6.2.3 Virusul mozaicului de mazăre

Virusul mozaicului de mazăre (CPMV; Comovirus, Comoviridae) este cea mai studiată platformă pentru diverse conjugări și aplicații biotehnologice. Este un virus icosaedric de 30 nm și constă într-un genom bipartit de ARN cu sens pozitiv, monocatenar, fiecare moleculă de ARN fiind încapsidată într-o particulă separată. Capsida CPMV este compusă din 60 de copii a două subunități CP diferite (denumite mică, 24 kDa, și mare, 42 kDa) cu o simetrie pseudo T = 3 icosaedrică. Datorită prezenței naturii extrem de simetrice și heteromerice a capsidei, CPMV oferă o oportunitate remarcabilă de a introduce în mod diferențiat (în cinci sau trei ori sau în ambele poziții) mai multe tipuri de funcționalități prin inginerie genetică și chimică specifică, cu control atât asupra distribuției spațiale, cât și asupra gradului de multivalență (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). CPMV poate fi purificat în cantități mari din frunzele infectate și este stabil la o gamă largă de temperaturi (până la 60°C) și în intervalul de pH de 3,0-9,0 și poate rezista la unii solvenți organici (Steinmetz et al., 2009). Capsidele CPMV sunt utilizate pentru imobilizarea controlată a enzimelor active. Folosirea capsidelor CPMV pentru fabricarea pe bază de templare a nanoparticulelor metalice prin depunere fără curent electric (ELD) și mineralizare printr-o varietate de procese a permis producerea de straturi subțiri de metale și aliaje cu grosime și compoziție uniforme. Virionii CPMV sunt utilizați ca blocuri de nanoconstrucție pentru construcția controlată a structurilor 2-D și 3-D utilizând o abordare de jos în sus, strat cu strat (LbL) pentru aplicații potențiale ca dispozitive nanoelectronice sau biosenzori electrochimici multipli (analizat în Culver et al., 2015; Wen et al, 2015a, 2016; Narayanan și Han, 2017a).

Părticulele CPMV native și CPMV derivatizate cu complecși metalici de lantanide s-au dovedit a fi sigure și netoxice, pe baza studiilor de biodistribuție, toxicitate și patologie ale acestor particule in vivo (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). S-a constatat că CPMV a fost asociat cu regiuni de inflamație și a indus întreruperea barierei hemato-encefalice în timpul infecției sistemului nervos central (SNC) la șoareci (Shriver et al., 2009). CPMV cu PEGilare de suprafață a demonstrat o imunogenitate scăzută, iar internalizarea a fost împiedicată în mai multe tipuri de celule datorită reducerii legăturii nespecifice (Raja et al., 2003). Manchester și colaboratorii au descoperit că CPMV marcat fluorescent are o capacitate endogenă de a fi preluat de celulele endoteliale vasculare și poate fi utilizat ca sondă de imagistică intravitală pentru a vizualiza vasculatura și fluxul sanguin la o adâncime de până la 500 μm timp de 72 de ore în embrioni vii de șoarece și pui (Lewis et al., 2006). S-a constatat că CPMV are o capacitate naturală de a se lega de vimentina de suprafață, o proteină citoscheletală care modulează arhitectura și dinamica celulelor, și s-a constatat că este supraexprimată în celulele endoteliale, canceroase și inflamatorii (Koudelka et al., 2009). Caracteristicile biocompatibile, de interacțiune naturală cu vimentina și de retenție a endoteliului ale CPMV au fost exploatate în continuare pentru a obține imagini ale angiogenezei tumorale și ale deplasării tumorale in vivo (Leong și colab., 2010; Steinmetz și colab., 2011; Yildiz și colab., 2011; Wen și colab, 2015a).

Suprafața exterioară a capsidei CPMV a fost modificată în mod extensiv cu ajutorul unor reziduuri de lizină, cisteină, tirozină și acid aspartic și glutamic expuse în mod natural sau prin inginerie genetică prin utilizarea unor metode standard de conjugare chimică și a unor reticulanți de conjugare pentru a atașa mai mulți reactivi, cum ar fi nanoparticulele de Au, fracțiuni de metil viologen reactiv redox, fracțiuni organometalice de carboxilat de ferocen, fluorofori, biotină, lanțuri PEG, derivați de stilbene, carbohidrați, proteine heterologe (de ex.g., holo-transferrina umană, lizozimul T4, domianul LRR al internalinei B și produsul genetic Intron 8 al receptorului tirozin kinazei HER2), anticorpi, oligonucleotide, puncte cuantice semiconductoare și fullereni. Incorporarea aminoacizilor nenaturali în capsida CPMV a fost realizată prin mai multe chimii ortogonale (cum ar fi strategia de ligare chemoselectivă a hidrazonei și cicloadiția azidă-alchină catalizată cu cupru (CuAAC) sau reacția „click”). Aceste eforturi au facilitat utilizarea particulelor CPMV ca sonde optice, candidați pentru vaccinuri și nanodispozitive de memorie și senzori (analizate în Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso și Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff și Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan și Han, 2017a). CPMV și TMV au fost încărcate pentru a transporta agenți de contrast pentru imagistica prin rezonanță magnetică (RM) și optică cu dublă modalitate, iar ambele modalități au demonstrat specificitatea legării fibrinei in vitro cu prezența peptidelor de direcționare. Studiile preclinice în cadrul unui model de tromboză prin leziune fotochimică a arterei carotide au confirmat orientarea trombilor către trombi a nanosondele, tijele TMV alungite prezentând o atașare semnificativ mai mare la trombi decât CPMV icosaedrice (Wen et al., 2015b,c). CPMV decorat cu peptide E7p72 (peptidă de legare de înaltă afinitate a domeniului 7 asemănător factorului de creștere epidermică (EGFL7) care vizează în mod specific celulele endoteliale umane) a țintit neovasculatura asociată tumorilor cu o specificitate ridicată, așa cum a fost evaluată prin imagistică intravitală (Cho et al., 2017).

Protocoalele de asamblare in vitro și in vivo pentru subunitățile de capsidă CPMV nu sunt încă bine stabilite. Acest lucru a limitat potențialul său de utilizare ca nanocontainer pentru încapsularea moleculelor de sarcină. Conținutul de acid nucleic nativ al virionilor CPMV a fost utilizat ca un burete electrostatic pentru a atrage agenți de imagistică și molecule terapeutice prin intermediul unei tehnici simple de perfuzie (Yildiz et al., 2013). Coexpresia tranzitorie a precursorului CPMV (VP60), care constă în proteine mari și mici fuzionate, și a proteinazei 24K pentru procesarea proteolitică a VP60 în plante a avut ca rezultat VLP-uri CPMV (eCPMV), care erau complet lipsite de ARN (fie virusul, fie gazda) (Saunders et al., 2009). Astfel de capside goale au fost utilizate pentru a transporta o gamă largă de molecule de încărcătură, cum ar fi metale, coloranți fluorescenți sau medicamente (Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a; Narayanan și Han, 2017a). Fluorofori, etichete de afinitate cu biotină, PEG și diverse peptide au fost afișate selectiv pe suprafața interioară a CPMV-ului gol prin direcționarea lizinelor reactive (Wen et al., 2012b). Eficacitatea eCPMV ca vaccin in situ a fost demonstrată în modele de șoareci de melanom metastatic, cancer de sân, cancer ovarian și cancer de colon, unde a indus un răspuns imunitar antitumoral prin declanșarea activării și a infiltrării neutrofilelor, rezultând un profil de chimio/citokine care duce la activarea imunității adaptative. Cei mai mulți șoareci cărora li s-au reintrodus tumori pe flancul opus au respins complet tumora reintrodusă (Lizotte et al., 2016). Administrarea intratumorală de nanoparticule magnetice (mNP) pentru a induce hipertermia și eCPMV în combinație a îmbunătățit eficacitatea locală și sistemică a tratamentului tumoral (întârzierea creșterii tumorilor secundare (efect abscopal) și rezistența la recontrolul tumoral) în modelele de adenocarcinom mamar C3H de șoarece/MTG-B și de celule canceroase de melanom C57-B6 de șoarece/B-16-F10 (Hoopes et al., 2017a). Utilizând opt cancere canine spontane (două melanomuri orale, trei amelioblastoame orale și un carcinom), Hoopes și colab. (2017b) au demonstrat că s-a demonstrat că radiațiile hipofracționate și hipertermia indusă de mNP și tratamentul intratumoral cu eCPMV în combinație au provocat răspunsuri imune îmbunătățite.

Pentru a utiliza CPMV pentru livrarea țintită a medicamentelor către celulele canceroase și pentru a depăși interacțiunea naturală dintre CPMV și celulele mamiferelor, a fost utilizată o reacție „click” pentru a conjuga PEG și o fracțiune de ligand de folat (CPMV-PEG-FA) la CPMV. Această conjugare a permis direcționarea specifică a CPMV către receptorii de folat (FR) care exprimă celulele HeLa și KB (Destito et al., 2007). Direcționarea CPMV către celulele tumorale de neuroblastom a fost realizată prin modificarea genetică a CPMV pentru a afișa analogul neuropeptidei Y (NPY) ca ligand de direcționare. S-a demonstrat că CPMV-NPY a interacționat în mod specific cu celulele SK-N-MC care au supraexprimat receptorul Y1 (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). Imagistica direcționată către receptori a fost obținută prin ancorarea unor secvențe peptidice scurte (F56 și bombesină specifice receptorilor factorului de creștere a endoteliului vascular-1 (VEGFR-1)) și, respectiv, a receptorilor peptidei eliberatoare de gastrină (GRPR), la CPMV. S-a constatat că acești senzori pe bază de CPMV sunt specifici în ceea ce privește legarea la celulele canceroase care supraexprimă acești receptori pe suprafața celulară (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen și Steinmetz (2014) au dezvoltat o abordare de jos în sus pentru sinteza nanoparticulelor CPMV, a dimerilor și ansamblurilor care conțin liganzi de direcționare (peptide RGD ciclice) și coloranți fluorescenți și au constatat că prezentarea simetrică a peptidelor RGD și dimerizarea nanoparticulelor au crescut eficacitatea direcționării celulelor canceroase.

CPMV a fost utilizat cu succes pentru afișarea mai multor peptide heterologe pentru a induce un răspuns imunitar. Imunizarea animalelor cu fiecare dintre chimeri a indus un răspuns imun umoral puternic care a fost protector împotriva provocării de către agentul patogen respectiv. Afișarea multivalentă a moleculelor antivirale și a carbohidraților pe CPMV a facilitat utilizarea acestora pentru aplicații terapeutice (Lomonossoff și Evans, 2011; Koudelka et al., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) au stabilit conjugarea covalentă a dox cu CPMV fie printr-o legătură amidă, fie printr-o punte disulfură, utilizând reziduuri de lizină sau cisteină pe suprafața externă a CPMV. CPMV-ul încărcat cu dox a prezentat un efect de distrugere celulară mai mare decât dox-ul liber, chiar și la doze mici. CPMV modificat cu o coroană de dendroni încărcați negativ a fost utilizat pentru a încărca fotosensibilizatori încărcați pozitiv (pentru terapia fotodinamică (PDT)). Acest sistem hibrid de transport PDT-CPMV a fost eficient în uciderea atât a celulelor de melanom, cât și a macrofagelor in vitro (Wen et al., 2016). Pentru a depăși toxicitatea nespecifică limitatoare de doză a cromului trivalent (un nutrient mineral benefic), care poate inhiba selectiv proliferarea celulelor musculare netede ale aortei umane (HASMC) induse de un nivel ridicat de glucoză in vitro, clorura de crom a fost încărcată în cavitatea interioară a CPMV prin perfuzie, iar particulele CPMV încărcate cu CrCl3 (CPMV-Cr) rezultate au redus semnificativ proliferarea HASMC indusă de glucoză și au prezentat efecte antiaterogene în condiții de hiperglicemie (Ganguly et al., 2016).