Materiale și metode

Colectarea probelor

Participanții cu vârsta de 18 ani și peste au fost invitați să se alăture studiului prin notificări prin e-mail și anunțuri plasate pe panourile de afișaj de la Universitatea din British Columbia, Vancouver BC. Participanților li s-a cerut să furnizeze probe folosind tampoane bucale cu blocaj uscat (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) și tampoane bucale cu vârf de burete (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON), folosind instrucțiuni autoghidate; ordinea în care au fost oferite aceste probe a fost randomizată prin calculator. Un asistent de cercetare a fost prezent în timpul recoltării probelor pentru a răspunde la întrebările pe care participanții le aveau cu privire la instrucțiunile de recoltare a probelor. Toate probele au fost păstrate la temperatura camerei. Rapoartele farmacogenetice nu au fost date participanților, deoarece acest lucru nu a făcut parte din domeniul de aplicare al acestui studiu.

Extragerea ADN-ului

Ana a fost extrasă cu ajutorul kitului de extracție a ADN-ului pe bază de perle Ambion MagMAX (Applied Biosystems, Foster City, CA) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. ADN-ul a fost extras la 3 zile după colectarea probei și a fost eluat în 60 µl. Cantitatea și calitatea ADN au fost evaluate cu ajutorul testului de fluorescență Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Puritatea probelor a fost determinată prin valorile densității optice A260/280 (ODA260/280) cu ajutorul spectrofotometrului NanoVue.

Genotiparea

Genotiparea a fost realizată pe instrumentul de reacție cantitativă în lanț a polimerazei (qPCR) QuantStudio 12K Flex (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) pe teste validate de producător (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Conținutul testelor a inclus 28 de SNP care influențează răspunsul la medicamente pe platforma OpenArray (a se vedea fișierul suplimentar 2) și un test TaqMan CYP2D6 CNV (ID test: Hs_000100010001_cn). Pentru a valida testele, au fost genotipate 44 de controale ADN de la National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Human Genetic Cell Repository de la Coriell Institute for Medical Research. Concordanța apelurilor a fost confirmată cu genotipul așteptat. În plus, secvențierea Sanger a ADN-ului de control a verificat rezultatele. Pentru fiecare analiză, probele participanților au fost analizate în dublu exemplar pe OpenArray și în cvadruplu exemplar pe testul CNV, împreună cu probele de ADN Corriell utilizate ca și controale pozitive și controale fără șablon (NTC).

Analiză statistică

S-a utilizat software-ul TaqMan Genotyper v1.3.1 (Applied Biosystems) pentru a determina ratele de apelare a genotipării SNP pe OpenArray. Rata de apelare a genotipurilor a fost calculată pentru fiecare test OpenArray, împărțind numărul total de genotipuri atribuite cu succes la numărul total de încercări de atribuire a genotipurilor.

Pentru testul CNV TaqMan, software-ul CopyCaller v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) a fost utilizat pentru a atribui apelurile numărului de copii CYP2D6 și scorurile de încredere CNV. Eșantioanelor de ADN li s-a atribuit un număr de copii diploide de tip sălbatic, iar variațiile numărului de copii (evenimente de deleție sau duplicare) au fost grupate în grupurile 2N și, respectiv, CNV. O rată de apelare a genotipării de 95% și un scor de încredere de 95% au fost stabilite pentru rezultatele genotipării SNP și, respectiv, CNV. S-a calculat un test t al lui Student cu două eșantioane, presupunând varianțe inegale, pentru a determina diferența semnificativă între randamentul ADN, puritatea și ratele de apelare din diferitele tipuri de ADN în perechi. Atribuțiile de genotipare generate de tipul de probă de ADN (cu vârf de burete vs. cu blocare uscată) de la același participant au fost comparate pentru a calcula concordanța.

Rezultate

Au fost recrutați 31 de participanți și au fost colectate tampoane cu vârf de burete și tampoane cu blocare uscată. Participanții au considerat că instrucțiunile autoghidate pentru colectare sunt simple și ușor de urmat pentru ambele tipuri de tampoane. Participanții au ridicat întrebări cu privire la presiunea necesară pentru frecarea tampoanelor și la plasarea corectă a tampoanelor în gură. Comentariile participanților cu privire la cele două tampoane au fost similare, unii preferând tampoanele cu vârf de burete, iar alții preferând tampoanele cu blocaj uscat; nu a existat un consens de opinie.

A existat o diferență semnificativă în ceea ce privește randamentul mediu de ADN între ADN-ul colectat cu ajutorul tampoanelor cu blocaj uscat față de tampoanele cu vârf de burete (0,26 ± 0,34 µg vs. 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; tabelul 1). Puritatea medie a ADN-ului în toate tipurile de colectare a fost în intervalul acceptat pentru ADN pur (medie (SD)) 1,72(0,78) și 1,85(0,39) pentru tampoane uscate și, respectiv, tampoane cu vârf de burete.

Au existat trei probe colectate din tampoane cu vârf de burete care au avut concentrații scăzute de ADN (< 5 ng/µl). Aceste trei probe au avut rate de apelare a genotipării de 100 % pe OpenArray și scoruri de încredere CNV de 100 % (Fig. 1). În schimb, una dintre probele care a avut o concentrație de ADN de 79 ng/µl a avut cea mai mică rată de apelare OpenArray (18 %). Cele mai mari rate de apelare pe OpenArray (> 95 %) pentru tampoanele cu blocaj uscat au fost observate pentru șapte probe cu o concentrație cuprinsă între 1,2 și 8,9 ng/µl (Fig. 1a). Cele mai mari apeluri de încredere CNV (> 95 %) au fost observate pentru eșantioane cu o concentrație cuprinsă între 1,0 și 24,4 ng/µl (Fig. 1b).

Pentru toate testele de pe OpenArray, probele de ADN colectate din tampoane cu vârf de burete au dus la rate de apelare a genotipării în general mai mari (97 %) în comparație cu tampoanele cu blocaj uscat (54 %) (Fig. 2). Cu o etapă suplimentară de diluție de 0,5 × a ADN-ului extras, tampoanele cu vârf de burete au avut o rată de apel de genotipare constantă > 95 %. Rata de apelare a eșantioanelor pe OpenArray a variat în funcție de individ, 29 (93,5 %) de participanți având rate de apelare a eșantioanelor > 95 % din ADN de pe tampoanele cu vârf de burete și 4 (12,9 %) având rate de apelare a eșantioanelor > 95 % din ADN de pe tampoanele cu blocaj uscat. A fost observată o concordanță de 94% a testelor genotipate cu succes între tampoanele cu vârf de burete și tampoanele cu blocaj uscat colectate de la același individ.

Apeluri de număr de copie pentru CYP2D6 au fost atribuite la 2 (6,5 %) dintre probele provenite din tampoane cu vârf de burete, cu un scor de încredere global de 0,99. În comparație, la 8(25,8%) dintre probele provenite din tampoane cu tampon uscat au fost atribuite apeluri ale numărului de copii cu un scor general de încredere de 0,91 (a se vedea fișierul suplimentar 3).

Discuție

Scopul acestei cercetări este de a ajuta investigatorii, și companiile, să identifice o metodă optimă de colectare care să producă ADN de înaltă calitate pentru genotipare. Acest studiu oferă noi informații cu privire la calitatea ADN pentru două tipuri de tampoane, care a fost ridicată (definită ca ODA260/A280 1,8), deși a existat o diferență semnificativă în ceea ce privește randamentul ADN (valoare p = 4,4-7). Pe platforma OpenArray, tampoanele cu vârf de burete au avut cea mai mare rată globală de apelare a genotipării (97 % vs. 54 %) și cel mai mare scor de încredere pentru CYP2D6 CNV TaqMan Assay (0,99 vs. 0,91). Se consideră că o rată de apelare a genotipării SNP de > 95% reflectă o calitate acceptabilă a datelor, iar un scor de încredere CNV de 99% este considerat de înaltă calitate.

O singură probă de ADN izolată din tamponul cu vârf de burete a avut o rată de apelare sub 95%. În practica de rutină a laboratorului, eșantioanele cu rate de apel scăzute ar fi fost recoltate din cauza rezultatelor incomplete pentru rapoartele pacienților. Omiterea acestui eșantion a crescut rata generală de apelare a genotipării la 99,5 % pentru tampoanele cu vârf de burete.

Rezultatele CNVCYP2D6 au arătat o creștere a asignărilor CNV pentru ADN-ul colectat din tampoanele cu blocaj uscat 8(25,8 %) în comparație cu tampoanele cu vârf de burete 2(6,5 %). Numărul mai mare de atribuiri CNV s-a corelat cu scoruri de încredere mai mici. Majoritatea participanților 30(97%) au reușit să colecteze eșantioane care au dus la rate ridicate de apelare a genotipării pentru tampoanele cu vârf de burete, în timp ce doar câteva persoane 4(13%) au reușit să colecteze eșantioane cu rate ridicate de apelare pentru ambele tipuri de tampoane. În concluzie, tampoanele cu vârf de burete au fost acceptabile pentru pacienți și au furnizat ADN de bună calitate cu randament suficient pentru testele farmacogenetice bazate pe qPCR.

.