Canoima centrală în biologia moleculară este ADN→ARN→PROTEINE. Pentru a sintetiza o anumită proteină, ADN-ul trebuie mai întâi să fie transcris în ARN mesager (ARNm). ARNm poate fi apoi tradus la nivelul ribozomului în lanțuri polipeptidice care alcătuiesc structura primară a proteinelor. Majoritatea proteinelor sunt apoi modificate printr-o serie de modificări posttraducționale, inclusiv plierea proteinelor, formarea de punți disulfură, glicozilarea și acetilarea, pentru a crea proteine funcționale și stabile. Expresia proteinelor se referă la a doua etapă a acestui proces: sinteza proteinelor din ARNm și adăugarea de modificări post-traducționale

Aflați mai multe despre biologia moleculară în cartea noastră electronică Plasmide 101!

Cercetătorii folosesc diverse tehnici pentru a controla expresia proteinelor pentru aplicații experimentale, biotehnologice și medicale. Cercetătorii pot vizualiza proteinele in vivo prin marcarea lor cu proteine fluorescente pentru a studia localizarea sau pot purifica proteinele pentru a le studia structura, interacțiunile și funcțiile. Proteinele pot fi, de asemenea, purificate pentru a fi utilizate în cercetarea în domeniul biologiei moleculare (de exemplu, polimerazele și alte enzime ar putea fi purificate și utilizate pentru a manipula ADN-ul) sau în medicină (de exemplu, insulina).

Proteinele, spre deosebire de ADN, care poate fi sintetizat relativ ușor, trebuie să fie produse folosind amestecuri complexe derivate din celule sau folosind celule vii. Există mai multe tipuri de sisteme de expresie utilizate pentru producerea și purificarea proteinelor. Acestea includ sisteme de expresie la mamifere, insecte, bacterii, plante, drojdii și sisteme de expresie fără celule.

În general, strategia generală de expresie a proteinelor constă în transfectarea celulelor cu șablonul de ADN ales de dumneavoastră și în a permite acestor celule să transcrie, să traducă și să modifice proteina dumneavoastră de interes. Proteinele modificate pot fi apoi extrase din celulele lizate prin utilizarea de etichete proteice și separate de contaminanți folosind o varietate de metode de purificare. Decizia privind sistemul de expresie care trebuie utilizat depinde de mai mulți factori:

1. Proteina pe care încercați să o exprimați
2. Cât de multă proteină aveți nevoie
3. Planurile dumneavoastră pentru aplicațiile din aval

În această postare pe blog vom rezuma unele dintre cele mai comune sisteme de expresie, inclusiv avantajele și avertismentele de care trebuie să țineți cont înainte de a alege un sistem.

Sistemele de expresie de mamifere

Celele de mamifere sunt un sistem ideal pentru exprimarea proteinelor de mamifere care necesită mai multe modificări post-translație pentru o funcție adecvată a proteinei. Majoritatea construcțiilor de ADN concepute pentru exprimarea mamiferelor utilizează promotori virali (SV40, CMV și RSV) pentru o exprimare robustă post-transfecție. Sistemele de mamifere pot exprima proteine atât în mod tranzitoriu, cât și prin linii celulare stabile. Ambele metode produc un randament ridicat de proteine dacă transfecția este reușită.

Câteva sisteme de mamifere permit, de asemenea, controlul asupra momentului în care o proteină este exprimată prin utilizarea de promotori constitutivi și inducibili. Promotorii inducibili sunt extrem de utili în cazul în care un produs proteic dorit este toxic pentru celule la concentrații mari. În ciuda avantajelor lor, sistemele de expresie de mamifere necesită condiții de cultură celulară pretențioase în comparație cu alte sisteme.

Sisteme de expresie de insecte

Celele de insecte pot fi, de asemenea, utilizate pentru a produce proteine eucariote complexe cu modificările post-translaționale corecte. Există două tipuri de sisteme de expresie pentru insecte; celule de insecte infectate cu baculovirus și celule de insecte nelitice.

Sistemele de expresie cu baculovirus sunt foarte puternice pentru exprimarea proteinelor recombinate la nivel înalt. Aceste sisteme permit exprimarea la nivel înalt a proteinelor foarte complexe, glicozilate, care nu pot fi produse în celulele E. coli sau de drojdie. Singura problemă cu sistemele baculovirus este că celula gazdă infectată este în cele din urmă lizată. Liza celulară oprește producția de proteine, dar există sisteme de exprimare a celulelor de insecte nelitice (celule sf9, Sf21, Hi-5) care permit exprimarea continuă a genelor integrate în genomul celulelor de insecte. Ambele tipuri de sisteme de exprimare a insectelor pot fi extinse pentru producția de cantități mari de proteine.

Câteva dezavantaje ale sistemelor de expresie a celulelor de insecte includ faptul că producția de virusuri poate consuma destul de mult timp și că celulele de insecte necesită condiții de cultură exigente, similare cu sistemele de expresie ale mamiferelor.

Sisteme de expresie bacteriene

Când se dorește producerea rapidă și ieftină a unor cantități mari de proteine, o celulă gazdă bacteriană este aproape întotdeauna răspunsul. E. coli este cu siguranță una dintre cele mai populare gazde pentru exprimarea proteinelor, existând mai multe tulpini specializate pentru exprimarea proteinelor. Expresia proteinelor în bacterii este destul de simplă; ADN-ul care codifică proteina de interes este inserat într-un vector de expresie plasmidic care este apoi transformat într-o celulă bacteriană. Celulele transformate se propagă, sunt induse să producă proteina de interes și apoi sunt lizate. Proteina poate fi apoi purificată din resturile celulare.

Există mai mulți vectori de ADN populari care pot fi utilizați pentru a produce cantități mari de proteine în celule bacteriene: vectorii pET, pRSET, Gateway pDEST și pBAD, de exemplu. Expresia proteinei din fiecare dintre acești vectori este controlată de un promotor diferit, rezultând niveluri diferite de expresie din fiecare vector; poate fi necesară o expresie mai mică dacă proteina dumneavoastră este toxică pentru E. coli. Dintre toți vectorii, pET, sub controlul promotorului T7 lac și indus de lactoză, oferă cel mai înalt nivel de expresie a proteinei.

În ciuda ușurinței lor de utilizare, este important de reținut că, de obicei, bacteriile nu pot produce proteine de mamifere multidomeniu funcționale, deoarece celulele bacteriene nu sunt echipate pentru a adăuga modificările posttraducționale corespunzătoare. În plus, multe proteine produse de bacterii devin insolubile, formând corpuri de incluziune care sunt dificil de extras fără reactivi duri și răbdare.

Sisteme de expresie a plantelor

Plantele oferă un mijloc ieftin și cu tehnologie redusă de exprimare în masă a proteinelor recombinante. Multe celule din diferite tipuri de plante, cum ar fi porumbul, tutunul, orezul, trestia de zahăr și chiar tuberculii de cartofi, au fost utilizate pentru exprimarea proteinelor.

Sistemele de plante împărtășesc multe dintre aceleași caracteristici și cerințe de procesare ca și sistemele de expresie a celulelor de mamifere, inclusiv majoritatea modificărilor post-translaționale complexe. Cu toate acestea, extracția și purificarea proteinelor recombinate din plante poate fi costisitoare și necesită mult timp, deoarece țesuturile vegetale în sine sunt complexe din punct de vedere biochimic.

Pentru a ocoli aceste probleme, oamenii de știință au profitat de secreția naturală de substanțe biochimice și proteine prin rădăcinile plantelor. Marcarea proteinelor recombinante cu o peptidă vegetală secretată în mod natural permite accesul și purificarea mai ușoară a unei proteine dorite. În ciuda faptului că este o tehnologie destul de incipientă, celulele vegetale au fost folosite pentru a exprima o gamă largă de proteine, inclusiv anticorpi și produse farmaceutice, în special interleukine.

Sistemele de expresie a levurilor

Legumele sunt un sistem de expresie excelent pentru a genera cantități mari de proteine eucariote recombinate. Deși multe specii de drojdie pot fi utilizate pentru exprimarea proteinelor, S. cerevisiae, este cea mai fiabilă și mai frecvent utilizată specie datorită utilizării sale ca organism model în genetică și biochimie.

Când folosesc S. cerevisiae, cercetătorii plasează adesea proteinele recombinante sub controlul promotorului inductibil la galactoză (GAL). Alți promotori utilizați în mod obișnuit includ promotorii inductibili de fosfat și cupru PHO5 și, respectiv, CUP1. Celulele de drojdie sunt cultivate în medii bine definite și pot fi adaptate cu ușurință la fermentație, permițând producția stabilă și pe scară largă de proteine.

În general, sistemele de expresie a drojdiei sunt mai ușor și mai ieftin de lucrat decât celulele de mamifere și sunt adesea capabile să modifice proteine complexe, spre deosebire de sistemele bacteriene. Cu toate acestea, celulele de drojdie au o rată de creștere mai lentă decât celulele bacteriene, iar condițiile de creștere trebuie adesea optimizate. Celulele de drojdie sunt, de asemenea, cunoscute pentru hiperglicozilarea proteinelor, ceea ce poate reprezenta o problemă în funcție de proteina pe care o alegeți.

Sisteme de expresie fără celule

În sistemele de expresie fără celule, proteinele sunt asamblate in vitro folosind componente purificate ale mașinăriei de transcripție și traducere. Acestea includ ribozomi, ARN polimeraza, ARNt, ribonucleotide și aminoacizi. Sistemele de expresie fără celule sunt ideale pentru asamblarea rapidă a mai multor proteine într-o singură reacție. Un avantaj major al acestor sisteme de sisteme este capacitatea lor de a asambla proteine cu aminoacizi marcați sau modificați care sunt utili în diferite aplicații din aval. Cu toate acestea, sistemele de expresie fără celule sunt scumpe și foarte dificil de utilizat din punct de vedere tehnic.

Alyssa D. Cecchetelli este cercetător la Addgene. Ea și-a obținut doctoratul la Northeastern University și este interesată în special de semnalizarea și comunicarea celulară. Îi place să poată ajuta comunitatea științifică să facă schimb de plasmide.

Resurse suplimentare

• Thermofisher Protein Expression Systems
• Expresia proteinelor recombinate în Escherichia coli: progrese și provocări
• Producția de proteine recombinate în exsudatele rădăcinilor de plante

.