Reactivi de cultură celulară

Un stoc de glicerină de Akt1 ORF uman a fost obținut ca vector pENTR221 de la GE Dharmacon (Clona Akt1 ORF uman ID 100067600). Vectorul de destinație modificat (pcDNA/FRT/TO), care conține SH Tag, a fost un cadou generos din partea Dr. Matthias Gstaiger (Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich, Zurich, Elveția). Celulele Flp-In TREx HEK293 (#R780-07), amestecul enzimatic LR Clonase II (#11791-100), vectorul pOG44 (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) și Dynabeads Protein A (#100.02D) au fost obținute de la Invitrogen. Xtremegene 9 (#06365787001) a fost achiziționat de la Roche. DMEM (#12430-054) și RPMI 1640 (#22400-089) au fost obținute de la GIBCO. Trypsina (#CC5027.010L) a fost achiziționată de la Genetics. FBS normal (#SH30070.03), precum și FBS testat Tet (#SH30070.03T) au fost achiziționate de la Hyclone. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazol (#M1404-10MG), iodura de propidiu (#P4170-250 mg) și Lys C protează (#P3428) au fost obținute de la Sigma. Etichetele SILAC au fost procurate de la Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Cocktailul de inhibitori de protează (100X) (#78429) și perlele de agaroză Pierce anti-HA (#26182) au fost obținute de la Thermo Scientific. Perlele MagStrep „Type 2HC” (#2-1612-002) au fost obținute de la IBA BioTagnology. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, India, a sintetizat peptida HA . Membrana de nitroceluloză (#RPN303E) a fost achiziționată de la GE Healthcare. Tripsina protează (#4370282) a fost procurată de la AB Sciex. Markerul de greutate moleculară a proteinelor curcubeu cu gamă completă (#RPN800E) a fost de la Amersham. siARN-urile, reactivul de transfuzie Dharmafect (#T-2001-03), apa fără RNază (#B-003000-WB-100), tamponul 5X pentru siARN (#B-002000-UB-100) au fost obținute de la Dharmacon. RNase A (#19101) a fost de la Qiagen.

Anticorpi pentru Western Blot

Anticorpii utilizați în prezentul studiu au fost: anti-HA (#SC-7392; monoclonal de șoarece, diluție 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; monoclonal de șoarece, diluție 1:1000) și anti-GAPDH (#SC-25778; policlonal de iepure, diluție 1:1000) de la Santa Cruz; anti-CDC2 (#77055; policlonal de iepure, diluție 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; policlonal de iepure, diluție 1:1000) de la Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#ab133699; iepure monoclonal, diluție 1:10000); anti-API5 (#ab56392; monoclonal de șoarece, diluție 1:1000) și anti-SH3PX1 (#EPR14399; iepure monoclonal, diluție 1:2000) de la Abcam; anticorpii secundari au fost procurați de la Licor Biosciences-Odyssey goat anti-mouse (#926-32210, diluție 1:15000) și Odyssey goat anti-rabbit (#926-32211, diluție 1:15000).

Generarea unei linii celulare stabile

În acest studiu, vectorul de intrare Akt1 compatibil cu gateway-ul (pENTR221) a fost utilizat pentru a genera un construct de expresie prin reacție de recombinare LR în prezența unui vector de destinație adecvat (pcDNA/FRT/TO). Vectorul de destinație a fost modificat pentru a include o etichetă Strep-HA (SH) care conține o peptidă de legare a streptavidinei (Strep) și o etichetă epitopică de hemaglutinină (HA). Această etichetă SH a fost utilizată în cele din urmă pentru a extrage selectiv Akt1 și partenerii săi de interacțiune din lizatele celulare complexe. Pentru a genera o linie celulară de expresie inductibilă a Akt1, construcția de expresie a fost co-transfectată cu recombinaza pOG44 în celule Flp-In TREx HEK293, exprimând în mod stabil reprimatorul Tet. Transfecția a fost facilitată de reactivul de transfecție Xtremegene 9. Celulele care exprimă construcția Akt1 au fost selectate pe o perioadă de 15-20 de zile în mediu RPMI conținând higromicină-B (75 µg/ml), suplimentat cu 10% FBS ecranat Tet. Aceste celule selectate au fost ulterior grupate pentru a se extinde în vederea experimentelor de extracție.

Concentrația Tet necesară pentru o expresie optimă a Akt1 a fost determinată prin inducerea expresiei Akt1 pe o gamă de concentrații Tet (0,1 µg/ml până la 5 µg/ml) și nivelurile de expresie a proteinei Akt1 au fost monitorizate în prezența și absența Tet folosind anticorpul anti-Akt1, precum și anticorpul anti-HA. Tet a fost suplimentat în mediile de cultură la fiecare 24 de ore pentru a susține o expresie stabilă a Akt.

ExperimentulPDT

PDT pentru celulele HEK293 a fost monitorizat în celule normale față de celulele cu supraexprimare Akt1 pe o durată de 72 de ore după administrarea inițială a Tet. Pentru fiecare punct de observație, un set paralel de 104 celule HEK293 normale și celule HEK293 cu supraexprimare Akt1 au fost însămânțate în triplicat, într-o placă cu 96 de godeuri, în 100 µl de mediu DMEM conținând 10% ser. Tet a fost suplimentat în mediul de cultură la 24 de ore după însămânțare și, după un alt interval de incubare de 24 de ore, celulele au fost recoltate ca timp 0. Ulterior, un set de celule, în cultură paralelă, a fost recoltat la fiecare 24 de ore până la 72 de ore. PDT a fost determinată prin numărarea celulelor la fiecare punct de timp prin metoda de colorare cu albastru trypan.

Etichetarea SILAC pentru a diferenția interactiomul Akt1 specific fazei de ciclu celular

Celele HEK293 care supraexprimă Akt1 au fost expandate și cultivate în medii SILAC care conțin izotopi „ușori” (K0R0), „medii” (K6R6) sau „grei” (K8R10) de lizină (K) și arginină (R) pentru cel puțin 5 dublări celulare pentru a permite încorporarea completă a etichetei. La o confluență de 70%, Tet (1 µg/ml) a fost suplimentat în mediu pentru a induce expresia Akt1. Celulele marcate cu K0R0 au fost oprite în faza G0 prin inaniție de ser peste noapte, care este o metodă utilizată pe scară largă pentru oprirea celulelor în faza G042. În acest scop, mediul de cultură complet normal a fost înlocuit cu RPMI lipsit de ser, iar celulele au fost menținute în cultură timp de 16-18 ore la 37 °C în atmosferă de 5% CO2. Celulele marcate cu K8R10 au fost oprite în faza G1/S prin cultivarea celulelor peste noapte în prezența a 5 µg/ml de afidicolin, un inhibitor reversibil al replicării ADN-ului nuclear eucariot43. În mod similar, pentru stoparea în G2, în mediul de cultură al celulelor marcate cu K6R6 s-a adăugat 400 ng/ml de nocodazol, iar incubarea a fost continuată timp de 16-18 ore înainte de a se proceda la peletizarea celulelor. Nocodazolul interferează cu polimerizarea microtubulilor, oprind astfel celulele în faza G2/M44. Celulele arestate au fost tripsinizate și numărate separat prin metoda de colorare cu albastru trypan. Celulele arestate în diferite faze ale ciclului celular au fost apoi peletizate prin centrifugare la 1500 rpm timp de 10 minute. Pentru fiecare fază a ciclului celular au fost realizate mai multe granule de celule și au fost păstrate la -80 °C, până la utilizare.

SH-tagged Affinity Purification

Același număr de celule cu supraexprimare Akt1 arestate în fazele G0, G1/S și G2 au fost amestecate în raport 1:1:1:1 și lizate la gheață timp de 1 oră în tampon IP (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1% NP-40; 1X cocktail de inhibitori de protează și 1 mM PMSF). Lysatul celular a fost curățat de resturi în urma separării prin centrifugare la 10 000 rpm timp de 15 minute la 4 °C. Complexele proteice Akt1 au fost purificate selectiv în seturi paralele prin direcționarea simultană a tag-ului Strep și HA, conform instrucțiunilor din manualele kiturilor respective. Pe scurt, complexele proteice Akt1 marcate Strep au fost amestecate cu 100 µl de perle magnetice de streptactină și menținute timp de 1 oră la incubare pe un agitator rotativ la 4 °C. Toți interactorii nespecifici au fost spălați în cinci etape consecutive de spălare cu cinci volume de tampon de spălare cu streptactină. Proteina Akt1 și interactorii săi au fost în cele din urmă eluate în două etape de eluție cu 125 µl de tampon de eluție strepctinctina pentru fiecare eluție (invitrogen). Pentru purificarea complexelor proteice Akt1 marcate cu HA, lizatele celulare curățate au fost incubate cu 50 µl de perle de agaroză HA pre-spălate timp de 2 ore la 4 °C pe un agitator rotativ. După 3 spălări rapide, cu zece volume de tampon TBS-T, complexele proteice Akt1 au fost eluate de trei ori cu 50 µl de peptidă HA (250 µg/ml). Etapele de purificare de mai sus au fost efectuate pentru trei astfel de replici biologice pentru a purifica proteina Akt1 și partenerii săi de interacțiune, iar eluații de Strep și HA pentru fiecare replică au fost grupați, liofilizați și păstrați la -80 °C până la procesarea ulterioară.

Digestia proteinelor și pregătirea probelor pentru LC-MS/MS

Toate cele trei replici biologice au fost procesate separat pentru digestia proteinelor. La proba liofilizată, s-a adăugat 40 µl de bicarbonat de amoniu 100 mM, s-a vortexat bine, urmat de adăugarea a 2 µl de tampon denaturant (AB Sciex). Probele au fost reduse cu 4 µl de reactiv de reducere (AB Sciex) timp de 1 oră la 60 °C. S-au adăugat 2 µl de reactiv de blocare a cisteinei timp de 10 minute la temperatura camerei pentru a bloca reziduurile de cisteină reduse. Digestia proteinelor a fost inițiată prin adăugarea a 5 µl de 0,1 µg/µl de endoproteinază Lys C. Probele au fost ținute la incubare timp de 4 ore într-o baie de apă la 37 °C. După o scurtă centrifugare, 1 µl de tripsină (1 µg/µl) a fost adăugat la probe și s-a continuat incubarea timp de încă 12-16 ore la 37 °C. Digestia proteinelor a fost încheiată prin adăugarea unei picături de acid formic (FA).

Eșantioanele acidificate au fost liofilizate și supuse purificării peptidelor cu ajutorul coloanelor monospin C-18. Înainte de utilizare, coloanele C-18 au fost condiționate cu metanol și apă și echilibrate în continuare cu 3% ACN în 0,1% FA. Probele liofilizate au fost dizolvate în 3% ACN în 0,1% FA și au fost încărcate pe coloanele C-18 și lăsate să se lege timp de 10 minute. Probele au fost trecute de două ori prin coloane pentru a se asigura o legare completă. După 10 spălări riguroase cu 3% ACN în 0,1% FA, peptidele digerate au fost eluate mai întâi în 40% ACN, urmate de două eluții în 60% ACN. În cele din urmă, cele trei eluate au fost grupate și liofilizate, pentru fiecare replică.

Peptidele eluate au fost redisolvate în 500 µl de 5 mM de formiat de amoniu (pH 2,5) în 30% ACN și ușor agitate în vortex. Cartușul schimbător de cationi a fost fixat și condiționat înainte de încărcarea probei. După încărcarea probei, cartușul a fost spălat de trei ori cu formiat de amoniu 5 mM (1 ml). Peptidele au fost reeluate de două ori cu 400 µl de 500 mM de formiat de amoniu (pH 2,5) în 30 % ACN pentru fiecare eluție, iar eluații au fost amestecați pentru fiecare replică de probă și liofilizați.

Proiectare experimentală de spectrometrie de masă și raționament statistic

Analiză CLM-MS/MS

Toate probele au fost analizate prin cromatografie lichidă în nano-flux pe un sistem nanoflex (Eksigent Technologies, AB Sciex) cuplat la un spectrometru de masă triplu TOF 5600 (AB Sciex; Concord, Canada). Fiecare replicat biologic a fost injectat de două ori ca replicat tehnic. Sistemul a funcționat folosind un gradient de fază binară, cu solvent A (2% ACN în 0,1% FA) și solvent B (98% ACN în 0,1% FA). Pentru o reproductibilitate optimă a administrării probei, auto-samplerul a fost operat în modul de injecție completă, supraumplând bucla de 1 µl cu 3 µl de probă. Pentru măsurătorile din fiecare injecție de probă, peptidele au fost captate pe o capcană cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) și separate pe o coloană cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) la un debit de 300 nl/minut, utilizând un gradient liniar: 5-60% solvent B în 80 de minute, 60-90% timp de 2 minute. Coloana a fost regenerată prin spălare cu 90% solvent B timp de 6 minute și reechilibrată cu 5% solvent B timp de 22 minute.

Spectrometrul de masă a fost cuplat la o sursă de ioni Nano Spray (AB Sciex), controlată de software-ul Analyst (v.1.6). Sursa de ioni a fost echipată cu un emițător PicoTip de electrospray SilicaTip de 10 μm (AB Sciex), iar peptidele eluate au fost monitorizate prin următorii parametri ai sursei de ioni: IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, gaz de perdea = 25. Spectrometrul de masă a fost operat în modul de achiziție dependentă de informații (IDA) top10 și în modul de sensibilitate ridicată, cu un timp de acumulare de 500 și 200 ms pentru scanările MS1 și, respectiv, MS2, și o excludere dinamică de 12 s, rezultând un ciclu de funcționare total de ~2,55 s. Analiza spectrometrului de masă a fost efectuată utilizând scanări de studiu TOF-MS1 și MS2 cuprinse între 350-1250 și, respectiv, 140-1600 m/z. Energia de coliziune de rostogolire a fost controlată automat de scriptul IDA privind parametrii energiei de coliziune de rostogolire. Criteriile de selecție pentru ionul părinte care urmează să fie fragmentat au inclus intensitatea – unde ionii trebuiau să fie mai mari de 150 cps, toleranța de masă de 50mDa, cu o stare de încărcare de la +2 la +5. O calibrare automată a spectrelor a fost realizată după achiziția fiecărei 2 probe folosind LC-MS dinamic și achiziții MS/MS de 25fmol β-galactosidază.

Procesarea și analiza datelor

Achiziția MS-MS a Akt1 și a partenerilor săi proteici care interacționează a fost mediată în 3 faze diferite ale ciclului celular, și anume G0, G1/S și faza G2. Celulele marcate SILAC reprezentând fiecare fază au fost grupate în trei seturi separate și sondate ca replici biologice. Achiziția fiecărei replici biologice a generat 2 fișiere wiff și 2 fișiere wiff.scan, reprezentând replicile sale tehnice. Fișierele wiff au fost din nou grupate pentru fiecare replică biologică înainte de a efectua căutări în baza de date UniProtKB/SwissProt Human (versiune aprilie 2015) utilizând software-ul protein pilot, versiunea 4.5 (nr. de revizuire 1656). Baza de date de referință a constat din 20.204 intrări de proteine în versiunea specificată. Căutarea protein pilot s-a bazat pe algoritmul paragon, o parte a statisticilor implicite ale software-ului. Următoarele setări au fost utilizate pentru căutările paragon – (a) Specia ca Homo sapiens, (b) Lys C și Trypsin ca categorii de enzime pentru diferite execuții, (c) Maximum de clivaje ratate = 2, (d) Modificări fixe ca etichete SILAC-K6R6 și K8R10; alchilarea cisteinei prin metilmetiosulfonat de metil (MMTS), (e) Modificări variabile ca oxidare la metionină, care este o opțiune implicită în pilotul de proteine, (f) Identificare, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) și SILAC (Lys + 8, Arg + 10) ca tipuri de probe, și (g) parametrul „Search Effort” (Efort de căutare) „Thorough ID” (Identificare amănunțită), care ne oferă o căutare amplă a diferitelor modificări ale proteinelor, (h) Toleranța de masă pentru ionii precursori și de fragment a fost 0.05 și, respectiv, 0,1 Da,. Pentru fiecare replică biologică pentru fiecare etichetă SILAC au fost generate fișiere digerate Lys C și Trypsin. Următorii parametri au fost folosiți pentru a filtra datele în vederea obținerii unui set de date de încredere pentru analiza ulterioară – (a) S-a aplicat algoritmul de corecție automată a biasului pentru raportul heavy to light. Acesta corectează amestecul inegal în timpul combinării diferitelor eșantioane etichetate într-un singur experiment și elimină orice prejudecată experimentală sau sistematică. Factorul de părtinire automată crește acuratețea cuantificării prin normalizarea variațiilor în cantitățile inițiale de proteine45, (b) Au fost reținute proteinele cu o rată globală de descoperire falsă (FDR) de 1 % din potrivire (G-FDR-fit). Analiza FDR a fost efectuată cu ajutorul software-ului Proteomics Performance Evaluation Pipeline (PSPEP) care este instalat cu software-ul protein pilot; (c) Pragul minim de încredere al proteinelor a fost setat la 95%; (d) Identificarea a cel puțin o peptidă unică cu un nivel de încredere de 95% în toate cele trei replici.

Listele de proteine dobândite după digestia Lys C și tripsină au fost grupate pentru fiecare replică biologică. Rapoartele de cuantificare între proteinele marcate SILAC medii și grele în raport cu omologii lor mai ușori au fost mediate. Ulterior, am obținut trei liste de proteine pentru fiecare etichetă SILAC – K0R0, K6R6 și K8R10. Aceasta a fost urmată de pregătirea unei liste de uniune a proteinelor identificate; estimarea cantitativă a fost realizată manual prin fuzionarea fișierelor din trei replici biologice pentru fiecare condiție SILAC. Proteinele care au fost identificate în toate cele trei seturi de replici au fost reținute pentru analiza ulterioară și s-au calculat ratele cantitative între etichetele medii și grele în raport cu etichetele ușoare pentru aceste proteine. S-a pregătit apoi un fișier combinat final pentru K0R0 (faza G0), K6R6 (faza G2) și K8R10 (faza G1/S). O proteină s-a calificat pentru a fi inclusă în lista finală a interactorilor Akt1 numai dacă a fost identificată în toate cele 3 seturi de replici pentru oricare dintre fazele ciclului celular. Proteinele care au fost identificate, dar nu au fost cuantificate în toate cele trei replici, au primit o valoare de cuantificare de 0,01 (minimă) sau 100 (maximă) după ce au fost introduse în raporturile SILAC peptidice.

Pentru a curăța lista interactorilor Akt1 și mai mult de orice interacțiuni nespecifice cu matricea de afinitate sau cu eticheta în sine, GFP marcată SH a fost supraexprimată în celule HEK293. Partenerii de interacțiune ai proteinei GFP au fost eluzionați selectiv așa cum s-a descris pentru complexele proteice Akt1. Proteinele care s-au suprapus cu interactomul specific fazei de ciclu celular Akt1 au fost eliminate din lista interactorilor Akt1 ca proteine nespecifice. Acest lucru ne-a oferit în cele din urmă un set de date de încredere pentru partenerii de interacțiune pentru Akt1. Un rezumat al informațiilor privind proteinele care interacționează cu Akt1 și estimările de cuantificare a acestora este furnizat în Tabelul suplimentar 3. Împărțirea lor cu cea a raportului Akt1 în faza respectivă a normalizat ratele cantitative pentru toți interactorii Akt1. Acest lucru a permis uniformizarea Akt1 ca fiind 1 în fazele G0, G1/S și G2.

Electroforeză pe gel de poliacrilamidă și Western blotting

Din lista interactorilor Akt1 identificați, CDK1, CCNB1, BUB3, API5 și SH3PX1 au fost selectați aleatoriu pentru a valida asocierea lor cu Akt1 prin Western blotting. Peletele de celule care exprimă Akt1 asincronizat au fost lizate în tampon IP și supuse purificării prin afinitate, vizând tag-ul SH, așa cum s-a descris anterior. Eluații au fost grupați și diluați în soluție tampon de eșantionare SDS 1X, au fost încălziți timp de 10 minute și au fost rezolvați pe SDS-PAGE 10%. Benzile de proteine au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză, iar aceasta din urmă a fost blocată cu ajutorul unui tampon de blocare odyssey 1:1: PBS timp de o oră la temperatura camerei. Apoi, membrana a fost tăiată pentru a permite ca proteinele de dimensiuni diferite să fie sondate cu anticorpii primari respectivi pentru a fi validate împreună cu anticorpul anti-HA. Diluția anticorpilor primari a fost făcută în tampon odyssey: PBST și s-a incubat peste noapte la 4 °C pe un agitator. După o spălare temeinică, blocurile au fost expuse la anticorpii secundari anti-șoarece sau anti-rabbit marcați cu IR la o diluție de 1:15000; diluați în tampon odyssey: PBST. Benzile au fost detectate cu ajutorul scanerului cu infraroșu odyssey.

Coimunoprecipitarea inversă a fost, de asemenea, efectuată cu ajutorul proteinei A Dynabeads. Interactorii Akt1 detectați anterior au fost utilizați ca proteine momeală, iar Akt1 a fost testat ca partener de interacțiune al acestora cu ajutorul anticorpului anti-Akt1. Anticorpii împotriva interactorilor Akt1 selectați au fost amestecați cu 50 µl de dynabeads în tuburi separate la o concentrație de 1:20-1:70; diluați în 200 µl PBST. Amestecurile bila-anticorp au fost păstrate pentru incubare la temperatura camerei timp de 10 minute. Complexele bila-anticorp au fost peletizate cu ajutorul unui separator magnetic și resuspendate în 200 µl PBST pentru spălare. Ulterior, în fiecare tub s-au adăugat 250 µl de lizat și s-au păstrat pentru incubare la 4 °C timp de 2 ore pe un agitator rotativ. Sferele, împreună cu complexele anticorp-antigen respective, au fost din nou aglomerate și spălate de trei ori cu 200 µl PBST, pentru fiecare spălare. Apoi, bilele au fost fierte în 50 µl de tampon de probă SDS 1X timp de 10 minute și apoi răcite. Supernatantul a fost încărcat pe SDS-PAGE 10% și probat prin Western blotting. Anticorpul anti-Akt1 a fost utilizat pentru a cerceta Akt1 în eluția lui API5, CCNB1, CDK1, BUB3 și SH3PX1.

Clasificare GO

Classele GO care descriu funcția fiecărui interactor Akt1 au fost determinate din bazele de date UniProt (http://www.uniprot.org/) și EnrichR (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). După o curatorie manuală extensivă, interactorii Akt1 identificați au fost segregate în 3 clase funcționale majore, și anume: proliferare și supraviețuire; metabolism; și sinteză proteică. Restul au fost reprezentați ca o clasă comună numită „altele”, care a inclus proteine cu funcții precum transportul, hematopoezia etc.

Gene Knockdown using siRNA

Standardizare

Pentru a determina concentrația optimă de siRNA pentru transfecție, 1,2 × 105 celule HEK293 au fost însămânțate într-o placă cu 12 puțuri. siRNA împotriva PLK1 a fost utilizat ca un control pozitiv în toate testele de knockdown. O gamă de concentrații de siARN de la 10 nM la 50 nM a fost transfectată cu ajutorul reactivului de transfecție dharmafect, în conformitate cu protocolul furnizorului. Modificările nivelurilor de expresie a proteinelor au fost monitorizate prin Western blotting la 24 de ore, 48 de ore și, respectiv, 72 de ore (figura suplimentară 2). Alte câteva ținte (SH3PX1, AKT1, CCNB1 și SLC25A5) au fost eliminate și efectul eliminării a fost determinat prin Western blotting. GAPDH a fost utilizat ca martor de încărcare.

Dezactivarea proteinelor țintă

Proteinele care prezintă o asociere perturbată cu Akt1 în timp ce celula a progresat de la faza G0 la faza G1/S a ciclului celular au fost dezactivate individual în celulele HEK293 și investigate prin FACS. Fiecare siARN a fost resuspendat în 1x tampon siARN pentru a obține o concentrație stoc de 20 µM. Transfecția a fost mediată în triplicat la 24 de ore după însămânțarea celulelor; împreună cu controalele pozitive și negative corespunzătoare. Fiecare siARN a fost diluat la o concentrație de lucru de 25 nM în RPMI pentru a obține un volum final de 50 µl și a fost păstrat la temperatura camerei pentru 5 minute de incubare. De asemenea, reactivul de transfecție a fost, de asemenea, diluat în RPMI pentru a obține un volum de 50 µl și păstrat pentru incubare în condiții similare. Atât siRNA, cât și reactivul de transfecție au fost amestecate ușor pentru a forma complexe și au continuat incubarea timp de încă 20 de minute la temperatura camerei. Volumul final a fost completat până la 500 µl cu mediu care conține 10% ser. Aceste complexe au fost apoi adăugate ușor pe celule și s-a continuat incubarea la 37 °C. Mediile de cultură celulară au fost înlocuite cu medii proaspete cu 10% după 24 de ore. În cele din urmă, la 48 de ore de la transfecție, eficiența transfecției a fost determinată prin monitorizarea siGLO la microscopul inversat Nikon Ti.

Achiziție și analiză FACS

La 48 de ore după transfecție, celulele au fost centrifugate scurt și mediul a fost aspirat. Celulele au fost colorate cu 300 µl de soluție de iodură de propidiu care conține 0,1 mg/ml de iodură de propidiu (Sigma), 3 µl/ml de Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml de citrat de sodiu (Sigma) și 20 µg/ml de RNază (Sigma) timp de 30 de minute la 4 °C. Celulele colorate au fost transferate imediat în tuburi BD FACS și achiziționate în BD FACS Canto.

Datele obținute au fost analizate cu ajutorul software-ului FlowJo. Histogramele ADN au fost analizate pentru a cuantifica populațiile sub G0, G0/G1, S și G2/M. Au fost observate schimbări minore în populațiile G0/G1 și G2/M și, prin urmare, a fost efectuată o gating manuală pentru a analiza aceste populații.

Calcularea DPT și RT

PDT și RT în fazele G1, S și G2 ale ciclului celular au fost calculate în urma eliminării prin siRNA a setului de proteine care prezintă o asociere perturbată cu Akt1 în faza G1/S. PDT pentru cele 23 de gene, împreună cu controalele, a fost monitorizată în celulele HEK293 pe o durată de 72 de ore. Pe scurt, 10 000 de celule au fost însămânțate într-o placă cu 96 de godeuri, în 100 µl de mediu RPMI cu 10% ser. transfecția cu siARN a fost mediată a doua zi, în triplu exemplar, pentru fiecare proteină țintă și a fost considerată ca punct de timp 0 oră. Numărul de celule a fost determinat pentru celulele HEK293 netratate prin metoda de colorare cu albastru trypan. După 24 de ore, mediul de cultură celular care conținea complexe siARN a fost înlocuit cu RPMI proaspăt care conținea 10% ser. Ulterior, celulele au fost numărate pentru fiecare dintre celulele transfectate cu siARN pentru a reprezenta punctul de timp de 24 de ore. Ulterior, un set de celule, care au fost cultivate în paralel, au fost recoltate și numărate la 48 de ore și, respectiv, la 72 de ore.

După ce PDT a fost determinată pentru tot setul de gene perturbate vizate, RT (în ore) pentru fiecare a fost calculată pentru faza G1, S și G2, după cum urmează:

where; % din populația de celule a fost determinată prin achiziție FACS.

Date disponibile

Datele de spectrometrie de masă au fost depuse ca set de date „Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.” la ProteomeXchange prin intermediul bazei de date PRIDE. Acesta este disponibil publicului prin intermediul ProteomeXchange cu identificatorul ProteomeXchange: PXD005557. Setul de date este format din 12 fișiere brute (wiff și wiff.scan) și 18 fișiere pilot de proteine asociate.

.