Caracterizarea matematică a dinamicii TA

Dinamica TA este dictată de modul în care componentele sale sunt organizate spațial și temporal pe promotor. Deoarece TA poate lua multe stări de configurație distincte și evoluția stării este în esență stocastică, implicând numeroase molecule și interacțiuni complexe, noi folosim teoriile statisticii și probabilității pentru a investiga dinamica TA. Pentru simplitate, presupunem că concentrațiile de specii asociate transcripției, cum ar fi GTF-urile, rămân constante în jurul genei model, iar interacțiunile moleculare care implică promotorul sunt în echilibru dinamic. Termenul „echilibru dinamic” nu înseamnă că interacțiunile moleculare sunt toate reversibile; mai degrabă, acesta presupune doar că TA ar trebui să își recupereze starea actuală după un anumit timp. O genă model și toate speciile din jurul ei constituie un sistem. Ipotezele de mai sus implică faptul că un astfel de sistem se află într-o stare de echilibru. Să luăm în considerare un ansamblu statistic format dintr-un număr mare de astfel de sisteme în esență identice, fiecare dintre ele evoluând independent. Numărul sistemelor este suficient de mare pentru ca toate stările de configurație posibile ale TA să poată fi acoperite de acest ansamblu. Altfel spus, fiecare stare parcursă de o genă individuală cartografiază stările celorlalte gene din ansamblu, iar proporția de gene într-o stare specială X (de exemplu, gene cu potențiatorii lor legați de activatori), P(X), rămâne constantă în timp. În mod echivalent, dacă o genă individuală este observată în orice moment, probabilitatea ca gena să se afle în starea X este, de asemenea, P(X). În acest sens, starea în care se află o genă individuală este un eveniment aleatoriu.

Pentru modelul minimal (Fig. 1a), definim toate stările de configurare ale AT ca fiind un set universal Ω și diferitele stări cu aceleași caracteristici cheie ca fiind următoarele sub-seturi, respectiv (Fig. 1b). A denotă faptul că potențiatorul este legat de un activator. S denotă faptul că promotorul de bază este legat de proteinele din SCF. M denotă faptul că un ARNm nascent este în gestație (inclusiv procesul de la formarea PIC până la ieșirea lui Pol II în elongație). J denotă faptul că activatorul legat de potențiator este conturat la SCF, PIC sau OPC prin intermediul mediatorului. Deoarece inițierea transcripțională eucariotă necesită prezența SCF pe promotorul central4,12, M⊂S. În conformitate cu definițiile, J⊂AS. În setul MJ, M și A sunt concurente, adică activatorii legați de enhancer pot afecta direct acțiunea lui Pol II prin intermediul Mediatorului. Astfel, inițierea transcripțională sub reglementarea directă a activatorilor este descrisă de setul MJ, în timp ce inițierea transcripțională bazală, independentă de activatori, este inclusă în setul M-J. Probabilitatea unui ARNm nascent în gestație, adică probabilitatea ca un ARNm să fie generat, este

unde q este o constantă care reprezintă inițierea transcripțională bazală, iar Aj este un subset din A (a se vedea S1 din informațiile suplimentare pentru detalii). În Aj, activatorii legați de potențiator sunt obligați să intre în contact cu Mediatorul unit cu SCF-, PIC- sau OPC-. Ecuația (1) caracterizează relația dintre producția de ARNm și proprietățile dinamice ale TA.

Cuprinde concentrația de activatori transcripționali

Ajungând la arhitecturi distincte ale cromatinei promotorului în diferite stadii transcripționale, activatorii legați de potențiator pot îndeplini diverse funcții, cum ar fi promovarea acetilării histonelor și recrutarea GTF-urilor4,5,15. În mod specific, setul Aj implică activatorii legați de enhancer care sunt responsabili de manipularea mașinăriei transcripționale bazale și de controlul inițierii transcripționale. Mai mult, activitățile acestor activatori sunt, de asemenea, asociate cu codificarea concentrației nucleare de activatori, deoarece este singurul factor din ecuația (1) care depinde de concentrația de activatori. Aici, investigăm dinamica acestor activatori.

Activatorii se deplasează rapid în nucleu și probabilitatea ca aceștia să ajungă la potențiator este proporțională cu abundența lor nucleară9. Să considerăm o perioadă de timp, în care activatorii implicați în setul Aj se leagă și apoi pleacă de la enhancer timp de m (m = 1, 2, 3, …) cicluri. Definim rata de ocupare temporală RTOR a acestor activatori ca fiind , unde și denotă timpul de legare și, respectiv, de dezlegare a celui de-al j-lea ciclu. Pentru numărul fix na de activatori din nucleu, avem

unde aon și aoff sunt funcțiile de propensiune de legare și, respectiv, de dezlegare (a se vedea S2 din informațiile suplimentare pentru detalii). aon este o funcție de na, în timp ce aoff este independentă de na. Ecuația (2) indică faptul că, pe măsură ce m crește, converge către o valoare deterministă, care este o funcție cu creștere monotonă a lui na (Fig. 1c-d și Fig. S1; aceasta este o proprietate generală și poate fi aplicată în cazurile în care numărul de situsuri de legare cognată pe potențiator este mai mare de unu (a se vedea ecuațiile S13-S18)). Această convergență implică faptul că până și concentrația variabilă în timp a activatorilor poate fi codificată de RTOR, cu condiția ca activatorii să intre și să iasă de pe potențiator suficient de frecvent pe o fereastră de timp cu concentrația lor aproape neschimbată. Într-adevăr, există mecanisme active de disociere care garantează ciclul rapid al activatorilor9,19,20,20,21,22. Timpul de legare a fost estimat ca fiind cuprins între câteva secunde și câteva zeci de secunde9,10. Mai mult, s-a dovedit pe gena endogenă CUP1 că această ciclare rapidă este funcțională10. Este de presupus că RTOR codifică concentrația de activatori transcripționali. Pe de altă parte, în timpul perioadei de timp în care activatorii ciclează pe și de pe enhancer de m ori, probabilitatea ca enhancerul să fie găsit legat de un astfel de activator este . Deoarece media lui pe ansamblul ansamblului este de asemenea f(na), avem

Condițiile de constrângere care asigură răspunsuri transcripționale fiabile

Datorită stocasticitatei în apariția evenimentelor transcripționale, pentru a obține un răspuns transcripțional fiabil este necesar ca codul RTOR, care reprezintă în timp util concentrația de activatori, să fie transpus cu fidelitate ridicată în cantitatea de transcripți. În mod ideal, dacă P(S), și ar fi toate egale cu 1, s-ar realiza o transducție exactă a informației. În cele ce urmează, prezentăm condițiile în care acești trei factori pot fi suficient de mari pentru a asigura răspunsuri transcripționale fiabile în prezența fluctuațiilor aleatorii (figurile S2 și S3 oferă explicații intuitive pentru această subsecțiune).

Ecuația (3) implică faptul că concentrația de activatori nu poate fi codificată suficient fără persistența SCF pe promotor. Astfel, SCF ar trebui să se asambleze rapid atunci când arhitectura cromatinei permite și să fie mult mai stabilă decât activatorii legați de enhancer (condiția I). O astfel de stabilitate a SCF a fost observată experimental, iar timpul de legare a TBP (proteina de legare TATA, componenta centrală a SCF) pe promotor poate fi de până la 20 de minute în celulele umane11. Pentru , Aj este o precondiție a apariției lui J. Deoarece RTOR este determinată de timpii scurți de legare individuali ai activatorilor, J ar trebui să apară imediat după apariția lui Aj (Fig. S3). În caz contrar, informațiile despre RTOR se pierd în mare parte sau chiar sunt utilizate în mod eronat pentru a direcționa inițierea transcripțională (a se observa că J este o precondiție a lui M). Prin urmare, pentru a transfera corect codul RTOR, Mediatorul ar trebui să acționeze așteptând să se lege de activatorii ciclici și să transmită informația prin alosterie23,24,25 (Condiția II). Acest lucru se datorează faptului că alte tipuri de interacțiuni moleculare, cum ar fi coliziunile libere, nu pot transmite cu precizie informațiile privind timpul de legare a activatorilor. Un astfel de alosterism al Mediatorului este susținut de lucrările anterioare26. determină modul în care informația despre RTOR moștenită de J este convertită pentru a ghida cantitatea de transcripți. Deoarece RTOR depinde de legarea intermitentă a activatorilor, un mare necesită ca, în timpul perioadelor scurte de legare, transcriptele să fie produse într-un ritm destul de rapid (Fig. S2) (Condiția III). Această caracteristică este, de asemenea, verificată prin estimări computaționale ale datelor experimentale (a se vedea S3 din informațiile suplimentare). Prin urmare, toate cele trei condiții pot fi îndeplinite în mod natural.

Mecanismul dinamic al transcripției reglate de activator

Cele trei condiții de constrângere de mai sus determină împreună modul în care funcționează TA. Apare în mod repetat o stare în care se formează un spațiu relativ stabil de tip clemă între mediator și potențiator (Fig. 2; conform condițiilor I și II). Deoarece s-a demonstrat experimental că SCF nu este foarte stabil11 , acest spațiu este construit temporar. Spațiul de tip clemă atrage activatorii liberi și apoi îi desprinde rapid, cu RTOR decis de concentrația activatorilor (conform ecuațiilor (2-3)). Odată ce o moleculă de activator ajunge în acest spațiu, apare alosteria în Mediator, rezultând o circumstanță facilitată pentru ca GTF-urile și alte proteine conexe să își îndeplinească funcțiile. În consecință, Pol IIs poate iniția/reiniția transcripția foarte rapid (conform condițiilor II și III), RTOR-ul guvernând cantitatea de transcripți.

Acest mecanism sugerează că interacțiunile moleculare care implică promotorul se supun unor principii dinamice elegante, după cum urmează. Întrucât spațiul de tip clemă este format temporar, acesta este mult mai stabil decât activatorii stabiliți în el. Activatorii pot intra și ieși din spațiu în mod ciclic de mai multe ori chiar și în timpul unor episoade scurte în care concentrația lor rămâne aproape neschimbată; astfel, concentrația de activatori poate fi reprezentată de RTOR în timp util. Deoarece mediatorul transmite informația prin alosterie și rata de reinitializare a transcripției este mult mai mare decât rata de ciclare a activatorilor, codul RTOR este utilizat în mod eficient pentru a direcționa sinteza ARNm. Într-un cuvânt, spațiul de tip clemă este baza structurală pentru răspunsuri transcripționale fiabile. În loc să fie un obstacol, natura stocastică a interacțiunilor moleculare este utilizată pe deplin pentru a induce transcripția în mod fiabil; acest lucru depinde în mare măsură de diferitele grade de stabilitate ale componentelor TA, care se întind pe mai multe ordine de mărime. Argumentele de mai sus sunt susținute de date experimentale, iar scalele de timp tipice sunt următoarele: durata de înjumătățire a spațiului de tip clemă este de aproximativ 5 min11, timpul de ocupare a activatorilor în spațiu este cuprins între câteva secunde și câteva zeci de secunde10, alosteria are loc, de obicei, într-un interval de timp cuprins între câteva milisecunde și nu mai mult de 1 secundă23,24,25 și este nevoie doar de câteva secunde pentru a reîncepe o transcriere (a se vedea S3 din informațiile suplimentare).

Validarea mecanismului prin simulări numerice

Pentru a verifica în continuare mecanismul dinamic propus, construim un model stocastic simplificat al transcripției genice cu parametri fiziologic realiști (a se vedea Fig. S4 și S4 din informațiile suplimentare pentru detalii). Acest model descrie tranzițiile de stare cheie ale TA și, de asemenea, descrie simplu dinamica cromatinei aferente, fiind astfel capabil să caracterizeze răspunsul transcripțional la activatorii transcripționali. În cele ce urmează, „intrare” și „ieșire” denotă concentrația nucleară a activatorilor și cantitatea de produse genice, ARNm sau, respectiv, proteine.

În primul rând, explorăm evoluția temporală a numărului de ARNm celulare la niveluri de intrare constante (Fig. 3a). În mod notabil, ARNm sunt produse într-o manieră de tip burst, în concordanță cu opinia predominantă14,27,28,28,29,30,31,32. Pentru intrările de nivel scăzut, o alelă este transcrisă în timp ce cealaltă este silențioasă într-o celulă diploidă și, astfel, fenomenul de explozie este evident. Cu toate acestea, în cazul intrărilor de nivel înalt, ambele alele se sparg frecvent, astfel încât suma devine aproape constantă. Acest lucru sugerează că fenotipul răspunsurilor transcripționale ridicate persistente poate fi observat la niveluri ridicate de intrare14.

O analiză experimentală recentă a exclus posibilitatea ca mediul cromatinei să joace un rol central în modelarea exploziei transcripționale32. Aici, demonstrăm că o explozie de transcripții își are originea în reinitiarea persistentă de către Pol IIs atunci când spațiul de tip clemă este ocupat de activatori (Fig. 4). Altfel spus, inițierea ARNm este ea însăși de tip burst. Explozia nu este un simplu zgomot; în schimb, este o manifestare directă a codului RTOR, care reprezintă concentrația de activatori și ghidează producția de ARNm.

În al doilea rând, investigăm relația medie intrare/ieșire a răspunsului transcripțional. Ieșirea medie seamănă cu o funcție Hill a intrării, care este utilizată pe scară largă în biologia sistemelor pentru a modela expresia genică3,33,34 (Fig. 3b). Curba deviației standard SDout a ieșirii în funcție de intrare este aproximativ în formă de clopot (Fig. 3c). Intensitatea zgomotului intrinsec, definit ca fiind raportul dintre SDout și media ieșirii35 , este invers corelată cu intrarea (insertul din Fig. 3b). Mai mult, caracteristicile de mai sus sunt insensibile la ușoarele fluctuații ale intrării (adică zgomotul extrinsec) (Fig. S5), sugerând robustețea răspunsului transcripțional la zgomot. Toate aceste rezultate sunt în bună concordanță cu măsurătorile experimentale atât la Saccharomyces cerevisiae36 , cât și la embrionii de Drosophila37. În special, partea stângă a curbei SDout este mai mică decât partea sa dreaptă; această caracteristică este aproape în concordanță cantitativă cu datele experimentale37 (a se vedea S5 din informațiile suplimentare pentru discuții suplimentare). În schimb, abaterile de la principiile dinamice propuse mai sus (inclusiv circumstanțele în care ciclul de activatori este lent, complexul de schelet/spațiul de tip clamp nu este stabil sau/și rata de reinitializare transcripțională este scăzută) ar reduce capacitatea TA de a răspunde în mod fiabil la intrare (Fig. S6).

Se credea că relația intrare/ieșire observată la embrionii de Drosophila se realizează prin utilizarea maximă a limitei interacțiunilor moleculare37,38,39. Proprietățile unor astfel de interacțiuni microscopice sunt integrate pentru a fi manifestate macroscopic ca SDout. Curba SDout este încă în formă de clopot, în general, în comparație cu curba SDin (cf. Fig. 1d). Altfel spus, semnătura codului RTOR poate fi transmisă direct la ieșire. Acest lucru confirmă faptul că rata de ocupare temporală a activatorilor este într-adevăr exploatată pentru a regla transcripția, iar Mediatorul transmite informația prin alosterie. Pe de altă parte, curba SDout este asimetrică, partea dreaptă fiind mai mare decât cea stângă. Motivul este evident. Atunci când intrarea este foarte mare, potențiatorul este legat de activatori aproape tot timpul și, astfel, fluctuațiile reflectă în principal proprietățile dinamice ale SCF și reinitializarea transcripției de către Pol IIs. Simulările noastre ulterioare arată că partea dreaptă a curbei SDout scade odată cu creșterea stabilității SCF sau a ratei de reinitializare transcripțională; numai atunci când se mărește puterea acestora dincolo de intervalele fiziologice, curba poate deveni simetrică (Fig. S6F). Acest lucru verifică, de asemenea, că atât P(S), cât și sunt într-adevăr suficient de mari. Prin urmare, proprietățile SDout ar trebui să dovedească în mod concludent mecanismul transcripțional microscopic.

În al treilea rând, sondăm distribuția nivelurilor de ARNm într-o populație celulară mare expusă la aceeași intrare (Fig. 3d). Pentru intrările mici, fenomenul de explozie este deosebit de evident și majoritatea celulelor nu au niciun ARNm sau au puține ARNm. Acest lucru este în concordanță cu observația experimentală27,30,31. Dar distribuția devine treptat normală pe măsură ce crește intrarea. Pentru aon/aoff >1, distribuția devine mai accentuată odată cu creșterea aportului. Aceste rezultate așteaptă identificarea experimentală.

În al patrulea rând, simulăm răspunsul transcripțional la o intrare care variază periodic. Procesul microscopic pe un promotor este mai degrabă dinamic și stocastic, diferite componente ale TA prezentând stabilități distincte (Fig. 3e). Cu toate acestea, cantitatea de ARNm poate urmări intrarea. Aceste rezultate sunt în bună concordanță cu rezultatele evidențiate de FRAP, și anume, TA este un aparat foarte dinamic8,10,10,11,22. Pe de altă parte, simulările testelor de imunoprecipitare a cromatinei (ChIP), care caracterizează evoluția temporală a distribuției diferitelor stări ale promotorului în cadrul unei populații de celule, dezvăluie o regularitate puternică a distribuțiilor (Fig. 3f). Tiparele atât ale activatorilor care se leagă la potențiator, cât și ale SCF și Pol II care se leagă la promotor urmează intrarea. transcripțiile de ARNm sunt produse în fază cu intrarea, în timp ce histonele ocupă promotorul într-o fază inversă. Toate aceste rezultate sunt în bună concordanță cu constatările experimentale22,40. Prin urmare, discrepanțele observate între rezultatele experimentelor FRAP și ChIP pot proveni din rezoluțiile diferite implicate în măsurători. Măsurătorile ChIP integrează interacțiunile moleculare atât în timp, cât și pe întreaga populație celulară, în timp ce FRAP reflectă mai strâns interacțiunile instantanee. Mai mult, răspunsul transcripțional la intrarea variabilă în timp este robust la zgomotul extrinsec, dar sensibil la semnalele de intrare compozite, iar abaterile de la principiile dinamice (cum ar fi cazurile cu rată scăzută de ciclare a activatorilor, complexul instabil de schelet/spațiu asemănător cu o lampă sau/și rata scăzută de reinitializare transcripțională) ar reduce capacitatea de răspuns (a se vedea figurile S7 și S8).

.