fotohemolitică peste 20% la 100 μg/mL. Sensibilitatea, specificitatea și acuratețea acestui test au fost de 67%, 73% și, respectiv, 73% pentru 24 de substanțe chimice (8 parfumuri, 5 absorbanți UV, 4 medicamente, 4 antimicrobiene și 3 coloranți) în comparație cu testul in vivo pe cobai (34). Sensibilitatea scăzută poate fi problematică, iar performanța sa este mult inferioară celei a testului 3T3 NRU, ceea ce poate explica scăderea utilizării acestui test în ultima vreme.
Model in vitro de epidermă umană 3D. Pentru a depăși limitările metodelor in vitro bazate pe celule, modelul de epidermă reconstruită 3D este în curs de investigare pentru aplicarea la testele de fototoxicitate (35,36). Practic, principiul testului este similar cu cel al testului 3T3 NRU, și anume evaluarea diferenței de viabilitate tisulară între în prezența și absența iradierii UV/VIS. Se poate utiliza un model de predicție similar care utilizează PIF și MPE (37). Cu toate acestea, în modelul de epidermă 3D, pot fi testate materiale insolubile în apă și se păstrează o anumită măsură a capacității metabolice în keratinocitele primare din stratul epidermic, care poate fi aplicată la substanțele toxice care necesită activare metabolică (38). În plus, măsurarea producției de citokine, cum ar fi IL-1β (Interleukina-1β) (39), testul cometei (40) și examinarea histologică sunt posibile care pot fi luate în considerare în evaluarea ulterioară a fotoalergenicității și fotocarcinogenității.
Metode in vivo care utilizează cobai, șoareci sau șobolani pigmentați. Animalele de laborator, cum ar fi șoarecii și porcii de Guineea, sunt folosite pentru a simula scenariul real al fototoxicității umane. Animalele sunt expuse la substanțe chimice pe cale topică sau sistemică și sunt iradiate cu o doză corespunzătoare de UVA (în general, 10 J/cm2 pentru testul cobaiului, 20 J/cm2 pentru testul șoarecelui (41)). Punctajul eritemului și al edemului de la 0 la 4 se însumează, iar scorul maxim pe parcursul a 72 de ore de observație se face o medie pentru fiecare animal pentru a genera un indice de iritație. Indicele de fototoxicitate se obține prin ecuația „Indicele de iritație al zonei iradiate cu UVA – Indicele de iritație al zonei neiradiate” (42). Un indice de fototoxicitate mai mare de 0,6 indică potențialul de fototoxicitate. Alternativ, grosimea urechii poate fi măsurată pentru a estima edemul în testele pe șoareci. Aceste teste in vivo reflectă bine procesul fiziopatologic al fototoxicității la om, dar sacrificiile de animale, cheltuielile și timpul necesar pentru efectuarea testului ridică multe probleme, mai ales în era conștientizării pe scară largă a bunăstării și eticii animalelor. Testele de fototoxicitate care nu se bazează pe animale câștigă popularitate în zilele noastre pentru a depăși aceste probleme (43).
Metode in chemico pentru evaluarea fototoxicității. Metodele de testare în eprubetă fără celule, și anume in chemico, au fost explorate pentru evaluarea fototoxicității. Informațiile privind absorbția luminii și fotostabilitatea articolului de testare au fost analizate pentru a prezice fototoxicitatea (44). Utilizând generarea de specii reactive de oxigen în timpul fotoexcitației și fotoreacțiunea ulterioară, potențialul fototoxic al unui produs chimic poate fi evaluat in chemico(12). Oxigenul singulet este detectat prin decolorarea cu p-nitrosodimetilanilină (RNO), în timp ce testul Nitro Blue-Tetrazolium (reacția NBT-formazan) este utilizat pentru a determina generarea de peroxid, așa cum este ilustrat mai jos (24),
Proba de generare a RNO a prezentat o sensibilitate și o specificitate de 90% și 76.9% pentru produsele cosmetice și de 100% și 75% pentru produsele chimice non-cosmetice. Activitatea de rupere a catenei de ADN este o altă modalitate de a evalua fototoxicitatea indusă de UV a diferitelor tipuri de substanțe chimice, sau a medicamentelor în chimie prin cuantificarea ADN-ului circular deschis sau închis. De asemenea, acest test nu necesită celule sau țesuturi vii, ci plasmidă. Plasmidul se dizolvă în tampon și se amestecă cu articolele de testare. După ce amestecul a fost iradiat cu UV, probele sunt supuse la electroforeză. Cantitatea de ADN de rupere este analizată prin tehnologia bazată pe fluorescență. Compoziția fototoxică indusă de UV are ca rezultat deschiderea șirurilor de ADN și este dependentă de concentrația medicamentului și de doza de iradiere UV (33). Aceste teste nu necesită celule sau țesuturi vii care pot contribui la variabilitatea rezultatelor testelor. Cu toate acestea, aceste metode au limitări care includ lipsa capacității de activare metabolică, inaplicabilitatea materialelor insolubile în apă (uleiuri, solide, geluri, produse formulate) și incapacitatea de a prezice fotogenotoxicitatea, fotoalergia (fotosensibilizarea) sau fotocarcinogenitatea. Acest test este limitat la identificarea pericolelor, nu pentru o evaluare a potenței fototoxice.
.