Izozimele hexokinazei mamiferelor: structură, localizare subcelulară și funcție metabolică | Journal of Experimental Biology
Izozomă de tip I
După cum reiese din Fig. 1, hexokinaza servește ca poartă prin care Glc intră în căile metabolice alternative. Cu toate acestea, este probabil sigur să spunem că hexokinaza este cel mai frecvent considerată o enzimă glicolitică, iar metabolismul glicolitic este în general considerat un proces citoplasmatic. Astfel, a fost remarcabil faptul că, spre deosebire de alte enzime glicolitice, activitatea hexokinazei (cunoscută acum ca fiind izozima de tip I) a fost găsită cu precădere în „fracțiile de particule” din omogenatele de creier (Crane și Sols, 1953). Lucrări ulterioare (Johnson, 1960; Rose și Warms, 1967; a se vedea și Wilson, 1995) au demonstrat că hexokinaza particulară era asociată cu mitocondriile și, mai specific, cu membrana mitocondrială externă (Rose și Warms, 1967; Kropp și Wilson, 1970).Legarea depinde în mod critic de o secvență hidrofobă N-terminală (Polakis și Wilson, 1985) care direcționează selectiv izozima de tip I către mitocondrii (Gelb și colab, 1992; Sui și Wilson, 1997) și este introdusă în miezul hidrofob al membranei mitocondriale exterioare în cursul legării (Xie și Wilson, 1988). Porina (denumită, de asemenea, `VDAC’, acronim pentru `canal anionic dependent de voltaj’) formează canalul prin care metaboliții traversează membrana mitocondrială exterioară și a fost identificată ca fiind proteina membranară exterioară a mitocondriilor care interacționează cu hexokinaza (Felgner și colab., 1979; Lindén și colab., 1982; Fiek și colab., 1982). Mai mult decât atât, există dovezi care susțin ideea că legarea hexokinazei are loc în mod preferențial la porina care este localizată în locurile de contact, regiuni în care există un contact intim între membranele mitocondriale interne și externe (Dorbani et al., 1987; Kottke et al, 1988;BeltrandelRio și Wilson,1992a).
Studiile clasice ale lui Johnson(1960) și ale lui Rose și Warms(1967) au fost urmate în curând de rapoarte privind hexokinaza legată la mitocondriile din alte țesuturi normale, în afară de creier, precum și din diferite celule tumorale (pentru referințe, vezi Wilson, 1985,1995). Semnificația fiziologică potențială a acestei asocieri a unei enzime „glicolitice” cu mitocondriile, locul principal al metabolismului oxidativ, a făcut obiectul multor speculații. Încă de la început, în special după recunoașterea faptului că „proteina de legare a hexokinazei” din membrana mitocondrială exterioară era identică cu porina și, prin urmare, că hexokinaza ar putea fi poziționată în apropierea punctului în care ATP ar ieși din mitocondrie (și ADP ar reintra în mitocondrie), speculațiile s-au concentrat în mare măsură asupra posibilității ca această proximitate să favorizeze o interacțiune metabolică intimă între fosforilarea oxidativă intramitocondrială ca sursă de substrat ATP și fosforilarea Glc de către hexokinaza legată de mitocondrie. Această ipoteză a fost, de fapt, luată în considerare de Rose și Warms (1967), dar nu a putut fi susținută de rezultatele lor experimentale. Cu toate acestea, lucrările ulterioare ale altora (din nou, pentru referințe, a se vedea Wilson,1985,1995), folosind hexokinaza legată la mitocondriile din diferite surse, au adus dovezi în sprijinul opiniei că hexokinaza legată la mitocondriile are acces „preferențial” sau „privilegiat” la ATP generat intramitocondrial.
Lucrările din laboratorul nostru au oferit o bază solidă pentru opinia că hexokinaza legată de mitocondriile creierului care fosforilează activ este într-adevăr strâns cuplată la un compartiment intramitocondrial de substrat ATP, generat prin fosforilare oxidativă. Suportul experimental pentru această concluzie a fost descris într-o serie de publicații (BeltrandelRio și Wilson, 1991,1992a,b;de Cerqueira Cesar și Wilson,1995,1998,2002;Hashimoto și Wilson, 2000). O trecere în revistă completă a acestor lucrări nu este posibilă în cadrul constrângerilor contextului actual, dar vom evidenția unele dintre principalele constatări pentru a ilustra varietatea de abordări experimentale, toate conducând la aceeași concluzie, care au fost utilizate în aceste studii.
Studiile inițiale (BeltrandelRio și Wilson,1991,1992a,b)au fost realizate folosind metode spectrofotometrice în care producția de ATP prin diferite procese intramitochondriale (fosforilarea oxidativă, reacția adenilat kinazei, reacția creatin-kinazei) și fosforilarea Glc de către hexokinază au fost legate de producția de NADPH, monitorizată la 340 nm, prin utilizarea unor enzime de cuplare adecvate. Ideea de bază a fost că, prin compararea ratei de fosforilare a Glc cu rata de producere a ATP din diferite surse, se poate deduce importanța relativă a diferitelor procese intramitocondriale generatoare de ATP ca sursă de substrat ATP pentru hexokinază. Concluzia a fost că, atunci când are loc fosforilarea oxidativă, niciadenilat kinaza, nici creatin kinaza nu reprezintă o sursă semnificativă de substrat ATP. Mai mult, doar o fracțiune din ATP produs de fosforilarea oxidativă a fost utilizată de hexokinază, rezultatul fiind că în mediul extramitochondrial a continuat să crească pe măsură ce fosforilarea oxidativă a continuat. Rata de fosforilare a Glc nu a crescut în mod constant ca răspuns la creșterea continuă a cantității de ATP extramitochondrial, în ciuda faptului că aceasta din urmă a fost comparabilă cu Km pentru ATP observată cu ATP extramitochondrial adăugat în absența fosforilării oxidative, adică hexokinaza nu ar fi fost „saturată” cu ATP extramitochondrial ca substrat (figura 2). Acest lucru sugerează cu tărie că nu ATP extramitocondrial a fost utilizat ca substrat.
Fosforilarea glucozei (Glc) în glucoză-6-fosfat (Glc-6-P) de către hexokinaza legată mitocondrial cu ATP exogen sau cu ATP generat prin fosforilare oxidativă. Rata de fosforilare a Glc a fost determinată cu un echivalent, fie adăugat exogen în absența fosforilării oxidative (triunghiuri), fie generat de fosforilarea oxidativă (cercuri). Din oricare dintre surse, rata de fosforilare a Glc a fost subsaturată, rata de fosforilare a Glc fiind cu mult sub cea observată atunci când nivelurile de ATP au fost crescute brusc prin adăugarea de niveluri saturate de ATP exogen (pătrate). Retipărit cu permisiunea lui BeltrandelRio și Wilson(1991).
Un sprijin suplimentar pentru acest lucru a fost oferit de rezultate precum cele prezentate înFig. 3. Aici, Glcfosforilarea a fost monitorizată după inițierea fosforilării oxidative prinadăugarea de ADP, cu concentrații din ce în ce mai mari de ATP extramitochondrial prezent de la început. Așa cum era de așteptat din cinetica clasică Michaelis-Mentenkinetics, rata inițială de fosforilare a Glc a crescut odată cu creșterea concentrației de ATP extramitochondrial . Cu toate acestea, cu timpul, a fost atinsă o rată stabilă de fosforilare a Glc care a fost independentă de cantitatea de ATP extramitochondrial rezidual prezent. Aceste rezultate au fost interpretate ca indicând faptul că, în timp ce hexokinaza legată la mitocondrială folosea inițial ATP extramitocondrial, inițierea fosforilării oxidative a dus la o schimbare în preferința de substrat, hexokinaza devenind dependentă de un compartiment intramitocondrial de ATP în care era determinată de rata fosforilării oxidative și independentă de ATP extramitocondrial.
Fosforilarea glucozei (Glc) de către hexokinaza legată mitocondrial, cu ATPgenerat prin fosforilare oxidativă în prezența unor concentrații crescânde de ATP exogen. Producția de ATP prin fosforilare oxidativă a fost inițiată prin adăugarea de ADP la momentul indicat. Fosforilarea Glc a fost cuplată la producția de NADPH, monitorizată prin absorbția la 340 nm (A), în prezența excesului de glucoză-6-fosfat (Glc-6-P) dehidrogenază. Concentrațiile de ATP exogen, prezente în momentul adaosului de ADP, au fost de 1,1, 0,66, 0,22 și, respectiv, 0 mmol l-1 pentru curbele A-D. Se remarcă faptul că starea de echilibru atinsă a fost independentă de concentrația inițială de ATP extramitochondrială. Retipărit cu permisiunea lui BeltrandelRio andWilson (1992b).
Deși producția de ATP a început aproape imediat după inițierea fosforilării oxidative prin adăugarea de ADP, a existat un decalaj pronunțat în inițierea fosforilării Glc de către hexokinaza legată de mitocondriu (Fig. 3D) înainte de atingerea unei rate de echilibru care a persistat pentru o perioadă îndelungată. Această perioadă inițială de decalaj a fost interpretată ca fiind timpul necesar pentru a umple un compartiment intramitocondrial cu ATP generat de fosforilarea oxidativă și din care hexokinaza legată la nivelul mitocondriilor și-a extras substratul ATP. Inhibarea transportului de electroni prin adăugarea de KCN a dus la eliberarea aparentă de ATP, probabil din compartimentul intramitocondrial, iar proprietățile acestui „compartiment” (cinetica umplerii, legătura cu producția intramitocondrială de ATP etc.) au fost analizate.) au fost în acord satisfăcător cu așteptările bazate pe această interpretare (BeltrandelRio și Wilson,1991,1992a,b).Din păcate, acordul cu așteptările nu este un ghid infailibil pentru adevăr, iar „eliberarea aparentă de ATP” s-a dovedit ulterior a fi un artefact (Laterveer și colab.,1993).), a cărui sursă nu este încă înțeleasă și care nu a putut fi reprodusă în lucrările ulterioare (deCerqueira Cesar și Wilson, 1998). În ciuda acestui eșec descurajant și jenant, conceptul de bază al cuplării hexokinazei legate mitocondrial la un compartiment intramitocondrial de ATP a fost susținut de alte dovezi și a rezistat testelor experimentale ulterioare.
A fost dezvoltată o metodă de etichetare izotopică dublă ca alternativă la procedurile spectrofotometrice (deCerqueira Cesar și Wilson, 1995). Glc marcat cu 14C a fost utilizat ca substrat pentru hexokinază, iar 32Pi a furnizat un substrat pentru sinteza ATP prin fosforilare oxidativă. Raportul32P/14C în Glc-6-P a furnizat astfel o măsură a activității specifice a substratului ATP utilizat de hexokinază. Raportul32P/14C din Glc-6-P produs de hexokinaza legată de mitocondrii a fost comparat cu cel produs de hexokinaza de drojdie, care nu se leagă de mitocondrii și, prin urmare, utilizează în mod necesar ATP extramitocondrial ca substrat. Cinetica de etichetare a bazinelor de ATP utilizate ca substrat de către hexokinaza legată la mitocondriile și de către hexokinaza de drojdie a fost surprinzător de diferită, ceea ce este din nou în concordanță cu ideea că hexokinaza legată la mitocondriile nu utilizează ATP extramitocondrial ca substrat, ci, mai degrabă, se bazează pe un compartiment intramitocondrial de ATP furnizat de fosforilarea oxidativă.De exemplu (figura 4), adăugarea unui exces de 31Pi, scăzând astfel în mod semnificativ activitatea specifică a 32P-ATP sintetizat prin fosforilare oxidativă, a dus la o scădere rapidă a raportului 32P/14C de Glc-6-P produs de hexokinaza de drojdie, folosind ATP extramitocondrial. În schimb, a existat un decalaj și, ulterior, o scădere ceva mai lentă a raportului 32P/14C al Glc-6-P produs de hexokinaza legată de mitocondriu. Aceste din urmă observații au fost, din nou, în concordanță cu ideea că hexokinaza mitocondrială folosea un compartiment intramitocondrial de ATP care nu era liber echilibrat cu ATP extramitocondrial.
Efectul adăugării excesului de Pi nemarcat asupra raportului32P/14C al glucozei-6-fosfat (Glc-6-P) format de hexokinaza legată la mitocondrială sau de hexokinaza de drojdie legată nemitocondrial.Fosforilarea oxidativă a fost inițiată cu 32Piprezent ca substrat pentru fosforilarea oxidativă, iar Glc asubstrat pentru hexokinază. La 3 minute, s-a adăugat un exces de 31Pi, reducând activitatea specifică a ATP produsă ulterior prin fosforilare oxidativă. Acest lucru a dus la o scădere precipitată a raportului32P/14C al Glc-6-P format de hexokinaza de drojdie (pătrate) folosind ATP extramitochondrial ca substrat, dar o scădere mult mai lentă a raportului 32P/14C al Glc-6-P produs de hexokinaza legată la mitocondriu (cercuri deschise). Cercuri umplute, Glc-6-P total produs de hexokinaza legată mitocondrial. Retipărit cu permisiunea lui de Cerqueira Cesar și Wilson(1995).
Încă o altă abordare experimentală s-a bazat pe o comparație între hexokinaza legată mitocondrial și enzima de drojdie nelegată (de CerqueiraCesar și Wilson, 1998,2002). Logica de bază este ilustrată în Fig. 5. O cantitate fixă de mitocondrii de creier, cu hexokinază legată, este amestecată cu cantități din ce în ce mai mari de mitocondrii de ficat de șobolan, care nu conțin hexokinază legată. Atât mitocondriile din creier, cât și cele din ficat se fosforilează în mod activ și, prin urmare, există o rată crescătoare de producție de ATP în sistem pe măsură ce crește cantitatea de mitocondrii hepatice. Prin proiectare, concentrația de ATP extramitocondrial este menținută subsaturată, adică ÅKm de hexokinază cu ATP extramitocondrial ca substrat (în absența fosforilării oxidative). În cazul în care hexokinaza legată la mitocondrie utilizează ATP extramitocondrial ca substrat, se așteaptă o creștere progresivă a ratei de fosforilare a Glc pe măsură ce rata de producere a ATP crește prin adăugarea unor cantități din ce în ce mai mari de mitocondrii hepatice. De fapt, acest lucru nu este ceea ce se observă; mai degrabă, rata de fosforilare a Glc de către hexokinaza legată la nivelul mitocondriilor nu este afectată în mod semnificativ de creșterea ratei de producție de ATP (figura 6). În schimb, creșterea așteptată a ratei de fosforilare a Glc este observată dacă hexokinaza mitocondrială este înlocuită cu o cantitate echivalentă de hexokinază de drojdie. Astfel, aceste rezultate sunt din nou în concordanță cu opinia conform căreia hexokinaza legată mitocondrial utilizează ATP intramitocondrial, intrinsec mitocondriilor cu care este asociată hexokinaza, dar independent de orice creștere a ATP extramitocondrial care provine de la mitocondriile hepatice fără hexokinază.
Reprezentarea schematică a strategiei experimentale pentru compararea utilizării ATP extramitocondrial de către hexokinaza legată de mitocondrii sau de hexokinaza de drojdie nelegată de mitocondrii. (A) Hexokinaza legată mitocondrial (HK) este reprezentată în centrul panoului, cu mitocondrii suplimentare, care conțin puțin sau deloc hexokinază legată, reprezentate în regiunile mai periferice. pentru aceasta din urmă, în experimentele anterioare au fost utilizate mitocondrii din creierul de șobolan care au fost epuizate de hexokinază prin tratarea cu glucoză-6-fosfat, care determină eliberarea hexokinazei legate mitocondrial. Cu toate acestea, în ultimele experimente s-au folosit mitocondrii de ficat de șobolan care, așa cum sunt izolate, nu conțin hexokinază legată. ATP extramitocondrial este distribuit în tot spațiul extramitocondrial. (B) Situație analogă, dar cu o cantitate echivalentă de hexokinază de drojdie (YHK) nelegată la mitocondrială în locul hexokinazei legate la mitocondrială. Strategia de bază este de a determina rata de fosforilare a glucozei de către o cantitate fixă de hexokinază legată sau nelegată, în timp ce rata de producere a ATP extramitocondrial este crescută prin adăugarea unui număr din ce în ce mai mare de mitocondrii lipsite de hexokinază legată. Retipărit cu permisiunea lui de Cerqueira Cesar și Wilson(2002).
Rata de fosforilare a glucozei (Glc) de către hexokinaza legată și nelegată la mitocondriile mitocondriale, cu rate crescânde de producere a ATP din fosforilarea oxidativă. Rata de fosforilare a Glc (v̇) este exprimată în raport cu rata maximă de fosforilare (V̇), aceasta din urmă fiind determinată cu niveluri saturate de ATP exogen în absența fosforilării oxidative. Rata de producere a Glc-6-P de către hexokinaza de drojdie legată nemijlocit (cercuri) este strâns corelată cu rata de producere a ATP. În schimb, rata de fosforilare a Glc de către hexokinaza legată mitocondrial (pătrate) este insensibilă la creșterea nivelurilor de ATP extramitocondrial produs de mitocondriile care nu poartă hexokinaza, ceea ce este în concordanță cu ideea că enzima legată mitocondrial se limitează la ATP intramitocondrial, produs de mitocondriile la care este legată enzima, ca substrat. Retipărit cu permisiunea lui de Cerqueira Cesar și Wilson (1998).
În cele din urmă, dovezi suplimentare în favoarea opiniei conform căreia hexokinaza legată mitocondrial poate discrimina între ATP intra- și extramitocondrial provin din examinarea inhibiției prin analogul Glc-6-P, 1,5-anhidroglucitol-6-P (1,5-AnG6P). În absența fosforilării oxidative și cu ATP extramitocondrial ca substrat, 1,5-AnG6P este un inhibitor destul de puternic, competitiv față de ATP (Fig.7) (Hashimoto și Wilson,2000). În schimb, cu ATP furnizat prin fosforilare oxidativă, 1,5-AnG6P este mult mai puțin eficient ca inhibitor. În mod clar, ATP furnizat prin fosforilare oxidativă nu este echivalent cu ATP extramitochondrial. Rezultate similare au fost raportate recent folosind hexokinaza mitocondrială din creierul bovin (de Cerqueira și Wilson,2002).
Inhibarea hexokinazei legate de mitocondrială de către analogul glucozei-6-fosfat, 1,5-anhidroglucitol-6-P (1,5-AnG6P), cu asubstrat ATP generat intramitocondrial (cercuri deschise) sau extramitocondrial (cercuri umplute). Retipărit cu permisiunea lui Hashimoto și Wilson(2000).
În concluzie, opinia actuală este că, în absența fosforilării oxidative, hexokinaza mitocondrială poate utiliza cu ușurință ATP extramitocondrial, urmând cinetica clasică Michaelis-Menten. Cu toate acestea, în timpul fosforilării oxidative active, enzima legată la nivelul mitocondriilor este cuplată la o rezervă intramitocondrială de ATP, rata de fosforilare cu Glc fiind strâns corelată cu rata fosforilării oxidative.Pare greu de crezut că, în țesuturile normale, mitocondriile se află vreodată într-o stare de nefosforilare totală. Modificări ale ratei? Da, bineînțeles, în funcție de fluctuațiile cererii de energie. Dar cu adevărat nefosforilantă?Probabil doar în cele mai grave – și în cele din urmă letale – circumstanțe. Prin urmare, rezultă că, în condiții normale, rata de fosforilare a Glc este strâns coordonată cu etapele oxidative terminale ale metabolismului Glc care au loc în mitocondrii, cu producerea asociată de ATP prin fosforilare oxidativă. După cum s-a menționat anterior (BeltrandelRio și Wilson, 1992a), o astfel de coordonare poate asigura introducerea Glc în metabolismul glicolitic la o rată proporțională cu etapele oxidative terminale, evitând producerea de lactat neurotoxic (Marie și Bralet, 1991), asigurând în același timp un flux net prin porțiunile citoplasmatice și mitocondriale ale căii la o rată adecvată pentru a satisface cerințele energetice (Fig. 8).
Coordonarea fazelor glicolitice și oxidative ale metabolismului glucozei (Glc). Rata de fosforilare a Glc de către hexokinaza legată de mitocondriu, folosind ca substrat ATP generat intramitocondrial, este corelată cu rata de fosforilare oxidativă. Se sugerează că acest mecanism asigură coordonarea fosforilării Glc, etapa inițială a metabolismului glicolitic, cu etapele terminale de oxidare (ciclul acidului tricarboxilic, cu transportul de electroni și fosforilarea oxidativă asociate; săgeți îngroșate) care au loc în mitocondrii, evitând acumularea de lactat potențial toxic.
Nu se cunoaște modul în care această schimbare remarcabilă a specificității substratului (ATP intramitocondrial față de ATP extramitocondrial) este indusă de fosforilarea oxidativă, dar este clar că conformația enzimei legate de mitocondrie este afectată de potențialul membranei mitocondriale, precum și de alți factori legați de funcția mitocondrială, indicând o interacțiune intimă între membrana internă (prin care există potențialul membranar) și cea externă (la care este legată hexokinaza) a acestui organit (Hashimoto și Wilson, 2000).Modificările conformaționale care afectează regiunile moleculei implicate în legarea substratului ATP au fost anterior postulate (de Cerquiera și Wilson, 1998) ca fiind responsabile pentru modificările în specificitatea substratului.
.