Genomică comparativă

În primul rând, am comparat cele 61 de izolate uruguayene folosind analiza SNP cu genomul P125109 ca referință. Această analiză a arătat că cele mai vechi două izolate au peste 600 de SNP de diferență față de genomul de referință (607 și 652 pentru 31/88 și, respectiv, 08/89), în timp ce toate celelalte 59 de izolate au mai puțin de două sute de SNP (de la 60 la 166) (tabelul suplimentar 1). Pe de altă parte, toate genomurile uruguayene au în comun 17 SNP de diferență cu genomul P125109.

O analiză filogenetică bazată pe SNP-uri a evidențiat existența a două clade pe care le-am numit E1 și E2 (Fig. 1(b)) care cuprind 57 din cele 61 de tulpini. Aceste 57 de tulpini aparțin tipului major de secvență MLST S. enterica serovar Enteritidis de tip 11 (ST-11) și au co-circulat în țară din 1994. Cele patru izolate rămase (31/88, 8/89, 77/02 și 89/02) nu s-au grupat cu niciuna dintre cele două clade [Fig. 1(b)]. Am raportat anterior că cele mai vechi două izolate (31/88 și 8/89) aparțin tipului de secvență MLST 1974 (ST1974) și că ST1974 a provenit din ST11 după dobândirea unui profagiu caracteristic8. Celelalte două izolate, 77/02 și 89/02, aparțin ST11 ca și majoritatea tulpinilor.

Clada E1 cuprinde 21 de tulpini care acoperă toate cele cinci perioade epidemiologice și au fost izolate din alimente, animale sau infecții umane. În schimb, clada E2 este reprezentată de 36 de izolate, dintre care 34 au fost izolate în perioadele asociate cu epidemiile (Fig. 1(a,b)). Prin urmare, este rezonabil să se formuleze ipoteza că E2 poate constitui un neam care a fost responsabil pentru epidemiile de S. enterica serovar Enteritidis din țară.

Am raportat anterior o analiză filogenetică a 203 tulpini, reprezentând diversitatea intra-serovar în rândul izolatelor de S. enterica serovar Enteritidis EBG4 din întreaga lume, care a inclus 6 dintre cele 61 de izolate uruguayene utilizate în studiul de față8. După cum am constatat acum, jumătate din aceste 6 tulpini sunt E1 și jumătate sunt E2 (E1: 53/94, 206/99 și 214/02; E2: 8/02, 251/01 și 253/01), iar fiecare dintre aceste două grupuri este strâns înrudit cu tulpinile din Europa și America de Nord. Această relație este prezentată în figura suplimentară S1, care conține filogenia raportată anterior, cu un zoom asupra cladei formate de aceste tulpini. Acest lucru sugerează că E1 și E2 ar putea avea un model de circulație largă.

Pentru a susține și mai mult această ipoteză, am efectuat o nouă analiză filogenetică, de data aceasta cu accent pe tulpinile izolate în regiune, inclusiv 12 din Argentina, 122 din Brazilia și aceleași 61 de genomuri din Uruguay [Fig. 2(a)]. În mod interesant, am constatat că toate aceste tulpini s-au grupat într-un mod foarte asemănător cu ceea ce am găsit în rândul izolatelor uruguayene, și anume, clusterul E1 conține acum tulpini din Argentina și Brazilia, în timp ce clusterul E2 conține tulpini din Brazilia (103 în E1 și 62 în E2). Având în vedere numărul redus de genomuri din Argentina disponibile în EnteroBase, nu putem exclude posibilitatea ca linia E2 să fi circulat în această țară. Doar 30 de tulpini din toate cele trei țări s-au grupat în afara E1 și E2, dintre care 24 au fost izolate înainte de 1994 (Fig. 2(a), tabelul suplimentar 2). În ansamblu, rezultatele noastre sugerează cu tărie că tulpinile E1 și E2 au fost introduse în regiune în jurul anului 1994 și au circulat de atunci în Uruguay, Brazilia, Argentina, Europa și America de Nord, susținând ideea că ambele constituie linii genetice ale serovarului Enteritidis.

(a) Arbore filogenetic al celor 195 de genomuri, inclusiv 61 din Uruguay (frunze albe), 12 din Argentina (frunze albastru deschis) și 122 din Brazilia (frunze galbene). Ramurile liniei E1 sunt colorate în albastru. Ramurile neamului E2 sunt indicate cu roșu. Rândurile din dreapta reprezintă cu culori diferite variantele alelice pentru ycdX, pduD, hsdM, ybiO, yiaN, aas și, respectiv, aceA. A se vedea legendele culorilor în interiorul (b). Unitățile de bară de scară reprezintă modificările per situs de variantă. (b) Alinierea genelor pentru diferitele variante alelice pentru ycdX, pduD, hsdM, ybiO, yiaN, aas și, respectiv, aceA. Genele sunt reprezentate așa cum sunt adnotate în genomul care conține fiecare variantă și aliniate la referința P125109. Scara de aliniere în perechi de baze (bp) este indicată prin bare orizontale. SNP-urile asociate fiecărei variante în raport cu genomul de referință sunt detaliate în tabelul 1. SNP-urile care cauzează variante nesinonime sunt marcate ca X → Y (în codul de aminoacizi cu o singură literă) în raport cu poziția sa în genă. SNP-urile sinonime sunt marcate doar în raport cu poziția sa în genă (syn SNP).

Apoi am efectuat o analiză genomică comparativă menită să identifice diferențele genetice asociate cu liniile E1 și E2, incluzând 165 de genomuri: 57 din Uruguay, 11 din Argentina și 97 din Brazilia (Fig. 2(a)).

Variante alelice între liniile E1 și E2

Dacă nu am găsit diferențe în genomul accesoriu între liniile E1 și E2, am căutat diferențe SNP între cele 165 de tulpini selectate. Această analiză a arătat că principalele diferențe între E1 și E2 sunt localizate în trei gene: ycdX, pduD și hsdM. Aceste gene sunt întrerupte în genomurile E1 în comparație cu omologii lor din genomurile E2. În plus, am găsit variante alelice în alte patru gene, ybiO, yiaN, aas și aceA, care sunt specifice pentru fiecare linie genetică (Fig. 2(a,b); Tabelul 1).

Toate cele 103 tulpini E1 (11 din Argentina, 71 din Brazilia și 21 din Uruguay) prezintă o inserție de 4 perechi de baze localizată în gena ycdX (SEN1912) în comparație cu cea de referință și cu toate tulpinile E2 (tabelul 1). Această inserție introduce un codon de oprire prematură, care poate produce o pseudogena sau o versiune trunchiată a proteinei [Fig. 2(b) și tabelul 1]. Gena ycdX codifică o hidrolază care aparține superfamiliei de proteine PHP, care conțin un domeniu NH2-terminal php (polimerază histidinol fosfatază). Acest domeniu este caracteristic subunității alfa a ADN polimerazei III din bacterii și este implicat în funcția de proofreading22. S-a sugerat că YcdX este implicat în căile de reparare a ADN-ului în E. coli și ar putea acționa ca o nuclează sau o fosfatază în aceste căi23. Recent, Wang et al. au descoperit două variante alelice pentru această genă (SNP nesinonimic) între izolatele de S. enterica serovar Enteritidis cu capacități foarte diferite de supraviețuire în albușul de ou24. Inoue et al. au arătat că mutația în ycdY (gena adiacentă în operonul ycdWXYZ) a cauzat reprimarea roiului la E. coli25.

Toate tulpinile din stirpea E2 au aceeași variantă alelică pentru gena pduD (SEN2039), în timp ce 102 din cele 103 tulpini din stirpea E1 prezintă o substituție de baze care introduce un codon de oprire, similară celei observate pentru ycdX (tabelul 1). Tulpina rămasă (și anume 11/07 din Uruguay) este complet lipsită de gena pduD (Fig. 2(b) și tabelul 1). pduD codifică pentru o propandiol dehidratăză, parte a operonului pdu care codifică toate proteinele necesare pentru catabolismul 1,2-propandiolului. Acest operon, care a fost dobândit prin transfer lateral de gene la Salmonella26,27 , este perturbat la diferite serovarii care provoacă infecții extraintestinale invazive la om, cum ar fi Typhi și Paratyphi A, printre altele28. Faber et al. au raportat că funcționalitatea acestui operon poate fi importantă pentru a concura cu microbiota intestinală, deoarece 1,2-propandiolul este un produs metabolic în mediul intestinal anaerob care poate fi utilizat de Salmonella atunci când este cuplat la respirația anaerobă a tetrationatului29. Se propune ca abilitatea de a utiliza 1,2 propandiolul să permită extinderea populației de agenți patogeni în intestin, crescând excreția în fecale, ceea ce reprezintă un factor important pentru diseminarea epidemiei29.

În plus, toate tulpinile E2 au aceeași variantă alelică pentru gena hsdM (SEN4290), dar în rândul tulpinilor E1 există mai multe variante pentru această genă (Fig. 2(b) și tabelul 1). Majoritatea tulpinilor E1 conțin variante ale hsdM care ar produce fie o versiune trunchiată (4 din cele 6 variante), fie o substituție nesinonimă pentru proteină. Doar trei tulpini din E1 (inclusiv tulpina uruguayană 44/07) au aceeași variantă ca E2, ceea ce sugerează că doar în tulpinile E1 hsdM este predispusă la acumularea de mutații (Fig. 2(b)). Gena hsdM codifică o ADN-metază implicată în sistemul de restricție-modificare de tip I (RM) la enterobacterii30,31. Rapoarte anterioare au asociat sistemele de modificare a restricției de tip 2 cu patogenitatea la Salmonella datorită efectelor epigenetice asupra expresiei genelor de virulență32. Silva et al. au arătat că mutațiile în genele RM produc un fenotip deteriorat în modelul de șoarece al salmonelozei invazive33. Sistemele RM de tip 1 au fost, de asemenea, descrise ca fiind implicate în patogenitatea Yersinia pseudotuberculosis34.

Din moment ce E2, dar nu și E1, au copii intacte ale ycdX, pduD și hsdM, și având în vedere că aceste gene au fost implicate anterior în patogenitatea Salmonella, se poate considera că aceste trei gene pot fi relevante pentru capacitatea epidemică a tulpinilor E2. Am căutat, de asemenea, variantele alelice în filogenia globală care reprezintă diversitatea intra-serovar (Fig. suplimentară 1 și ref. 8) și am constatat că alela predominantă este alela E2 în toate cazurile, în timp ce variantele perturbate sunt specifice pentru E1 (datele nu sunt prezentate).

După cum s-a menționat mai sus, alte patru gene ybiO, yiaN, aas și aceA au fost găsite cu diferențe minore de secvență între ambele linii genetice. Aceste patru gene prezintă o singură variantă în tulpinile E2, în timp ce E1 sunt în mare parte identice cu tulpina de referință P125109.

Toate tulpinile E2 prezintă o anumită variantă alelică a genei ybiO (SEN0772) datorită unei substituții care produce o Gly(601)→Arg în proteină (Fig. 2(a,b), Tabelul 1). Gena ybiO codifică pentru o presupusă proteină canal mecanosensibilă implicată în adaptarea osmotică, care este activată de șocul hipo-osmotic la E. coli35. S-a raportat anterior că există două variante alelice pentru această genă în rândul izolatelor de S. enterica serovar Enteritidis care au o capacitate diferită de supraviețuire în albușul de ou24. Pentru yiaN (SEN3494) (subunitatea mare de permează a transportatorului de L-dehidroascorbat, o proteină membranară putativă), toate genomurile E2 prezintă aceeași alelă care diferă în Gly(163)→Ala față de E1. În mod similar, toate E2 prezintă aceeași variantă pentru genele aas (2-acilglicerofosfoetanolamină aciltransferază/acil-ACP sintetază, SEN2853) și aceA (izocitrat liază, SEN3966). În E1, majoritatea tulpinilor au o genă aas identică cu cea de referință, iar câteva tulpini prezintă fie o substituție nesinonimă (5 tulpini), fie o substituție sinonimă (1 tulpină) [Fig. 2(a), tabelul 1]. În mod similar, gena aceA este identică cu cea de referință în toate genomurile E1, cu excepția unuia dintre ele.

În concluzie, am constatat că alelele E2 pentru ybiO, yiaN, aas și aceA sunt specifice pentru această linie genetică.

.