Cromozomii sexuali ai mamiferelor au roluri specializate în dezvoltarea celulelor germinale masculine (XY) și feminine (XX) (1). Anomaliile cromozomilor sexuali sunt cea mai frecventă cauză genetică a infertilității umane (2). În trisomiile cromozomilor sexuali (TCS), sindromul Klinefelter (XXY) și sindromul dublu Y (XYY), spermatogeneza este perturbată de excesul de gene X și, respectiv, Y (2). Bărbații XYY sunt de obicei fertili datorită pierderii spontane a cromozomului sexual suplimentar (mozaicism). La bărbații XXY, mozaicismul este mai puțin frecvent. Prelevarea testiculară de spermă a permis reproducerea la unii bărbați Klinefelter tineri, dar are mai puțin succes la pacienții mai în vârstă (3, 4). Indivizii XXY și XYY fără celule germinale XY sunt infertili.

Pentru a studia infertilitatea SCT, am generat șoareci adulți XXY și XYY purtători ai transgenei reporter fluorescente Blimp1-mVenus (BV) și Stella-ECFP (SC) (5) pentru a monitoriza diferențierea celulelor stem pluripotente în celule germinale primordiale asemănătoare celulelor germinale (PGCLCs) (6). Masculii XXY au fost creați prin împerecherea unei femele de tip sălbatic cu un mascul cu o variantă de cromozom sexual care produce spermatozoizi care conțin XY (fig. S1). Generarea șoarecilor XYY necesită moștenirea unui cromozom Y de la ambii părinți. Prin urmare, am utilizat un cromozom Y de tip sălbatic moștenit paternal și un cromozom Yd1 moștenit matern care nu exprimă Sry, care determină testiculul (fig. S1) (7). După cum s-a arătat anterior (8, 9), fenotipul spermatogenezei în ambele modele l-a recapitulat pe cel al bărbaților SCT, cu oprire în stadiul prospermatogonial la șoarecii XXY și la pachynema la șoarecii XYY (fig. S2). Spermatogeneza a fost normală la frații transgenici euploizi XY BVSC.

În continuare, am stabilit fibroblaste de la șoareci SCT și șoareci XY și XX de control (fig. 1A). Hibridizarea ADN-fluorescență in situ (DNA-FISH) pentru gena X Slx și gena Y Sly a confirmat faptul că fibroblastele SCT și de control de pasaj 4 (P4) și-au păstrat complementele originale de cromozomi sexuali (Fig. 1B și fig. S3A). Fibroblastele au fost reprogramate în celule stem pluripotente induse (iPSC) (10) într-o manieră inductibilă cu doxiciclină (Dox). DNA-FISH a fost efectuată în iPSC-urile P2 rezultate (fig. 1A).

O proporție ridicată de linii iPSC derivate din SCT au prezentat pierderi de cromozomi sexuali. De la șoareci XXY, am observat iPSC-uri XY, XX și XO (Fig. 1, C și E). Incidența pierderii a fost similară pentru cromozomii X și Y (P = 0,062, testul Mann-Whitney). De la șoarecii XYY, am observat iPSC-uri XY și XO (Fig. 1, D și E). Pierderea cromozomului Y la masculii XYY a avut loc la o frecvență similară cu cea observată pentru cromozomul X și Y combinat la masculii XXY (P = 0,089, testul Mann-Whitney). Am comparat apoi incidența pierderii cromozomilor sexuali între iPSC-urile derivate din SCT și iPSC-urile euploide derivate din XY și XX. Pierderea cromozomilor sexuali a fost mai frecventă la iPSC-urile derivate din SCT decât la cele derivate din euploide (fig. 1E), indiferent de pragul utilizat pentru a defini pierderea cromozomilor sexuali (fig. S12D).

Pierderea cromozomilor sexuali ar putea apărea în timpul reprogramării celulelor SCT sau în timpul propagării iPSC la P2, poate conferind un avantaj proliferativ celulelor euploide rezultate. Într-adevăr, instabilitatea cromozomilor sexuali a fost observată în celulele stem pluripotente (11, 12). Pentru a testa această ultimă ipoteză, am analizat stabilitatea cromozomilor sexuali între P2 și P6 în iPSC-uri cu complemente foarte parentale (>90%) (fig. S4A). Am observat pierderea cromozomului sexual în liniile iPSC XX și XXY (P < 0,01 și, respectiv, 0,05; testul Wilcoxon signed-rank), dar nu și în liniile iPSC XY și XYY (P = 0,21 și, respectiv, 0,66; testul Wilcoxon signed-rank). Cu toate acestea, nicio linie iPSC nu a prezentat o scădere cu mai mult de 15 % a complementului parental (fig. S4B). Mai mult, pierderea cromozomilor sexuali între P2 și P6 nu a fost trisomie-biată (fig. S4B). De asemenea, iPSC-urile euploide XY derivate din SCT nu au prezentat niciun avantaj proliferativ față de iPSC-urile XXY sau XYY (fig. S5). Deoarece fibroblastele SCT au fost, de asemenea, stabile din punct de vedere cariotipic (fig. 1B și fig. S3A), pierderea cromozomilor este probabil indusă în timpul reprogramării iPSC și este astfel diferită de instabilitatea cromozomilor sexuali în celulele stem pluripotente (11, 12). Ne referim la acest fenomen ca pierdere de cromozomi cu trisomie (TCL).

Am determinat în continuare dacă iPSC-urile euploide XY derivate din fibroblastele SCT ar forma spermatozoizi funcționali. Am selectat iPSC-uri P6 P6 foarte euploide (≥80% din celule XY) adaptate la mediul fără Dox (fig. S6). Pentru experimentele noastre XYY, doar liniile iPSC XY care au păstrat cromozomul Y de tip sălbatic mai degrabă decât Yd1 au fost utilizate pentru experimentele PGCLC (fig. S7). Cariotiparea a confirmat faptul că toate liniile iPSC XY derivate din SCT și o linie iPSC XY de control au fost euploide (fig. S8). Aceste linii iPSC au fost diferențiate (6) printr-o stare asemănătoare epiblastului pentru a crea agregate PGCLC pozitive pentru BV și SC (fig. 2A). PGCLC-urile pozitive la BV (tabelul S1) au fost izolate prin sortare celulară activată prin fluorescență (FACS) (Fig. 2B) și transplantate în testicule W/Wv (mutant Kit) cu deficit de celule germinale (13).

Spermatogeneza la primitori a fost evaluată la 9-10 săptămâni după transplant. Teratoamele, care sunt observate după transplantul de PGCLC derivate din iPSC (6), au fost prezente la 29 % din liniile transplantate derivate din XXY și la 50 % din liniile transplantate derivate din XYY (fig. S9). Reconstituirea spermatogenezei, evidențiată prin prezența coloniilor spermatogene (fig. 2C) și prin histologie (fig. 2D), a fost observată pentru toate liniile iPSC derivate din XXY și XYY-derivate din XXY utilizate (tabelul 1). Astfel, iPSC-urile XY derivate din SCT se pot diferenția în celule germinale in vitro și pot finaliza spermatogeneza după transplant.

Ne-am întrebat dacă spermatozoizii creați prin transplant ar putea susține reproducerea. Injecția intracitoplasmatică de spermă (ICSI) utilizând spermă de la două linii iPSC XXY- și două linii iPSC XY derivate din XXY (Fig. 2E și fig. S10A) a generat zigoți care s-au dezvoltat în embrioni cu două celule in vitro (eficiență 76.7 până la 87,3 %) (Fig. 2F, fig. S10B și tabelul S2) și descendenți absolut normali atunci când au fost transplantați în primitori (eficiență 46,9 până la 59,4 %) (Fig. 2G, fig. S10C și tabelul S2). Genotiparea reacției de reacție în lanț a polimerazei a confirmat faptul că descendenții au fost derivați din PGCLC-urile transplantate (fig. S10D). Puii proveniți din liniile de iPSC derivate din XXY și XYY au prezentat o creștere comparabilă cu cei derivați din iPSC-uri XY de control (fig. S10E). În special, puii derivați din XXY- și XYY- au avut complemente euploide (XY sau XX) (fig. S11). Trei masculi maturi și trei femele din fiecare linie iPSC derivată din XXY- și XYY- au fost împerecheați unul cu celălalt și toți au fost fertili (fig. 2H și fig. S10F). Astfel, spermatozoizii din iPSC-uri XY derivate din SCT dau naștere la urmași cromozomial normali, sănătoși și fertili.

Am analizat dacă TCL este specifică trisomiei cromozomilor sexuali. Deoarece nu sunt disponibile modele de șoareci cu trisomie pentru un autosom complet (14), am repetat experimentele noastre la șoareci transcromosomici Tc1 masculi, un model de sindrom Down cu un cromozom uman 21 accesoriu (hChr.21) (15). Șoarecii Tc1 poartă o casetă de rezistență la neomicină inserată în hChr.21, a cărei selecție reduce mozaicismul hChr.21 (15). Prin urmare, am îmbogățit mai întâi fibroblastele adulte Tc1 pentru prezența hChr.21 cu ajutorul analogului de neomicină G418 (Fig. 3A). DNA-FISH a arătat că marea majoritate (≥96%) a fibroblastelor Tc1 au păstrat hChr.21 (Fig. 3B și fig. S3B). Aceste fibroblaste Tc1 au fost reprogramate fără selecție G418, iar iPSC-urile rezultate au fost analizate la P2. Zece din cele 16 linii iPSC care au fost generate (62,5 %) au prezentat pierderea hChr.21 în ≥10 % din celule (Fig. 3, C și D, și fig. S12D). În schimb, după eliminarea G418, hChr21 a fost reținută în fibroblastele Tc1 cultivate pentru aceeași perioadă ca cea utilizată pentru reprogramarea iPSC (18 zile) și în liniile iPSC P6 care au avut complemente foarte parentale (>90% hChr.21 pozitive) la P2 (fig. S12, A și B). Concluzionăm că pierderea hChr.21 în celulele Tc1 este promovată de reprogramare mai degrabă decât de eliminarea G418 și, prin urmare, că TCL afectează, de asemenea, un cromozom accesoriu.

Ne-am întrebat apoi dacă TCL apare în celulele umane. Au fost observate cazuri de pierdere de cromozomi în timpul culturii de celule umane trisomice (16, 17), dar prevalența și relația sa cu reprogramarea nu a fost analizată în mod sistematic. Am selectat linii de fibroblaste umane cu sindrom Klinefelter, sindrom Down și fibroblaste euploide XY și XX care prezintă un mozaicism minim (fig. S13, A și D), le-am reprogramat și am determinat complementele cromozomiale ale liniilor iPSC rezultate. Am observat iPSC-uri XY și XX din fibroblaste cu sindrom Klinefelter și iPSC-uri euploide din fibroblaste cu sindrom Down (fig. S13, B, C, F și G). Pierderea cromozomilor a fost mai frecventă în celulele trisomice decât în cele disomice, demonstrând că TCL apare, de asemenea, în timpul reprogramării umane. Cu toate acestea, frecvența liniilor iPSC foarte euploide a fost mai mică decât cea observată la iPSC-urile de șoarece derivate din trisomie (fig. S13, F până la H).

Am demonstrat că TCL produce iPSC-uri euploide de la șoareci și pacienți SCT și trisomici autosomici (fig. S12E). La șoareci, iPSC-urile „corectate” rezultate pot forma spermatozoizi funcționali, permițând producerea de descendenți euploizi din punct de vedere cromozomial de la persoane SCT infertile. TCL completează terapiile iPSC existente pentru anomalii cromozomiale (17-21). Mecanismele care cauzează TCL sunt necunoscute. Stresurile celulare asociate reprogramării pot selecta împotriva celulelor trisomice, permițând apariția celulelor euploide. Am observat TCL mai puțin frecvente în celulele umane decât în cele de șoarece (figurile S12D și S13H). Chiar dacă sunt rare, TCL ar putea oferi tratamente pentru pacienții cu SCT infertili pentru care abordările alternative nu au succes. Cu toate acestea, utilizarea clinică a celulelor germinale umane realizate in vitro ar trebui să fie atent analizată din punct de vedere etic și legal (22-24). În plus, va trebui dezvoltată o spermatogeneză completă in vitro pentru a evita riscul de formare a teratomului care apare prin transplantul de celule germinale.

TCL permite, de asemenea, producerea de iPSC-uri feminine de la bărbați, oferind potențial pentru disecția genetică a dimorfismelor sexuale (25). Prin crearea de linii iPSC izogene care diferă doar în ceea ce privește cromozomii lor sexuali, diferențele sexuale identificate în timpul modelării bolilor iPSC ar putea fi atribuite efectelor cromozomiale X sau Y.

.