PMC
Utilizarea NEBcutter
NEBcutter acceptă o secvență de intrare, care poate fi lipită, preluată dintr-un fișier local sau recuperată de la NCBI ca fișier GenBank prin intermediul numărului de acces. Sunt disponibile diverse opțiuni pentru a selecta dimensiunea ORF-urilor care urmează să fie afișate și setul de enzime de restricție care urmează să fie utilizate. Programul calculează pozițiile tuturor situsurilor enzimelor de restricție, observându-le pe cele care ar putea fi blocate de metilarea suprapusă și găsește ORF-urile din secvență. Apoi afișează o diagramă schematică a secvenței, ORF-urile lungi, pe baza regulilor descrise în „Methods” și toate enzimele de restricție care o taie o singură dată. Afișajul inițial arată, de asemenea, enzimele care pot fi utilizate într-o digestie completă pentru a extirpa fiecare ORF care este afișat. Figura Figura11 prezintă o digestă tipică, în acest caz o vizualizare liniară a plasmidului pBR322. Dacă secvența originală de ADN este circulară, atunci sunt oferite atât afișări liniare, cât și circulare. De la afișarea inițială există multe opțiuni pentru a merge mai departe, inclusiv digestia personalizată cu enzime la alegere și diverse afișări ale digestului. De asemenea, este posibil, din afișările liniare, să măriți o regiune selectată a secvenței pentru o vizualizare mai detaliată. O opțiune permite selectarea unei anumite regiuni și afișarea acelor enzime care taie imediat adiacente regiunii respective. Acest lucru este util pentru a găsi enzimele capabile să excizeze regiunea dorită. Dacă zoom-ul conduce la o regiune de <60 nucleotide, atunci este afișată secvența reală (Fig. (Fig.2),2), împreună cu orice traducere care este adecvată. Pe acest afișaj sunt afișate toate enzimele care taie secvența, toate bazele care fac parte din secvența de recunoaștere a unei enzime de restricție sunt evidențiate, iar deplasarea mouse-ului peste numele unei enzime va produce o casetă cu secvența de recunoaștere notată, iar secvența însăși devine subliniată în afișaj.
Afișarea liniară a unei digestări a plasmidului pBR322. Observați că cele două ORF-uri principale sunt flancate de situsuri (MseI și PflMI; BspHI și EarI) care ar putea fi folosite pentru a le extirpa din întreaga secvență plasmidică. În această prezentare sunt indicate numai enzimele care scindă secvența o singură dată. Opțiunile pentru digestie și afișare ulterioară sunt disponibile prin intermediul butoanelor din partea de jos a afișajului.
Afișaj cu zoom al unei regiuni scurte din pBR322. Observați că bazele evidențiate în roșu și albastru formează părți ale situsurilor de recunoaștere a enzimelor de restricție. Cele roșii sunt lipsite de ambiguitate, în timp ce cele albastre sunt baze degenerate. Astfel, BsiEI recunoaște secvența CGRYCG. Reziduurile CG exterioare sunt invariabile, în timp ce bazele interioare sunt degenerate și, în secvența specifică prezentată, sunt GT. Bazele indicate cu negru nu fac parte din niciun situs de recunoaștere a enzimelor de restricție. Această afișare poate fi utilă pentru a găsi enzime de restricție capabile să distingă alelele SNP.
În orice afișaj principal, deplasarea mouse-ului peste numele unei enzime de restricție va afișa secvența de recunoaștere a acesteia și numărul exact al bazei la care aceasta clivează. Dacă este prezent mai mult de un situs pentru enzima respectivă, atunci toate celelalte situsuri sunt subliniate. Dacă se face clic pe numele enzimei, se va afișa o pagină cu un rezumat al informațiilor despre enzimă, inclusiv sensibilitatea sa la metilare, tipurile de terminații produse, izoschizomerii care sunt disponibili și o listă cu alte enzime care pot produce terminații compatibile. Pentru enzimele NEB, sunt furnizate informații despre condițiile de digestie și un link către site-ul web al NEB.
O caracteristică esențială a NEBcutter este aceea că încorporează tot ceea ce este înregistrat în REBASE despre sensibilitatea la metilare a oricăreia dintre enzimele afișate atunci când acestea se suprapun peste un situs Dam (GATC), un situs Dcm (CCWGG), un situs CpG, un situs EcoKI (AACN6GTGC) sau un situs EcoBI (TGAN8TGCT). Atunci când se efectuează digestări teoretice, rezultatele includ o comparație a efectelor metilării, evidențiind benzile care se deplasează (Fig. (Fig.33).
Digest teoretic care arată efectele suprapunerii metilării Dcm asupra situsurilor MscI (secvența de recunoaștere: TGGCCA) prezente în secvență dacă bacteriofagul lambda ar fi fost cultivat într-o tulpină de E.coli care exprimă metiltransferaza Dcm (secvența de recunoaștere: CCWGG). Fragmentele care sunt afectate de metilarea Dcm sunt indicate cu roșu. Gelul virtual se bazează pe interpolarea unei curbe spline cubice generate din date experimentale produse cu fragmente de dimensiuni cunoscute.
În fiecare pagină sunt furnizate linkuri fierbinți care conduc înapoi la pagina principală, oferă ajutor în interpretarea afișajului sau permit utilizatorilor să trimită comentarii autorilor. Interfața a fost concepută pentru a fi cât mai intuitivă posibil și pentru a oferi acces ușor la principalele funcții utile pentru cercetătorii care încearcă să își scindeze ADN-ul. Versiunea actuală a NEBcutter a procesat mai mult de 400 000 de secvențe de la utilizatori. În prezent, pregătim o serie de îmbunătățiri pentru NEBcutter, iar versiunea 2.0 este programată să fie lansată până la 1 iulie.
.