Direcționarea genei în celulele stem embrionare

Prin intermediul procesului de direcționare genetică în celulele ES, orice manipulare genetică dorită poate fi introdusă în linia germinală a șoarecilor. Secvențe genetice specifice pot fi eliminate fie constitutiv, fie condiționat (Knock-out), mutații specifice sau modificări ale perechilor de baze pot fi efectuate cu precizie în cadrul unei gene de interes și gene reporter sau alte casete de expresie pot fi introduse în locații definite în cadrul genomului (Knock-in). Secvențele murine pot fi schimbate cu secvențe umane folosind această tehnologie pentru a genera modele de șoareci umanizați.

Această tehnică poate dura până la un an de timp de dezvoltare, astfel încât este esențial să se investească un timp considerabil la începutul proiectului pentru a se asigura că se selectează cea mai potrivită tehnologie și strategie genetică pentru modelul necesar. Nucleul transgenic poate oferi consultanță pentru aceste tipuri de decizii și este esențial ca toate proiectele de direcționare să fie discutate în detaliu cu nucleul înainte de a începe activitatea în laborator.

După ce s-a decis asupra unei strategii, se construiește un vector de direcționare și se concepe și se testează o strategie de screening robustă pentru a se asigura că manipularea genomică necesară poate fi detectată la nivel genomic. Vectorul de direcționare este apoi transfectat în celule ES, iar clonele recombinante sunt examinate pentru evenimentul de recombinare omoloagă dorit. Aceste celule sunt apoi injectate în embrioni preimplantați, iar șoarecii chimeri rezultați sunt utilizați pentru reproducerea liniei de șoareci modificate genetic.

Serviciu

Se oferă un serviciu flexibil care poate fi defalcat în etapele specifice de dezvoltare a modelului, în funcție de resursele disponibile.

Inițierea proiectului – gratuit

• Consultanță cu grupul pentru a aborda o tehnologie adecvată pentru a obține un model sigur și utilizabil
• Cercetarea băncilor de date de capcane genetice pentru clonele preexistente de celule ES
• Cercetarea resurselor consorțiului Knock-out pentru vectorii de direcționare preexistenți, clone și modele de celule ES

Consultanță pentru construcția de vectori de direcționare – gratuit

• Analiză a secvenței genomice pentru a identifica regiunile care au o probabilitate ridicată de a fi regiuni de homologie utilizabile pentru direcționarea genelor
• Consultanță cu grupul pentru a aborda strategia genetică necesară pentru a obține un vector de direcționare sigur, model utilizabil
• Construcția vectorului de direcționare nu este asigurată de către nucleu, dar nucleul poate ajuta la furnizarea de casete și consiliere metodologică
• Elaborarea strategiei de screening nu este asigurată de către nucleu, dar nucleul poate ajuta la furnizarea de casete și consiliere metodologică consiliere

Gene Targeting in Embryonic Stem cells

• Transfecția vectorului de direcționare completat în celule stem embrionare
• Isolarea și stocarea a cel puțin 192 de clone de celule recombinate independente
• Prepararea ADN-ului și livrarea de plăci cu 96 de godeuri pentru screening
• Decongelare, expansiune a clonelor pozitive putative
• Preparare suplimentară de ADN de la clonele pozitive putative pentru confirmarea screening-ului
• Analiză cariotipică a clonelor vizate

Injectarea în blastocist a clonelor de celule ES

• Injectarea de celule ES în embrioni preimplantați
• Generarea și adăpostirea de chimere timp de până la 3 săptămâni.
• Recomandări pentru strategia de reproducere

.